Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Значение нетуберкулезных микобактерий в инфекционной патологии 11
1.2 Механизмы развития иммунологического ответа на микобактериальные антигены 17
1.3 Совершенствование технологии изготовления туберкулиновых препаратов 22
1.3.1 Применение мембранных методов в очистке белковых препаратов 30
1.3.2 Современные требования к туберкулиновым аллергодиагностикумам 34
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 40
2.1 Материалы, экспериментальные модели и условия экспериментов 40
2.2. Методы исследований 41
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 44
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 48
3.1 Разработка мембранных методов очистки белков 48
3.1.1 Оценка возможности мембранного фракционирования белков туберкулина 48
3.1.2 Сравнительная оценка режимов микрофильтрации культуральной жидкости М. avium на шихтных фильтрах марки «Ф» и керамических мембранах 56
3.1.3 Отработка условий концентрирования и диафильтрации протеина с использованием мембранной технологии 62
3.1.4 Разработка метода стерилизующей фильтрации концентрата туберкулина (ППД) для птиц 65
3.2 Анализ выхода белка туберкулина при осаждении его различными концентрациями ТХУ 68
3.3 Разработка технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении 77
3.3.1 Изготовление стандартного раствора туберкулина очищенного, (ППД) для птиц 77
3.3.2 Оценка стабильности туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении 80
3.4 Разработка нормативной документации на туберкулин очищенный (ППД) для птиц в соответствии с требованиями международных нормативных документов 86
3.4.1 Оценка качественных характеристик туберкулина с использованием методов контроля, предусмотренных международной нормативной документацией 86
3.4.2 Изготовление и контроль эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц в соответствии с международными требованиями 95
3.4.3 Сравнительное изучение биологических свойств отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и туберкулинов зарубежных фирм-изготовителей 101
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ВЫВОДЫ 121
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 123
ПРИЛОЖЕНИЯ 142
- Значение нетуберкулезных микобактерий в инфекционной патологии
- Статистическая обработка результатов исследования
- Оценка возможности мембранного фракционирования белков туберкулина
Введение к работе
Актуальность работы. Туберкулез животных составляет большой
удельный вес в инфекционной патологии, причиняя значительный
экономический ущерб сельскому хозяйству. Международный ветеринарный
кодекс МЭБ определяет туберкулез как заболевание, требующее
обязательного декларирования. Борьба с этим зооантропонозным
заболеванием имеет не только экономическое, но и социально-гигиеническое и эпидемиологическое значение [23,71]. Необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных предусмотрена Федеральным Законом РФ №77 - ФЗ от 18.06.2001 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации», наряду с мероприятиями в системе здравоохранения.
В последнее время все большее внимание уделяется заболеваниям^
вызванным нетуберкулезными микобактериями — микобактериозам. В
многочисленных исследованиях показано, что в условиях
иммунодефицитных состояний М. avium является одним из основных инфекционных агентов, определяющих развитие патологии [39]. Кроме того, микобактерии птичьего вида вызывают микобактериозы, которые поражают грызунов, свиней и приматов. Клиника течения этих заболеваний сходна с туберкулезом. Успех борьбы с туберкулезом определяется многими факторами, важнейшим из которых является своевременное проведение диагностических мероприятий, направленных на выявление и удаление из оздоравливаемых стад больных животных, представляющих собой основной источник возбудителя болезни [51, 83, 89]. В настоящее время наиболее важным и широко применяемым прижизненным методом исследования на туберкулез является аллергический метод с использованием туберкулиновых препаратов, вызывающих у инфицированных животных реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
В международной практике для диагностики туберкулеза человека и животных используются, в основном, туберкулины, выпускаемые в жидкой форме, стандартизованные по содержанию международных единиц активности.
В Российской Федерации для диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных применяют туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих и туберкулин очищенный (ППД) для птиц. Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих выпускается в виде стандартного раствора, что соответствует форме выпуска туберкулинов, применяемых в странах Европейского Союза. Туберкулин очищенный (ППД) для птиц, согласно ГОСТ 23881-79, изготавливается в сублимированном виде с прилагаемым к нему растворителем. Растворение сухого туберкулина в условиях хозяйства не всегда обеспечивает соответствие стандартной дозы используемого препарата, что может приводить к искажению результатов реакции ГЗТ; кроме того, в условиях животноводческих помещений возможна контаминация препарата посторонней микрофлорой.
