Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Токсигенные грибы рода Fusarium 7
1.1 Методология изучения популяций 8
1.2 Современные подходы к систематике 9
Глава 2. Фузариотоксины трихотеценового ряда 12
2.1 Строение и биологическая активность 12
2.2 Методы анализа культур грибов 16
Глава 3. Характеристика гриба Fusarium роае 17
3.1 Биологические особенности 17
3.2 Причастность к фузариотоксикозам 18
3.3 Токсичные метаболиты 19
Собственные исследования 24
Глава 4. Материалы и методы 24
4.1 Объекты исследования 24
4.2 Условия культивирования грибов 27
4.3 Анализ культур на содержание фузариотоксинов 28
4.4 Синтез белковых конъюгатов диацетоксисцирпенола 29
4.5 Индукция антител и их характеристика 31
Глава 5. Результаты исследований 34
5.1 Разработка ИФА диацетоксисцирпенола 34
5.1.1 Получение и тестирование иммунореагентов 34
5.1.2 Оптимизация условий анализа 41
5.2 Токсигенный потенциал региональных популяций Fusarium роае . 45
5.2.1 Диацетоксисцирпенол и Т-2 токсин 45
5.2.2 Ниваленол и фузаренон X 50
5.2.3 Зеараленон 55
5.3 Видовые особенности биосинтеза трихотец-9-енов 57
5.3.1 F.poae и другие распространенные возбудители фузариоза 57
5.3.2 Локализованные и редко встречающиеся виды 59
Обсуждение результатов исследований 62
Выводы 69
Практические предложения 70
Список литературы 71
Список сокращенных обозначений 91
Приложение 92
Введение к работе
Актуальность темьі. Одним из важнейших условий успешного развития животноводства является обеспеченность хозяйств зерновыми кормами высокого санитарного качества. Загрязненность зернофуража токсинами, которые образуют грибы рода Fusarium, приводит к значительному экономическому ущербу, поскольку в последние годы поражение злаковых культур фузариозом отмечается в нашей стране практически повсеместно. В отдельные периоды, особенно в условиях повышенной влажности и температуры, заболевание способно приобретать характер эпифитотий. В разных эколого-географических зонах отмечено формирование специфической по составу фузариозной инфекции зерна, в которой, как правило, среди доминирующих патогенов встречается гриб F. роае (Peck) Wollenweber (7, 15, 21, ЗО).
Этот вид, обладающий экологической пластичностью, признаками резкой изменчивости и сложным биологическим статусом, в последние годы привлекает все большее внимание микотоксикологов. Его присутствие в зерне связывают с такими масштабными и эндемическими интоксикациями человека и животных как острый геморрагический синдром, алиментарно-токсическая алейкия, болезнь Кашина-Бека и др. (91, 171). Зарубежные исследователи неоднократно высказывали предположение о том, что токсигенность F. роае может быть связана с активным биосинтезом метаболитов трихотеценового ряда - диацетоксисцирпенола и ниваленола, которые являются близкими структурными аналогами таких широко известных фузариотоксинов как Т-2 токсин и 4-дезоксиниваленол (31, ПО, 134, 154).
Тем не менее, подробный анализ мировых данных литературы за период с 1960 по 2005 гг. показывает, что сведения относительно токсигенного потенциала F. роае остаются весьма противоречивыми, а свойства природных популяций этого вида практически не исследованы.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение
потенциала токсинообразования у гриба F. роае из состава микобиоты зерна
колосовых культур фуражного назначения, а также сопутствующих ему
возбудителей фузариоза, с учетом разнообразия условий их обитания.
Для достижения этой цели были определены следующие задачи:
оценить токсигенный потенциал региональных популяций F.poae в отношении группы токсинов трихотеценового ряда и зеараленона;
изучить степень изменчивости токсинообразующих свойств F.poae в экспериментах, моделирующих разные условия его развития;
определить способность к биосинтезу высокотоксичных трихотеценов у других видов Fusarium, встречающихся в зерне;
получить и охарактеризовать биологические и биохимические реагенты для иммуноферментного анализа диацетоксисцирпенола;
разработать экспресс-метод индикации диацетоксисцирпенола в культурах грибов Fusarium и составить методические рекомендации для оценки степени токсигенности у санитарно-показательных видов.
Научная новизна работы состоит в следующем:
- впервые установлены основные факторы, степень и характер
изменчивости токсигенных свойств региональных популяций гриба F. роае,
участвующих в инфицировании возделываемого в России фуражного зерна;
- выявлен новый факт значительного варьирования признака
биосинтеза ниваленола у морфологически однородного вида F. роае;
впервые показано, что среди видов, часто встречающихся в фузариозном зерне, наибольшим потенциалом накопления диацетоксисцирпенола обладают F.poae и F.sporotrichioides;
впервые в стране 'получены аналитические иммунореагенты для избирательного определения диацетоксисцирпенола и предложен новый метод поиска продуцентов этого токсина среди санитарно-показательных видов Fusarium.
