Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1 Биологические особенности нутрий 14
1.2 Эпизоотологические особенности опасных инфекционных болезней нутрий 26
1.2.1 Эпизоотологическая характеристика стрептококкоза пушных зверей... 27
1.2.2 Эпизоотологическая характеристика колибактериоза пушных зверей..34
1.2.3 Эпизоотологическая характеристика сальмонеллеза пушных зверей...43
1.3 Лечение стрептококкоза, колибактериоза и сальмонеллеза пушных зверей 52
1.4 Биотехнология корпускулярных инактивированных вакцин для профилактики инфекционных болезней пушных зверей 60
1.4.1 Подбор производственных штаммов, питательной среды для выращивания микроорганизмов и получение посевного материала 62
1.4.2 Культивирование микроорганизмов и получение биологического сырья 66
1.4.3 Инактивирование, концентрирование и стандартизация бактериального сырья 67
1.4.4 Депонирование биосырья адъювантом, фасовка и контроль вакцины 70
1.4.5 Моно- и ассоциированные вакцины против инфекционных болезней пушных зверей 75
2. Материалы и методы исследований 82
2.1 Материалы 82
2.2. Методы исследований 84
3. Результаты собственных исследований 93
3.1 Эпизоотическая обстановка по инфекционным болезням нутрий в Краснодарском крае 93
3.2 Разработка технологии изготовления и контроля инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий 104
3.2.1 Разработка технологии получения и оценка качества сырья для изготовления инактивированных вакцин 104
3.2.2 Изучение кинетики инактивации возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий 106
3.3 Изучение иммунобиологических свойств моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях 119
3.3.1 Изучение иммунобиологических свойств и разработка методов контроля вакцины против колибактериоза нутрий 119
3.3.2 Изучение иммунобиологических свойств и разработка методов контроля вакцины против сальмонеллеза нутрий 123
3.3.3. Изучение иммунобиологических свойств и разработка методов контроля вакцины против стрептококкоза нутрий 127
3.3.4 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях 132
3.3.5 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях 140
3.3.6 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против колибактериоза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях 145
3.3.7 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях 149
3.3.7.1 Изучение иммунобиологической реактивности организма нутрий до и после вакцинации 156
3.3.7.1.1 Динамика морфобиохимических показателей нутрий 158
3.3.7.1.2 Динамика формирования клеточного звена иммунитета нутрий... 167
5 3.3.7.1.3 Динамика формирования гуморального звена иммунитета нутрий 180
3.3.7.2 Разработка методов контроля ассоциированной вакцины
против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий... 188
3.3.7.3 Производственные испытания ассоциированной вакцины
против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий...193
3.4 Изучение антибактериальных препаратов при лечении ассоциативной инфекции колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий 198
3.5 Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий 202
3.5.1 Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации колибактерноза нутрий 202
3.5.2 Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации сальмонеллеза нутрий 207
3.5.3 Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий 211
3.6 Экономическая эффективность результатов исследований 215
3.6.1 Экономическая эффективность использования ассоциированной вакцины против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий 215
3.6.2 Экономическая эффективность лечебных мероприятий при ассоциативной инфекции колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококккоза нутрий 222
4. Обсуждение результатов исследований 228
5. Выводы 253
6. Предложения производству 255
7. Список использованной литературы
- Эпизоотологическая характеристика стрептококкоза пушных зверей...
- Разработка технологии изготовления и контроля инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий
- Изучение иммунобиологических свойств и разработка методов контроля вакцины против сальмонеллеза нутрий
- Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации сальмонеллеза нутрий
Введение к работе
Актуальность проблемы. По производству пушнины Россия традиционно является одним из мировых лидеров. Значительную часть дохода этой отрасли приносят нутрии.
Нутриеводство - перспективная отрасль пушного звероводства. От нутрий получают вкусное диетическое мясо, ценные шкурки различных расцветок [В.Г. Кузнецов, 1993; В.Ф. Кладовщиков, 2002; Н.А. Балакирев, 2006].
Разведением нутрий занимаются государственные, фермерские хозяйства и нутриеводы-любители в различных климатических зонах [Н.А. Балакирев, 2002; Г.А. Кузнецов, 2003; И.А. Плотников, 2003].
Стабильному развитию нутриеводства препятствуют инфекционные болезни: колибактериоз, сальмонеллез и стрептококкоз. Они регистрируются во всех развитых странах мира, в том числе и в России, и наносят значительный экономический ущерб отрасли [В.А. Есепенок и соавт., 1997; А.Н.Панин и соавт., 1997; П.А. Емельяненко, 2000; В.Ф. Косее, 2001; В.И. Терехов, 2005; В. Kohler et al., 1988; A. Thern, 1998].