В то же время вхождение России во Всемирную Торговую Организацию (ВТО) требует обязательной стандартизации выпускаемых биологических препаратов и унификации методов контроля с общепринятыми международными требованиями. В связи с этим, наряду с вопросом изменения формы выпуска туберкулина очищенного (ППД) для птиц, возникла необходимость гармонизации технических требований к аллергодиагностикуму. Действующий в настоящее время в нашей стране нормативный документ ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц», разработанный 30 лет назад, отличается от аналогичных документов, принятых Европейским Союзом и международными организациями (OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Fifth Edition, 2004, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002).
Вместе с тем, изменение требований к туберкулину очищенному (ППД) для птиц в стандартном разведении требует модернизации технологии его
изготовления, применения валидируемых процессов. Для решения данной проблемы наиболее перспективны методы мембранной технологии. При исключении применения химических реагентов и протекая в щадящих условиях, мембранные методы позволяют внедрять современные технологические приемы очистки белка, а также в значительной степени решать проблемы экологической безопасности производства.
Таким образом, внедрение современных технологических процессов при изготовлении туберкулина очищенного (ГШД) для птиц и разработка нормативных документов, определяющих качество аллергена в соответствии с требованиями МЭБ [164] и ЕФ [112], крайне перспективно при решении задач выпуска отечественного диагностикума, не уступающего по качественным характеристикам зарубежным аналогам.
Целью исследования являлось совершенствование технологических этапов изготовления туберкулина очищенного (ГШД) для птиц с применением мембранных методов, разработка нормативной документации для контроля и выпуска препарата в соответствии с международными требованиями.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Разработать методы мембранного фракционирования и очистки белков туберкулина очищенного (ГШД) для птиц и изучить иммунобиологические свойства белковых фракций препарата.
Провести сравнительный анализ выхода белков туберкулина очищенного (ГШД) для птиц на различных производственных этапах его изготовления при использовании мембранных методов фракционирования и существующей технологии.
3. Определить оптимальную концентрацию белка в растворе
туберкулина очищенного (ГШД) для птиц в стандартном разведении и
изучить стабильность жидкой формы диагностикума.
4. Разработать нормативную документацию на туберкулин очищенный
(ППД) для птиц, соответствующую международным требованиям.
5. Провести сравнительное изучение активности и специфичности
отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном
разведении, изготовленного в соответствии с международными
требованиями, и туберкулинов зарубежных фирм-изготовителей.
Научная новизна. Разработан комплекс промышленных методов для производства туберкулина очищенного (ППД) для птиц, позволяющий снизить содержание балластных антигенов в препарате и повысить выход целевого продукта.
Впервые определено, что антигены туберкулина очищенного (ППД) для птиц с молекулярной массой более 300 кДа обусловливают высокий уровень реактогенности препарата.
Впервые установлено, что оптимальное значение концентрации ТХУ для полного осаждения специфичных и активных белков туберкулина из культуральной жидкости М. avium составляет 8%.
Практическая значимость.
1. Предложена технология изготовления туберкулина очищенного
(ППД) для птиц с применением методов мембранного фракционирования.
2. В соответствии с международными требованиями разработана и
утверждена нормативная документация для изготовления и контроля
туберкулина очищенного (ППД) для птиц.
3. Согласно разработанной нормативной документации,
гармонизированной с требованиями МЭБ, изготовлен и откалиброван
относительно Первого международного стандарта на (ППД)
микобактериальный птичий туберкулин отечественный эталонный образец
туберкулина очищенного (ППД) для птиц.
4. С применением предложенной технологии изготовлено две серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении. Отечественный препарат, выпущенный в соответствии с международными требованиями, по качественным характеристикам не отличался от зарубежных аналогов.
На защиту выносятся следующие положения:
Комплекс методов для изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, позволяющий повысить эффективность производственного процесса и качественные характеристики препарата.
Результаты исследований туберкулина очищенного (ППД) для птиц и эталонного образца туберкулина очищенного (ППД) для птиц, выполненные с применением нормативных документов, разработанных в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к качеству аллергенов для диагностики туберкулеза.
Апробация работы. Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:
Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России — г. Курск, 21-22 сентября 2006 г.
Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» — г. Курск, 20-22 марта 2007 г.
- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля
2008 г.
Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 157 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 таблицами, 12 рисунками. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список используемой литературы включает 194 источника, из них 89 отечественных и 105 иностранных.