Практическая значимость работы.
Сведения об особенностях токсинообразования региональных популяций основных возбудителей фузариоза колоса, полученные в рамках данной работы, могут быть использованы для совершенствования приемов прогнозирования загрязненности микотоксинами зерна, возделываемого в нашей стране. Высокий токсигенный потенциал, установленный для отдельных популяций F.poae, указывает на необходимость контроля степени инфицирования зерна этим грибом при санитарно-микологической оценке качества зернофуража.
Разработанные «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН в 2007 г., предназначены для микотоксикологической оценки грибов Fusarium и могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в практических ветеринарных лабораториях для диагностики и профилактики фузариотоксикозов животных.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на I съезде ветеринарных фармакологов (Воронеж, 2007), на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2007, 2008 гг.), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (декабрь 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объём работы и структура диссертации. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 8 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением результатов, выводы, практические приложения, список литературы, включающий 180 источников (отечественных авторов - 30 и зарубежных - 150), список сокращений и приложение.
Методология изучения популяций
К началу 90-х годов сведения относительно токсинообразования грибов Fusarium, участвующих в поражении зерна на территории нашей страны, касались только немногих представителей отдельных видов. Так, штамм F. sporotrichiella № 5328 а, выделенный Е.С. Квашниной в 1954 г. из нескошенного овса в Московской области, был охарактеризован по способности продуцировать Т-2 на уровне 667 мг/кг (24). У двух вариантов этого же штамма накопление этого токсина составило 600 — 900 мг/кг (25). Штамм F.sprotrichiella var. роае № 53115, выделенный в 1953 г. из зерна пшеницы в Московской области, при культивировании на просе (26С/2 нед.) образовывал Т-2 (178 мг/кг) и НТ-2 (66 мг/кг) (27). F.culmorum № 5373 из зерна озимой пшеницы Горьковской области, полученный в 1974 г., был способен к слабому накоплению ДОН на уровне 2,2 мг/кг (27). Штаммы F.graminearum № 53426 и № 54026, выделенные из зерна яровой пшеницы в Западной Сибири в 1972 и 1975 гг., а также штамм № 53555 из зерна ячменя с Дальнего Востока, не продуцировали ДОН и ЗЕН (27).
Высокий потенциал образования ДОН и ЗЕН был установлен у 73 изолятов F.graminearum из очага обширной и продолжительной эпифитотии фузариоза пшеницы в Краснодарском крае, произошедшей в конце 80-х годов (20). Позднее были опубликованы результаты выборочного изучения токсинообразования отдельных видов грибов Fusarium из состава возбудителей фузариоза колосовых культур в Московской области (11, 12).
С 1991 г. в России было начато осуществление долговременного масштабного научного проекта по микотоксикологическому мониторингу состояния фуражного зерна (22), основой которого стало изучение штаммов Fusarium, объединенных общей видовой принадлежностью и территориальным происхождением (популяций). Для токсикологической оценки культивирование каждого штамма проводили на зерновых субстратах в условиях, моделирующих периоды вегетации злаков, послеуборочного хранения зерна, а также его перезимовки под снегом (22). Этот экспериментальный прием, моделирующий изменчивость естественных факторов, таких как влажность и температура, получил высокую оценку специалистов и был признан перспективным для изучения токсинообразования возбудителей фузариоза колоса (10).
Вопросам традиционной таксономии грибов рода Fusarium, основанной на концепции «морфологического или типологического» вида, посвящена обширная литература (101). В разные годы было предложено несколько таксономических систем, в их числе весьма подробные, которые признавали более 100 видов и подвидов (75, 174), сжатые - всего 9 видов (147), а также -промежуточные между ними (40, 77, 89, 92, 125). Такое многообразие правил классификации привело к сложной ситуации в литературе по микотоксикологии Fusarium. Больше всего проблем возникло из-за обозначений F.tricinctum (Corda) Sacc. emend. Snnyd. & Hans. nF. roseum Lk. emend. Snyd. & Hans., введенных Снайдером и Хансеном (147). Первое из них объединяло по меньшей мере 4, а второе - 15 видов Fusarium, предусмотренных другими (. системами. К сожалению, в их число попали многие виды, которые были причиной острых фузариотоксикозов людей и животных.