Следует отметить также, что колибактериоз, сальмонеллез и стрептококкоз имеют эпидемиологическое значение. Роль эшерихий, сальмонелл и стрептококков в инфекционной патологии животных и человека ежегодно возрастает [Н.И. Брико, 2000; Е.С. Вылегжанина, 2001; Н.М. Колычев, 2006].
Как показывает мировой опыт, во многих случаях одним из основных средств специфической профилактики инфекционных болезней животных является вакцинация. Выпускаемые в России поливалентная вакцина против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей [С.Я. Любашенко, 1963], против стрептококкоза и пастереллеза нутрий [В.А. Есепенок и соавт., 1997] содержат в своем составе определенные штаммы возбудителей. Антигенный состав биопрепаратов был предложен в 60-90 гг. XX столетия и до сих пор не пересматривался. Проводимый мониторинг не учитывает серотиповую циркуляцию штаммов возбудителей инфекционных болезней. Выпускаемые био-фабриками вакцины не соответствуют антигенному профилю эшерихий, сальмонелл, стрептококков и не обеспечивают надежной защиты от них нутрий.
В последние годы в нутриеводческих хозяйствах широкое распространение получило ассоциативное течение колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза, а также пастереллеза, стафилококкоза в различных сочетаниях [Р.А. Кадымов, 1998; В.И.Терехов, 1999; Л.П.Миронова, 1999, 2000, 2001; Н.В. Броварец, 2003; Н. Треглазов, Л.А. Малышева, 2003].
В связи с этим большое значение придается применению ассоциированных вакцин, преимущество которых заключается в создании иммунитета сразу к нескольким болезням одновременно при отсутствии у животных иммунодепрес-сивных процессов, повышении производительности труда и снижении процента травмирования и осложнений при отлове и фиксации животных [Р.А. Кадымов и соавт., 1990; И. А. Домский, 2002; В.А. Есепенок и соавт., 2005,2006].
Для защиты нутрий от ассоциативных инфекций колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза в России ассоциированные вакцины не разработаны. Изучение возможности их конструирования и применения с целью иммунизации пушных зверей представляет большой научный и практический интерес. Проведение таких исследований может решить проблему надежной профилактики данных заболеваний у восприимчивых растительноядных.
Учитывая сложную эпизоотическую обстановку, обусловленную совместным действием различных возбудителей, разработка новых ассоциированных вакцин является одним из важнейших современных направлений в области инфекционной патологии животных.
Серогрупповой состав стрептококков, эшерихий, сальмонелл многочислен и склонен к быстрым изменениям набора и количества. В такой ситуации методы специфической профилактики должны основываться на применении ассоциированных вакцин, содержащих сероварианты возбудителей, которые выделяются от больных и павших животных в эпизоотическом очаге. Биопрепараты из местных штаммов возбудителей болезней обладают более высокими антигенными и иммуногенными свойствами и способствуют созданию имму-нитета достаточной напряженности [A.M. Ахмедов, 1983; В.И. Вачугов, 1989; Р.А. Кадымов и соавт., 1990; Р.Т. Маннапова, 1998; Н.Н. Шульга, 2006].
Исследований по включению в состав ассоциированных вакцин антигенов колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий согласно выделенному серотиповому составу не проводилось. Разработка таких вакцинных ассоциаций для профилактики данных заболеваний целесообразна в теоретическом и практическом отношениях. ^ Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка комплекса мероприятий для специфической профилактики ассоциативных инфекционных болезней нутрий - колибактерноза, сальмонеллеза, стрептококкоза - и их лечения.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: - изучить эпизоотическую обстановку по инфекционным болезням нутрий и определить серологический профиль возбудителей; - разработать технологии изготовления, нормативно-техническую документацию по изготовлению н контролю инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - изучить иммунобиологические свойства новых моно- и ассоциированных вакцин против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях; - изучить иммунобиологическую реактивность организма нутрий до и после применения ассоциированной вакцины против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - изучить эффективность новых ассоциированных вакцин против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях; - изучить лечебное действие антибактериальных препаратов при ассоциативной инфекции колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - разработать систему профилактических и лечебных мероприятий по колибактериозу, сальмонеллезу и стрептококкозу нутрий.
Научная новизна. Впервые изучена эпизоотическая обстановка по инфекционным болезням нутрий и определен серологический профиль возбудителей.
Впервые разработаны технологии изготовления новых инактивированных моновакцин против колибактерноза, сальмонеллеза и ассоциированных вакцин против сальмонеллеза и стрептококкоза; колибактерноза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактерноза; колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.
Отработана кинетика инактивации возбудителей колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза на основе совместного действия инактивантов разной физико-химической природы, которые позволяют в несколько раз уменьшить количество формалина, вводимого в бактериальную культуру, и в 4 раза сократить время инактивации микроорганизмов по сравнению с традиционными технологиями.