Значение нетуберкулезных микобактерий в инфекционной патологии
Обеспечение эффективной защиты сельскохозяйственных животных от болезней было и остаётся одной из главных задач ветеринарной науки и практики. Только от здоровых животных можно получить большое количество качественной животноводческой продукции. Снижение числа случаев заболеваний инфекционной патологии имеет не только экономическое, но и важное социальное значение. Предотвращение эпизоотии позволяет сохранять и развивать необходимые межхозяйственные, межрегиональные, межгосударственные связи, успешная борьба с зооантропонозами вносит большой вклад в обеспечение здоровья населения [71].
Возросшее в последние десятилетия внимание к проблеме туберкулёза сельскохозяйственных животных и людей имеет веское обоснование и связано с целым рядом причин, хотя актуальность данной проблемы всегда оставалась острой для ветеринарных и медицинских специалистов ввиду огромного экономического и социального ущерба, наносимого туберкулёзом. В последние годы эпидемическая и эпизоотическая обстановка по туберкулёзу обострилась и остаётся весьма тревожной [23, 51, 89].
Трудности и сложности борьбы с туберкулёзом обусловлены многими обстоятельствами, к числу которых относятся структурные и биологические особенности возбудителя, в частности, особый химический состав микробной клетки, обеспечивающий высокую устойчивость бактерий к дезинфицирующим средствам, их способность адаптироваться, изменяться и длительно сохранять жизнеспособность в неблагоприятных условиях обитания.
Широкое изучение морфологических, культуральных и биологических свойств микобактерий началось сразу после открытия Р. Кохом возбудителя туберкулёза. К настоящему времени получены разносторонние сведения по морфологии, биохимии и генетике микобактерий, генетической регуляции метаболических процессов.
Основными патогенными видами микобактерий, вызывающими туберкулёз у животных и человека, являются: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium [38, 158].
Возбудитель туберкулёза долго не был систематизирован и не имел четкого определения. В 1896 году Леманн и Найманн отнесли возбудитель туберкулёза к роду Mycobacterium. Н.Ф. Гамалея и Штраус изучили морфологические и биологические свойства возбудителя туберкулёза птиц и разграничили возбудителей туберкулёза птиц и туберкулеза млекопитающих на основании морфологических и культуральных отличий, а также разной патогенности. Микобактерий туберкулёза различных видов несколько отличаются друг от друга по своей морфологии.
Микобактерий туберкулёза птиц имеют форму тонкой, прямой или. слегка изогнутой сплошной или зернистой палочки с округлёнными краями длиной 1-3 мкм, шириной от 0,2 до 0,5 мкм. Микобактерия характеризуется сильно развитым полиморфизмом. Возбудитель туберкулёза птиц не столь избирателен к температурным режимам, как, например М. tuberculosis и М. bovis [179]. М. avium растёт при температурах от 25 до 45 С, хотя наиболее благоприятной для его роста температурой является 39-41 С. М. avium является аэробным микроорганизмом, не образует никотиновой кислоты, не гидролизует Tween—80, является пероксидаза-отрицательным микроорганизмом, синтезирует каталазу, не имеет уреазы или арилсульфатазы и не способен переводить нитраты в нитриты [137]. Патогенные микобактерий отличаются от других бактерий наличием в клеточных стенках не только гликопептидолипидов, но и миколовых кислот, что определяет их чрезвычайную устойчивость к воздействию абиотических и биотических факторов. Так, адаптационная способность микобактерий в условиях меняющихся температур связана с текучестью липидов клеточных стенок, что морфологически проявляется в изменении интенсивности развития наружных покровов и переходом клеток в гетероморфное состояние. Состав жирных и миколовых кислот медленнорастущих микобактерий в значительной степени подвержен влиянию температурного фактора. При высоких температурах в клеточных стенках микобактерий увеличивается синтез миколовых кислот, повышается и содержание корд-фактора. Снижение температуры вызывает уменьшение количества миколовых кислот и корд-фактора [59].
Резкое снижение биосинтеза миколовых кислот, а, следовательно, и корд-фактора (6,6-димиколаттрегалозы, специфического гликолипида патогенных микобактерий, ответственного за кислотоустойчивость и патогенность микобактерий), сопровождается утратой кислотоустойчивости и патогенности у медленнорастущих микобактерий.
Статистическая обработка результатов исследования
Величина биологической активности и специфичность являются важнейшими качественными показателями туберкулиновых препаратов. В свою очередь, эти характеристики аллергодиагностикумов определяются составом препарата и в значительной степени зависят от использованной при их изготовлении технологии. Применение мембранных методов фракционирования позволяет осуществлять разделение антигенов и таким образом дополнительно освобождать диагностикум от балластных фракций.