В этих условиях стало крайне необходимым сформировать общий согласованный подход к систематике грибов Fusarium. Все предложенные классификации, кроме одной (147), были основаны на монументальной работе Волленвебера и Рейнкинга (174), имели много общего, особенно в отношении фитопатогённых и токсигенных грибов Fusarium, и отличались в основном номенклатурой и признанием подвидовых таксонов у определенных видов. С учетом мнений ведущих специалистов в этой области к применению были рекомендованы системы Буса (40), Нельсона (125) и классификация Герлаха и Ниренберг (75).
Видовая идентификация грибов Fusarium по морфологическим и культуральным признакам, таким как форма и размеры микроконидий, наличие монофиалид, полифиалид и хламидоспор, внешний вид мицелия, характер пигментации культур, а также скорость их роста на разных средах, специфические запахи и прочие, была и остается непростой задачей. Установление вида может быть корректно и достоверно выполнено только специалистами с высоким уровнем профессиональной подготовки и многолетним опытом работы. Неоднозначность при установлении вида может возникать из-за гетерогенности морфологических и культуральных признаков, разных сроков их появления, отсутствия полового спороношения у большинства видов, а также из-за склонности Fusarium к легким мутациям и к дегенерации при повторных пассажах на лабораторные среды.
Строение и биологическая активность
Токсичные метаболиты грибов Fusarium, относящиеся к ряду 12,13 эпокситрихотеценов, представлены структурно-близкими аналогами трихотец-9-ена и трихотец-9-ен-8-она, для которых в зарубежной литературе обычно используются другие обозначения - группы А и В. Химическое строение 12,13-эпокситрихотеценов, имеющих наибольшее ветеринарно-санитарное значение, представлено нарис. 1. Обнаружение этих метаболитов было связано с поиском причин острых микотоксикозов - летальных отравлений скота плесневелой кукурузой в США, которые сопровождались острым геморрагичесим синдромом (34, 37), интоксикаций, вызванных фузариозным зерном в Японии (157), а также с изучением природы фитотоксических факторов у грибов Fusarium (41, 78). При этом, к сожалению, были использованы собирательные обозначения видов по классификации Снайдера и Хансена (147) и теперь невозможно уточнить видовую принадлежность многих высокоактивных продуцентов.
Об установлении строения ДАС было сообщено в 1964 году одновременно двумя группами исследователей в Швейцарии (70) и Великобритании (60, 61). Выделение и частичное описание строения Т-2 было сделано в 1966 году (76), и затем структура токсина, выделенного из штамма Т-2 F.tricinctum, была установлена независимо в 1968 г. (38). MAC был позднее получен из токсичной культуры F.roseum Gibbosum, выделенной из кукурузы в связи с острым отравлением молочного скота в США (132). НИВ был выделен и охарактеризован в 1968 г. (155, 156), затем было описано получение ФУЗ-Х (163). В 1972-73 гг. были идентифицированы ДОН и 3-АДОН (119, 168, 177) и позднее в 1983 г. - 15-АДОН (115).
Литературные данные по острой токсичности трихотеценов для мышей (28, 53, 141, 159, 166, 167, 171) и по способности этих соединений ингибировать рост культуры клеток животных (32, 129, 137, 158, 159, 167) суммированы в таблицах 1 и 2. При вполне объяснимой зависимости значений ЛД5о от способа введения веществ высокой токсичностью обладают Т-2 и ФУЗ-Х, а ДАС и НИВ уступают им. Степень цитотоксичности для большинства типов клеток у Т-2 выше, чем у ДАС, а относительно НИВ и ФУЗ-Х такое сравнение пока провести не удается из-за ограниченности доступных сведений. При аппликации на эпителий кожи кролика минимально-действующая токсическая доза 0,004 мкг для Т-2 и ДАС была одинаково низкой, для ФУЗ-Х составляла 0,01 мкг, а для НИВ была еще выше (0,1 мкг) (17).
Изучению механизма токсичности этих трихотеценов посвящена обширная литература, они ингибируют синтез белка на рибосомальном уровне, нарушают синтез ДНК и РНК, активно действуют на делящиеся клетки ротовой полости и желудочно-кишечного тракта. Особенно важное значение имеют экспериментальные доказательства ингибирующего действия многих трихотеценов на клетки иммунокомпетентных органов животных, полученные в последние годы.
Биологические особенности
Fasarium роае принадлежит важная роль в сообществе грибов, заселяющих растительные субстраты, он формирует основной компонент грибной флоры зерна колосовых культур (7, 9, 15, 16, 21, 30, 162, 172) и, согласно многолетним наблюдениям микологов и фитопатологов, обладает экологической пластичностью и изменчивостью. Так, сотрудники Всесоюзной научно-исследовательской лаборатории по изучению ядовитых грибов МСХ СССР «у изолятов F.poae различного географического происхождения наблюдали так называемые экологические модификации», формирующиеся в процессе адаптации к окружающей среде (8).