В результате исследований определены оптимальные соотношения антигенов и адъюванта, входящих в состав новых инактивированных ассоциированных вакцин против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, а также дозы и схемы введения биопрепаратов. Установлена безвредность, слабая реактогенность и высокая иммуногенность новых инактивированных моно-и ассоциированных вакцин при их применении на нутриях.
Впервые изучена динамика морфобиохимических показателей и формирование клеточного и гуморального звеньев иммунитета у нутрий до и после применения ассоциированной вакцины против колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза.
Установлено, что применение инактивированных ассоциированных вакцин позволяет обеспечить не менее чем 80%-ную защиту нутрий от возбудителей колибактерноза, сальмонеллеза и стрептококкоза, сократить количество вакцинаций в 2-3 раза и при этом создать иммунное поголовье в ко-роткие сроки, повысить производительность труда зооветспециалистов и обслуживающего персонала, уменьшить в два-три раза затраты на проведение противоэпизоотических мероприятий против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.
Разработана и внедрена в ветеринарную практику система мероприятий по профилактике и ликвидации инфекционных заболеваний колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий. Установлено высокое лечебное действие отечественного антибактериального препарата абактан при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.
Научная новизна работы подтверждена и защищена 10 патентами РФ на изобретение.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована и практически подтверждена необходимость защиты нутрий от инфекционных болезней моно- и ассоциированными вакцинами, изготовленными из местных штаммов возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий. Разработаны и предложены для внедрения в производство новые инактивированные моновакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и ассоциированные вакцины против сальмонеллеза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактериоза; колибактериоза и стрептококкоза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, а также технологии изготовления этих вакцин.
Выявлен характер изменений неспецифического и специфического звеньев иммунитета, проявляющихся после иммунизации нутрий ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза.
Установлено, что в формировании специфической защиты нутрий ведущая роль принадлежит В-лимфоцитам, у-глобулинам, иммуноглобулинам IgA, IgM, IgG. Выявленные закономерности клеточной реакции фагоцитов полностью соответствуют активации уровня гуморального звена иммунитета у нутрий и существенно дополняют характеристику специфического иммунного ответа.
Разработана и утверждена в установленном порядке нормативнотехническая документация (регламент по изготовлению и контролю, технические условия, временные наставления по применению моно- и ассоциированных вакцин против колнбактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий).
Производство разных вариантов новых инактивированных вакцин против колнбактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий освоено в ФГУ «Краснодарская биофабрика» и в ФГУ «Армавирская биофабрика». Изготовлено более 250 тыс. доз биопрепаратов, которые были испытаны с положительными результатами в производственных условиях.
На основании теоретических, экспериментальных и производственных исследований разработана и внедрена в ветеринарную практику система мероприятий по профилактике и ликвидации инфекционных заболеваний колнбактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, включающая изучение эпизоотической обстановки хозяйства, выделение возбудителей, конструирование инактивированных вакцин, их контроль и применение. Разработана и предложена схема лечения ассоциативной инфекции колнбактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.
Материалы исследований включены в утвержденные рекомендации по профилактике и ликвидации колнбактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, изложены в монографии «Нутрии», в учебном пособии «Биологические особенности и болезни нутрий», утвержденном МСХ РФ (№ 27-2-13/3912 от 12.01.2004 г.), защищены патентами на изобретение, используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по дисциплинам: «Болезни пушных зверей», «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных».
Результаты исследований подтверждены актами внедрения.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательской тематики Кубанского государственного аграрного университета, государственный регистрационный №01200113464 «Разработка и совершенствование специфической профилактики инфекционных болезней животных»; по проекту № 03-04-96554 гранта совместных конкурсов РФФИ и администрации Краснодарского края «Теоретическое и экспериментальное моделирование профилактики инфекционных болезней у нутрий в Краснодарском крае»; по проекту № 06-04-96772 гранта совместных конкурсов РФФИ и администрации Краснодарского края «Юг России» «Теоретическое и экспериментальное моделирование эпизоотологической и экологической безопасности выращивания нутрий».
Апробация результатов исследований. Основные положения и результаты диссертации доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях (Покров, 2002, 2003; Троицк, 2005; Ростов-на-Дону, 2007); на Всероссийской конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края (Краснодар, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007); на региональных научно-практических конференциях (Омск, 2004; Краснодар, 2004-2008); на II Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Донской ГАУ (пос. Перснановка, 2004); на научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 2002); на заседаниях ученого совета Кубанского государственного аграрного университета (2001-2008).
Основные положения, выносимые на защиту: - результаты изучения эпизоотической обстановки по инфекционным болезням нутрий и определения серологического профиля возбудителей; - результаты разработки технологий изготовления и методов контроля инактивнрованпых моно- и ассоциированных вакцин против колибактерпоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - результаты изучения иммунобиологических свойств и эффективности новых инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактерпоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях; - результаты изучения иммунобиологической реактивности организма нутрий до и после прививки ассоциированной вакциной против колибактерпоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - результаты изучения эффективности антибактериальных препаратов при ассоциативной инфекции колибактерпоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; - результаты разработки системы профилактических и лечебных мероприятий по колибактериозу, сальмонеллезу и стрептококкозу нутрий.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 302 листах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, предложения производству, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 46 таблицами, 35 рисунками, 6 фотографиями. Список литературы включает 480 источников, в том числе 101 работа зарубежных авторов.