В целях определения наиболее эффективного диапазона НОММ для: фракционирования белков туберкулина очищенного (ГШД) для птиц были проведены хроматографические исследования по оценке состава белков, туберкулина очищенного (ГШД) для птиц. Для разделения белков по молекулярному весу использовали акриламидно-агарозный ультрагель АсА 34, задерживающий молекулы с молекулярной массой меньше 300 кДа. Эксперименты по гель-фильтрации позволили установить неоднородность белков туберкулина ППД для птиц по молекулярной массе. Исследуемый препарат характеризовался двумя хроматографическими пиками. Результаты представлены на рисунке 2. Большая часть белков туберкулина, имея молекулярную массу менее 300 кДа, задерживалась в порах геля и выходила во втором пике, максимум которого находится в зоне пика соответствующего мономеру бычьего альбумина - 67 кДа. Белки первого пика, составлявшие не более 10% суммарного количества белков туберкулина, выходили в свободном объеме колонки, что дало возможность сделать заключение о минимальной величине молекулярной массы данной фракции - 300 кДа. Хроматограмма белков туберкулина при гель-фильтрации на колонке с ультрагелем Ас А 34
Выявленный при хроматографическом исследовании значительный разброс молекулярной массы белков двух пиков позволил предложить для разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций туберкулина метод мембранного фракционирования. При этом предположительно наиболее эффективной НОММ мембран, которые могли быть использованы для разделения фракций, составлял 300-400 кДа. С использованием мембран, имеющих НОММ 300 кДа, мы провели исследование по оценке возможности мембранного разделения белковых фракций туберкулина очищенного (ППД) для птиц.
Опыты проводили на лабораторной ультрафильтрационной установке с мембранами CENTRAMATE, имеющими НОММ 300 кДа. Разделение фракций туберкулина осуществляли в тангенциальном потоке при давлении 0,5 атм.
Для контроля эффективности мембранного фракционирования туберкулопротеина использовали гель-хроматографический анализ.
Оценка возможности мембранного фракционирования белков туберкулина
Существующий в настоящее время этап обессоливания концентрата белка после его переосаждения сульфатом аммония осуществляется методом диализа в проточной водопроводной воде через полупроницаемую целлофановую оболочку. Этот метод обессоливания требует значительных временных затрат (более 40 часов), большого расхода водопроводной воды, но, что еще более важно, основным недостатком этого метода является применение нестандартных целлофановых мембран.
Нами был предложен новый промышленный метод обессоливания концентрата белка туберкулина очищенного (ППД) для птиц после переосаждения его сульфатом аммония, а именно, метод диафильтрации (ультрафильтрации с сохранением постоянного объема) с использованием" ультрафильтрационной кассетной мембранной установки. Процесс диафильтрации предусматривает непрерывное или ступенчатое многократное разведение раствора концентрата белка, содержащего 4 % сульфата аммония, и последующее концентрирование разбавленного раствора, сопровождающееся удалением части соли.
На рисунке 5 представлена схема процесса диафильтрации. Как видно из представленной схемы, постепенно разбавляя раствор концентрата белка и удаляя через полупроницаемую мембрану низкомолекулярное вещество, в данном случае (NH SC - можно практически полностью избавиться от примеси соли в белковой фракции. Для снижения содержания сульфата аммония в концентрате белка до 0,01%), необходимо провести 16-20 циклов двукратного разбавления раствора белка буферным раствором. Для этого необходимо постепенное добавление 8-10 объемов разбавляющего буферного раствора. Содержание сульфата аммония в концентрате белка, поступающего на этап обессоливания, составляет 3-4%. Для снижения концентрации сульфата аммония до 0,01% согласно схеме, приведенной на рисунке 5, используется восьмикратный объем буферного раствора.
Работы по внедрению метода диафильтрации проводили первоначально на лабораторной кассетной установке «Пелликон» (Millipor, США) с использованием ультрафильтрационных мембран типа PTGK, имеющих НОММ 10 кДа. При изготовлении опытных серий туберкулина очищенного (ППД) для птиц диафильтрацию проводили на промышленной ультрафильтрационой кассетной установке российского производства с мембранами, имеющими НОММ 3 кДа. Было установлено, что мембраны с НОММ 10 кДа имели селективность по белку 90%, тогда как мембраньг с НОММ 3 кДа показали более высокую селективность — 95-98%), что позволило проводить процесс с минимальными потерями целевого продукта.
В таблице 7 приведены результаты эксперимента по оценке мембран для ультрафильтрационной установки, применяемой при обессоливании концентрата туберкулина методом диафильтрации.