Поиску биологических причин, определяющих эти особенности, в последние годы уделяется все больше внимания. Начаты молекулярно-генетические исследования (68, 69), разработан ПЦР анализ для обнаружения гриба в зерне пшеницы (131). У этого вида идентифицированы вегетативно совместимые группы (102, 103). Установлено, что почти у всех изученных штаммов этого вида обнаруживаются вирусоподобные частицы с геномом двухполосной РНК (67). В отличие от других грибов, у географически различающихся штаммов F.poae сходные по размерам элементы РНК гомологичны друг другу, тогда как между разными элементами одного и того же штамма гомологии не выявлено - меньшие фрагменты не были производными больших и, наоборот, большие фрагменты не были мультимерами меньших (55). Новый миковирус, названный FP VI, был выделен из штамма F.poae А-11 и стал третьим полностью охарактеризованным вирусом грибного происхождения (55). Недавно показано участие F.poae и в таком мало изученном явлении как влияние конкурирующих грибов на метаболизм друг друга. Так, в присутствии F.poae и F.culmorum наблюдалось значительное ингибирование образования охратоксина А грибом Penicillium verrucosum в зерне (109). 3.2 Причастность к фузариотоксикозам
Возможность участия этого вида гриба в массовых вспышках острого фузариотоксикоза населения - алиментарно-токсической алейкии (АТА) неоднократно обсуждалась российскими и зарубежными исследователями (8, 86 - 88, ПО, 175). Основанием для этого послужили многочисленные случаи обнаружения высокой токсичности у изолятов F.poae из перезимовавших в поле пшеницы, ячменя, ржи, проса, подсолнечника и образцов почвы в Оренбургской области в 1943-49 гг.
По предположению российских ученых F.poae является этиологическим фактором деформирующего дистрофичного остеоартроза населения (болезнь Кашина-Бека, уровская болезнь), встречающегося на отдельных территориях СССР, Северной Кореи и Китая. После скармливания культур этого гриба, выделенных из злаков в районах эндемии заболевания, в костях и суставах у собак и крыс были воспроизведены характерные патологические изменения (126).
Эффект острой токсичности был обнаружен у многих изолятов этого вида гриба из зерновых и грубых кормов, вызвавших отравления животных. В экспериментах по подкожному введению эфирно-спиртовых экстрактов культур F.sporotrichiella var. роае №№ 2/3, 2002, 2006 и 2010, выделенных из зерна в 4-х регионах СССР, наблюдали сильную воспалительную реакцию и некроз кожи, а при внутрибрюшинном введении культуральной жидкости -гибель мышей за 24-48 ч (14). Один из изолятов F.sporotrichiella var. роае (Pk.) Bilai, выделенный из кормов на Украине, оказывал выраженный токсический эффект в кожной пробе на кролике (24). При скармливании поросятам ячменя, инокулированного штаммом F.sporotrichiella var. роае из соломы в Омской области, исследователи отмечали признаки острой интоксикации, снижение прироста массы, изменения морфологического и иммунологического состава крови (6). Штамм F.poae аргентинского происхождения вызывал глубокую дегенерацию клеток кожи кролика и внутренние геморрагии у животных при скармливании культуры, выращенной на зерне кукурузы (107).
Таким образом, несколькими группами исследователей в разные годы были получены экспериментальные доказательства причастности этого вида гриба к интоксикациям человека и животных.
Первое сообщение о способности F.poae продуцировать НИВ было сделано в 1984 г. (31). Позднее были получены подтверждения другими исследователями. Так, почти все изоляты (7/8) из пшеницы в Японии (о. Хоккайдо) продуцировали НИВ в количествах 80 - 380 мкг/кг (154). В Швеции 6 из 10 изолятов образовывали НИВ в диапазоне 0,3 - 17 мг/кг (Pettersson, 1991). По данным (134) из 50 штаммов, полученных из разных европейских стран, для 37 характерно продуцирование НИВ и для 30 - ФУЗ-X. Однако эти токсины не удалось найти у представителей этого вида гриба в Польше (50) и в Японии (150).
Противоречивые сведения получены для F.poae в отношении биосинтеза ДОН. Для 50 изолятов из Германии (73, 111), Польши (50) и Японии (150) было показано отсутствие такой способности. Тем не менее, индийскими исследователями для штамма F.poae FP-3 подтверждено продуцирование этого токсина в количестве 0,4 мг/кг методом ГЖХ (39). Ни один из 5 штаммов, выделенных из зерна в Норвегии, не образовывал ДОН и 3-АДОН (99).