Эпизоотологическая характеристика стрептококкоза пушных зверей...
Согласно зоологической классификации нутрия относится к классу млекопитающих, отряду грызунов, подотряду парнорезцовых, семейству нутриевых, единственному в семействе роду нутрий и виду Myocastor coipus Molina.
Латинское название вида дано в 1782 г. чилийским натуралистом Иоханом Молиной. У этого зверя есть и другие названия: болотный бобер, бобровидная крыса, рагондин. На ее родине, в Южной Америке, индейцы назвали ее «коипу», а нутрией - «выдрой» окрестили ее испанские завоеватели [В.А. Берестов, 2002].
Жизнь нутрии связана с медленно текущими или стоячими пресными и солеными водоемами. Идеальным местом для жизни этого зверя оказалась дельта реки Миссисипи на побережье Мексиканского залива (штат Луизиана, США), куда нутрию завезли в начале XX века. Уже через 20 лет после заселения поголовье нутрий в штате превысило 1 млн. В настоящее время 96% шкурок, поступающих на рынок США, добывается в Луизиане.
Сначала местные жители в Южной Америке, Уругвае, Парагвае, Аргентине, Чили, Бразилии добывали нутрий в значительных количествах из-за их вкусного мяса. Лишь спустя много лет был проявлен интерес и к меху. Усиленный промысел нанес большой урон численности этих зверьков, и уже с 30-х годов XX века их клеточным разведением занялись во многих странах: Канаде, Англии, Италии, Франции и Германии [Г.А. Кузнецов, Е.Г. Сергеева, О.И. Федоров, 2003].
В Советский Союз нутрии были завезены в 1930 г. На базе этого поголовья были созданы крупные фермы в Азербайджане - совхоз «Караязский» и в Краснодарском крае - племзверосовхоз «Северинский», который и сего 15 дня имеет статус регионального племенного репродуктора [В.Ф. Кладовщиков, В.А. Александров, 2002].
В настоящее время в России нутрий разводят в коллективных, фермерских хозяйствах и нутриеводы-любители в самых различных климатических зонах - от полупустынных регионов до холодных просторов Сибири [Н.А. Цепкова, В.А.Карпухин, 1991; В.Г. Кузнецов, 1993; Н.А.Балакирев, В.Ф. Кладовщиков, 2002; Н.А. Балакирев, 2006].
Большой вклад в изучение нутрий как биологического вида внесли выдающиеся ученые-звероводы России НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева: В.Н. Александров, В.А. Афанасьев, А.А. Берестов, В.А. Берестов, Е.Д. Ильина, В.Ф. Кладовщиков, Г.А. Кузнецов, Н.Ш. Перельдик, Н.А. Цепкова. С учетом достижений авторских коллективов и результатов собственных исследований далее излагается материал по биологическим особенностям нутрий.
Нутрия - крупное млекопитающее, ведущее полуводный образ жизни. Взрослые звери весят 5-7 кг, а хорошо упитанные животные достигают 10 кг и более. Самцы несколько крупнее самок. В естественных условиях нутрии живут парами, но самец практически не проявляет заботы о потомстве.
Тело нутрии мускулистое, с короткой шеей, которая постепенно переходит в туловище. Хвост длинный, округлой формы и покрыт мелкими темно-серыми чешуйками и редкими грубыми и длинными волосами. Хвост при движении по суше тянется за животным по поверхности земли, а при плавании служит рулем. Ушные раковины небольшие и покрыты волосом, задерживающим воздух и не пропускающим воду в слуховые проходы. На верхней губе растут длинные усы, выполняющие роль органов осязания. Длина туловища взрослого зверька колеблется от 50 до 60 см, а хвоста - от 30 до 40 см. Глаза находятся на уровне лба, обеспечивая животному в воде хороший обзор. В дневное время зрение и обоняние развиты несколько хуже, чем слуховое восприятие. Однако с наступлением темноты зрение существенно обостряется, чему способствуют особенности строения глаз. Именно поэтому на воле нутрии ведут сумеречный и ночной образ жизни. И при клеточном содержании активность нутрий значительно повышается в ночное время, даже если в помещении горит освещение, что можно связать с особенностями биоритмов у этих животных и необходимо учитывать при их разведении. Нутрия прекрасно слышит и при малейшей опасности старается спрятаться, передвигаясь быстро и скачками. Однако интенсивное передвижение по суше быстро утомляет животное.
Физиологические параметры организма нутрий: температура тела -36,5-38,5С; пульс - 65-85 ударов в минуту; частота дыхания - 45-60 в мин.
Благоприятная температура окружающей среды для нутрий - 15-20С. При наличии воды для купания и затенении клеток нутрии легко переносят более высокую температуру. В сильную жару возможны тепловые удары. Холод угнетает животное.
Передние лапы у нутрии короче задних, имеют короткие, острые и загнутые когти на каждом из пяти пальцев. Эти конечности при передвижении в воде особой роли практически не играют. Передними лапами зверьки легко берут корм, подносят его ко рту, ими же они расчесывают, чистят и смазывают свой волосяной покров после купания. У нутрий в соединительной ткани под анусом имеется анальная железа, выделяющая в анальное отверстие выработанный ею особый маслянистый секрет. Зверьки им постоянно смазывают свой мех, придавая ему водоотталкивающие свойства. Эта железа особенно развита у самцов. Можно предположить, что секрет железы является еще и средством мечения территории, занятой зверьками.
Более мощные задние ноги имеют по четыре пальца, которые соединены плавательными перепонками, тогда как пятый палец свободен от нее. На каждом пальце есть и более развитые когти. Ступни ног у зверьков голые.
Всего у нутрии 20 зубов, из которых 16 коренные. Каждая челюсть вооружена двумя мощными, выдвинутыми вперед, ярко-оранжевыми резцами. У старых и молодых зверей они окрашены менее интенсивно. Бледные резцы или с пятнами свидетельствуют об ослабленности организма или его болезни. Резцы растут в течение всей жизни нутрии по мере их стачивания, которое вызывается трением их друг о друга. При отсутствии грубых кормов резцы могут израстаться, и тогда животное стачивает их об углы столбов, клеток и другие твердые предметы. Трущиеся поверхности коренных зубов хорошо приспособлены к измельчению и перетиранию пищи, а резцы - к ее срезанию и откусыванию. Нижняя губа так обхватывает резцы, что позволяет зверьку под водой срезать корневища водных растений без попадания воды в ротовую полость. Ноздри при нырянии закрываются специальными запира тельными мускулами.
Разработка технологии изготовления и контроля инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий
Нами были изучены биологические свойства наиболее часто выделяемых сероваров 385 различных бактериальных культур, и на основании проведенных исследований по антигенности, иммуногенности, стабильности подобраны штаммы Е. coli 01, S. typhimurium, Str. pneumoniae для изготовления биопрепаратов. Накопление микробных клеток (м.к./см3) изучали на обогащенных питательных средах: Эндо, Левина, селенитовой, желчном, мясо-пептонном и глюкозо-сывороточном бульонах. Оно составило от 10 до 20 млрд м.к./см3. Для получения бактериального сырья для производства вакцин нами был взят как наиболее доступный и дешевый мясо-пептонный бульон, обогащенный глюкозой, который позволяет получать необходимую концентрацию микробных клеток.
Для изготовления опытных образцов инактивированных вакцин вирулентные штаммы колибактериоза (Е. coli 01), сальмонеллеза (S. typhimurium), стрептококкоза (Str. pneumoniae) освежали в пробирках с МПБ биофабричного производства и с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 0,2 %-ной (Е. coli Ol, S. typhimurium) и 1%-ной концентрации (Str. pneumoniae), рН 7,2-7,4, в условиях термостата при 37С в течение 10-12 ч (S. typhimurium), 16-18 ч (E.coliOl), 18-20 ч (Str. pneumoniae). Проверку на чистоту роста проводили на МПА, МПБ, 105 средах Эндо и Плоскирева, Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окраской по методу Грама.
Матровую расплодку возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза, стреп-тококкоза нарабатывали отдельно во флаконах емкостью 250 мл. В каждый из них вносили 80-100 мл МПБ с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 0,2%-ной (Е. coli Ol, S. typhimiirium) и 1%-ной концентрации (Str. pneumoniae), рН 7,2-7,4 и 1-2 мл освеженной культуры возбудителя с концентрацией не менее 4-8 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича. Посевы инкубировали при 37С в условиях термостата в течение 10-12 ч (S. typhimiirium), 16-18 ч (Е. coli ОТ), 18-20 ч (Str. pneumoniae). Проверку на чистоту роста проводили на МПА, МПБ, средах Эндо и Плоскирева, Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окраской по методу Грама.
Биологическую массу возбудителя колибактериоза (Е. coli Ol) нарабатывали в 3-5-литровых бутылях. В каждую из них вносили МПБ с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5-10% мат-ровой расплодки культуры возбудителя от объема питательной среды, инкубировали при 37С в течение 12-16 ч, рН 7,6-7,8. Проверку на чистоту роста проводили на МПА, МПБ, средах Эндо, Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окраской по методу Грама.
Бактериальную культуру возбудителя сальмонеллеза (S. typhimiirium) нарабатывали в 3-5-литровых бутылях путем внесения в каждую из них МПБ с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5-10%) матровой расплодки культуры возбудителя от объема питательной среды, инкубировали при 37С в течение 12-14 ч, рН 7,2-7,4. Проверку на чистоту роста проводили на МПА, МПБ, средах Эндо, Плоскирева, Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окраской по методу Грама.
Бактериальное сырье возбудителя стрептококкоза (Str. pneumoniae) нарабатывали в 3-5-литровых бутылях путем внесения в каждую из них МПБ с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 1,0%-ной конечной концентрации и 106 5-10% матровой расплодки культуры возбудителя от объема питательной среды,
инкубировали при 37С в течение 18-24 ч, рН 7,2-7,4. Проверку на чистоту роста проводили на МПА с добавлением 40%-ного раствора глюкозы до 1,0%-ной ко-нечной концентрации, 5% дефибринированной крови кролика, МПБ, агаре и бульоне Сабуро, среде Китта-Тароцци, окраской по методу Грама.
Полученную бактериальную культуру с концентрацией не менее 4-8 млрд м. к./см по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза инактивировали отдельно путем внесения формалина в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации в течение 48-96 ч при температуре 37С. Проверку полноты инактивации проводили посевом бактериальной массы на МПА, МПБ, среды Эндо и Плоски-рева и просмотра их в течение 10 сут, а также при необходимости заражением исследуемым материалом белых мышей и наблюдением за их клиническим состоянием в течение 10 сут.
Изучение кинетики инактивации возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий
Для получения инактивированной вакцины необходимо было подобрать эффективный препарат и щадящий режим для инактивации, позволяющий подавить патогенность возбудителя, но сохранить его иммуногенные свойства. При отработке параметров инактивации брали отдельно выращенную культуру Е. coli 01 с концентрацией 5-8 млрд м. к./см по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича, вносили в нее концентрации формалина от 0,1 до 0,4% по активности формальдегида, оставляли при температуре 37±2С и 22±2С в течение 15 сут, периодически перемешивая. Полноту инактивации возбудителя определяли путем посева бактериального сырья на стерильные питательные среды (МПА, МПБ, Эндо, окраска по Граму) и просмотра их в течение 10 сут, а также при необходимости заражением исследуемым материалом белых мышей и наблюдением за их клиническим состоянием в течение 10 сут.
Изучение иммунобиологических свойств и разработка методов контроля вакцины против сальмонеллеза нутрий
По разработанной нами технологии на основе выделенного и изученного вирулентного штамма Е. coli Ol были изготовлены опытные образцы вакцины против колибактериоза нутрий: серия № 1 - гидроокисьалюминие-вая (ГОА) формолвакцина; серия № 2 - формолвакцина с масляным адъю-вантом; серия № 3 - формолвакцина без адъюванта.
Иммуногенность и безвредность серий вакцины оценивали на нутриях. На каждую серию биопрепарата брали по 5 животных в возрасте 40-50 дней, вакцинировали однократно внутримышечно в дозе 0,5 см3 с последующим заражением привитых и не иммунизированных нутрий вирулентным возбу-дителем (Е. coli 01) в подтитрованной дозе - 2 млрд м.к./см . Наблюдение за животными вели в течение 30 сут (таблица 4).
Из данных таблицы 4 видно, что у нутрий через 14 сут после однократной прививки ГОА-формолвакциной против колибактериоза в дозе 0,5 см3 формировался напряженный иммунитет, обеспечивающий 80%-ную защиту животных от вирулентной культуры Е. coli Ol, вакциной без адъюванта — 60%. У животных, иммунизированных формолвакциной против колибактериоза нутрий с масляным адъювантом, наблюдали хромоту в течение 2-3 дней, защита нутрий от возбудителя колибактериоза составила 80%.
На следующем этапе исследований мы изучили иммунобиологические свойства ГОА-формолвакцины против колибактериоза нутрий после двукратной прививки пушных зверей в возрасте 50 дней: первая доза - 0,5 см3, вторая - 1,0 см3 с интервалом 10 сут и заражения их через 14 сут после ре 121 вакцинации вирулентной культурой Е. coli Ol в смертельной дозе 2 млрд м.к./см . Результаты исследований представлены в таблице 5.
Из данных таблицы 5 видно, что у нутрий через 14 сут после ревакцинации ГОА-формолвакциной против колибактериоза формировался напряженный иммунитет, обеспечивающий 100%-ную защиту животных от Е. coli Ol. Поствакцинальных осложнений у нутрий не наблюдали.
Таким образом, нами была разработана и испытана в лабораторных условиях безвредная и высокоиммуногенная ГОА-формолвакцина против колибактериоза нутрий, в дальнейшем вакцина против колибактериоза нутрий, после одно- и двукратной иммунизации обеспечивающая соответственно 80 и 100%-ную защиту животных от возбудителя колибактериоза.
Вакцину против колибактериоза нутрий контролировали по внешнему виду, цвету, стерильности, безвредности и полноте инактивации, иммуноген-ности.
Внешний вид, цвет, отсутствие посторонней примеси, нарушение укупорки и наличие трещин флаконов определяли визуально. Вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь без посторонних примесей.
Контроль возможной контаминации вакцины бактериальной и грибковой микрофлорой осуществляли по ГОСТ 28085-89 путем посева ее на питательные среды (МПБ, МПА, бульон и агар Сабуро, Китта-Тароцци) и выдерживания их в течение 10 сут при температуре термостата 37С. Рост микрофлоры отсутствовал.
Контроль вакцины на полноту инактивации проводили высевом на питательные среды: МПА, МПБ, Эндо, на безвредность - на 5 белых мышах массой 18-20 г. С этой целью им вводили вакцину подкожно в дозе 0,5 см3 и вели наблюдение в течение 5 сут. Все мыши остались живы и здоровы в течение эксперимента. У привитых мышей не отмечали признаков заболевания и отклонений от физиологической нормы, а также изменений в месте введения биопрепарата.
Иммуногенную активность вакцины проверяли путем прививки 10 белых мышей массой 18-20 г подкожно в дозе 0,25 см3 двукратно с интервалом 10 сут, а 10 животных (контроль) не вакцинировали. Через 14 сут после повторной вакцинации всех мышей заражали внутрибрюшинно Е. coli Ol в подтитрованной дозе (2 млрд м.к./см ). Вакцину считают активной при выживании не менее 8 из 10 вакцинированных и гибели 8 из 10 контрольных мышей в течение 72-96 ч после заражения.
Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации сальмонеллеза нутрий
В сравнении с животными контрольной группы того же возраста через четыре недели после первой иммунизации у нутрий опытной группы выявлено повышение относительного содержания Т-лимфоцитов на 2% и В-лимфоцитов на 5% (Р 0,05) и, напротив, снижение относительного содержания NK- лимфоцитов на 17% (Р 0,05) (таблица 33, рисунок 30).
Таким образом, пролиферация иммунокомпетентных клеток (Т- и В-лимфоциты) у нутрий в 2-х месячном возрасте была минимальной, в то время как относительное содержание NK-лимфоцитов было высоким. С увеличением возраста относительное содержание Т- и В-лимфоцитов постепенно повышалось, при этом относительное содержание NK-лимфоцитов снижалось до минимума, оставаясь в пределах физиологической нормы.
Вакцинация нутрий ассоциированной вакциной против колибактерио-за, сальмонеллеза и стрептококкоза стимулировала интенсивный синтез В-лимфоцитов, являющихся продуцентами иммуноглобулинов, отвечающих за специфическое гуморальное звено иммунитета.
Общепризнано, что в формировании гуморального иммунитета в процессе роста, развития и поствакцинального периода главенствующая роль принадлежит иммуноглобулинам. Защита организма нутрий обеспечивается благодаря пассивному иммунитету за счет антител матери, проникающих через плаценту и, особенно, через молозиво.
Иммуноглобулины сыворотки крови нутрий по своей структуре и молекулярной массе подразделяются на пять классов: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE и самостоятельно без участия комплемента опсонизируют бактерии, нейтрализуют микробные токсины и ферменты [В. Cinder, 1987J.
Содержание отдельных классов иммуноглобулинов в разных биологических жидкостях неодинаково. Иммуноглобулины класса IgG занимают доминирующее положение в сыворотке крови. Особенно большое количество IgG синтезируется при вторичном иммунном ответе и поступает в кровоток из молозива через слизистую кишечника, поскольку он способен преодолевать плацентарный барьер, ему принадлежит главная роль в защите от инфекций у новорожденного организма [Р.П. Маслянко, 1971, 1973, 1975, 1979, 1987; В.Н. Денисенко и соавт., 1994].
Общая регуляция уровня IgG в организме, степень катаболизма находятся в прямой зависимости от тотальной концентрации IgG, в то время как синтез его в основном регулируется антигенной стимуляцией.
В свою очередь IgA известен как бактериальный, секреторный и сывороточный, содержится преимущественно в выделениях слизистых оболочек -в слюне, слезной жидкости, носовых выделениях, поте, молозиве, секретах легких, мочеполовых путей и желудочно-кишечном тракте, где обеспечивает защиту от микроорганизмов поверхностей, сообщающихся с внешней средой.
IgA ингибирует связывание микроорганизмов с поверхностью клеток, слизистых оболочек и предотвращает проникновение их в ткани. При этом агрегированные иммуноглобулины соединяются с нейтрофилами и при уничтожении конкретных микроорганизмов обеспечивают синергизм между IgA, комплементом и лизоцимом.
Поскольку IgM появляется на ранних стадиях в ответ на инфекционный процесс, он легко вызывает агглютинацию и лизис клеток при участии комплемента [Р.В. Петров, 1987; А. Ройт, 1991].
Учитывая, что по уровню основных иммуноглобулинов - IgA, IgM, IgG адекватно оценивается гуморальное звено иммунитета, а также то обстоятельство, что в литературе отсутствуют сведения о динамике формирования гуморального иммунитета у нутрий после иммунизации ассоциированными вакцинами, в сыворотке крови контрольных животных и привитых ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий определяли их концентрацию.
Установлено динамичное достоверное (Р 0,001) увеличение у нутрий 3-х месячного возраста контрольной группы уровня IgA в 1,3 раза, IgM - в 1,4 раза, IgG - на 10% относительно 2-х месячного возраста (таблица 34).
У вакцинированных нутрий на 7-е сут после прививки наблюдалось достоверное (Р 0,001) увеличение IgA на 18%, IgM - в 1,5 раза, IgG - на 23% относительно периода до иммунизации (таблица 34, рисунок 31). Таблица 34 — Показатели гуморального звена иммунитета нутрий до и после вакцинации (М±т; п=10)
В сравнении с контрольными животными того же возраста в опытной группе у зверей на 7-е сут после вакцинации выявлено достоверное увеличение IgA на 14% (Р 0,05), IgM - на 22% (Р 0,001), IgG - на 17% (Р 0,001).
Через неделю после второй прививки у нутрий в опытной группе зарегистрировано достоверное (Р 0,001) повышение уровня IgA на 6%, IgM - на 7%, IgG - на 36% относительно 7-х сут после первой вакцинации.
В сравнении с животными контрольной группы того же возраста у вакцинированных пушных зверей на 14-е сут после иммунизации наблюдалось достоверное повышение уровня IgA на 14% (Р 0,01), IgM - на 22% (Р 0,001), IgG-Bl,6pa3a(P 0,001).
Через две недели после второй прививки у нутрий опытной группы выявлено достоверное повышение уровня IgA на 7% (Р 0,01), IgG - на 26% (Р 0,001) относительно 7-х сут периода иммунизации (таблица 34, рисунок 31).
В сравнении с контрольными животными того же возраста в опытной группе у зверей на 21-е сут после прививки зарегистрировано повышение уровня IgA на 10%, IgM - на 8% (Р 0,001), IgG - в 1,4 раза (Р 0,001).
На 28-е сут после вакцинации у животных в опытной группе наблюдалось достоверное (Р 0,001) повышение количества IgA на 13%, IgG - на 18% и, напротив, снижение IgM на 4% относительно 7-х сут после первой иммунизации (таблица 34, рисунок 31).
Через три недели после второй прививки у нутрий в опытной группе зарегистрировано повышение уровня IgA на 9%, IgM на 3% (Р 0,001), IgG -на 31% (Р 0,001) относительно зверей контрольной группы данного возраста.
Динамика уровня иммуноглобулинов основных классов в сыворотке крови нутрий после вакцинации (в процентах от контроля - до вакцинации)
Таким образом, ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза вызывала иммунологическую перестройку организма нутрий, о чем свидетельствовало достоверное повышение концентрации основных иммуноглобулинов - IgA, IgM, IgG в сыворотке крови привитых животных в сравнении с контрольными. Учитывая, что по уровню специфических антител наряду с основными иммуноглобулинами - IgA, IgM, IgG у привитых животных адекватно оценивается гуморальное звено иммунитета, нами были изучены иммуноген-ные свойства ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий по данным показателям.
С этой целью щенков стандартной породы нутрий в возрасте 2-х мес иммунизировали ассоциированной трехвалентной вакциной двукратно: первая доза - 1,0 см3, вторая — 1,5 см3 с интервалом 10 сут. У животных контрольной и опытной групп до прививки и на 7-е, 14-е, 21-е, 28-е, 60-е, 90- сут после иммунизации перед кормлением из боковой вены хвоста брали кровь. Уровень антител в сыворотке крови нутрий определяли в РП к Str. pneumoniae, в РА — к Е. coli 01 и S. typhimiihiim. Серологические реакции ставили по общепринятым методикам.
Результаты исследования в сыворотке крови нутрий уровня защитных антител против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза представлены в таблице 35, рисунке 32.
Данные таблицы 35 свидетельствуют, что при вакцинации нутрий ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза вырабатывается достаточное количество антител к антигенам, входящим в состав биопрепарата.
Так, у нутрий, привитых ассоциированной трехвалентной вакциной, преципитины в сыворотке крови на 7-е сут после иммунизации были невысокими - от 1:4 до 1:32 и составили в среднем 13,2±3,43.
Через две недели после вакцинации титр антител к Str. pneumoniae в сыворотке крови нутрий опытной группы увеличился в 2,1 раза относительно 7-х сут после прививки и составил в среднем 28,0±6,77.
