Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1 Систематика и особенности возбудителя пепельной гнили Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid 10
1.2 Осмотрофное питание грибов 22
1.3 Характеристика сои, как растения-хозяина возбудителя пепельной гнили 29
1.4 Технологические приёмы, сдерживающие вредоносность пепельной гнили сои 32
1.5 Селекционно-генетический способ повышения устойчивости к пепельной гнили 35
2. Условия, материал и методы проведения исследований 40
2.1 Характеристика почвенно-климатических условий места проведения исследований 40
2.1.1 Характеристика почв 40
2.1.2 Климат и погодные условия 42
2.2 Материал и методы проведения полевых и лабораторных исследований 48
3. Биология возбудителя пепельной гнили и его распространённость в агроценозе сои 59
3.1 Симптомы проявления пепельной гнили на растениях сои 59
3.2 Локализация и морфотипы микросклероциев М. phaseolina в тканях растений сои 66
3.3 Влияние температуры и рН питательного субстрата на развитие гриба М. phaseolina 71
3.4 Механизм образования микросклероциев пепельной гнили 76
3.5 Распространённость и развитие пепельной гнили на сое 84
4. Оценка эффективности химического метода защиты сои от пепельной гнили 90
4.1 Первичная оценка активности фунгицидов против гриба M. phaseolina 90
4.2 Оценка эффективности фунгицидов против гриба М. phaseolina в полевых условиях 93
5. Осмосозависимое формирование микросклероциев пепельной гнили в тканях растений сои 97
5.1 Гипотеза осмотически зависимого образования микросклероциев в онтогенезе сои 97
5.2 Инициация формирования микросклероциев пепельной гнили на начальных этапах онтогенеза сои 98
5.3 Осмотическое давление клеточного сока гриба М. phaseolina 106
6. Динамика осмотического давления клеточного сока (одкс) сои в онтогенезе 111
6.1 Экспресс-метод определения осмотического давления клеточного сока в тканях растений сои 111
6.2 Суточный ритм осмотического давления клеточного сока в растениях сои : 114
6.3 Величины осмотического давления клеточного сока у разных видов растений 121
6.4 Осмотическое давление клеточного сока у растений сои на разных стадиях онтогенеза: 123
7. Перспективы создания исходного материала для селекции сои с повышенной устойчивостью к пепельной гнили 141
7.1 Влияние ОДКС в критические фазы развития сои на развитие пепельной гнили и урожайность культуры 141
7.2 Выделение толерантных к пепельной гнили сублиний сои 150
7.3 Особенности определения ОДКС в тканях растений сои у ранних гибридных поколений Fi и F2 158
Выводы 161
Предложения для практической селекции и производства 163
Список использованной литературы
- Характеристика сои, как растения-хозяина возбудителя пепельной гнили
- Климат и погодные условия
- Распространённость и развитие пепельной гнили на сое
- Инициация формирования микросклероциев пепельной гнили на начальных этапах онтогенеза сои
Введение к работе
Актуальность темы. В европейской части России лидирующим по производству сои регионом является Краснодарский край, территориально входящий в зону Западного Предкавказья. В 2010 г. на площади 143 тыс. га в крае был получен валовой сбор сои - более 220 тыс. т.
В то же время рост площадей и производства сои на юге России сопровождается увеличением распространения опасных микозов, способных нанести значительный ущерб урожаю и качеству семян. Одним из распространённых и вредоносных заболеваний сои является пепельная гниль, возбудитель которой -гриб Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid.
Пепельная гниль в посевах сои наиболее часто проявляется при жаркой, сухой погоде, когда неблагоприятные условия внешней среды вызывают стресс у растений. Участившиеся в последние десятилетия на Северном Кавказе, включая Западное Предкавказье, продолжительные и интенсивные летние засухи, увеличивают вероятность образования благоприятных условий для развития М. phaseolina в промышленных посевах сои [Зеленцов, Бушнев, 2006]. При сохранении тенденций изменения климата в Западном Предкавказье, с учётом дальнейшего увеличения посевных площадей под сою в среднесрочной перспективе предполагается нарастание эпифитотийного распространения и развития болезни в регионе. Складывающаяся ситуация обусловила необходимость уточнения биологии возбудителя пепельной гнили - гриба М. phaseolina и создание сортов сои с повышенной устойчивостью к патогену.
Несмотря на распространённость возбудителя пепельной гнили, в мире до настоящего времени у сои так и не обнаружена генетическая устойчивость к этому патогену и практически отсутствуют иммунные к М. phaseolina сорта сои. [Schwenk, Crowe, Kelley, 1984; Ashraf et al., 2005; Hussain, Shuaib, 2007; Wrather, Shannon et al., 2008; Hernandez-Delgado et al., 2009].
Количество исследований, посвященных биологии, распространённости и вредоносности гриба М. phaseolina на сое, особенно в зоне Западного Предкавказья и Северного Кавказа в целом, крайне ограничено. Имеющиеся сведения в публикациях имеют фрагментарный и незавершённый характер. В литературе практически отсутствуют сведения о наличии генотипов сои с вертикальной или горизонтальной устойчивостью к этому патогену. Слабо изучена биология гриба и практически не изучены условия образования микросклероциев в системе патоген - растение-хозяин в стрессовых условиях острой засухи.
В связи с возрастающей вероятностью наступления в летний период продолжительных и интенсивных засушливых периодов, изучение распространённости и развития пепельной гнили на сое, биологических особенностей гриба М. phaseolina, а также поиск эффективных мероприятий по снижению вредоносности пепельной гнили, включая создание исходного материала для селекции сортов сои с повышенной устойчивостью к М. phaseolina, являются актуальными.
Цель и задачи исследований. Изучение биологии гриба М. phaseolina в онтогенезе сои, вьщеление толерантных к возбудителю пепельной гнили форм, а
также создание на их основе исходного материала для селекции сортов сои в условиях Западного Предкавказья.
Для реализации этой цели поставлены следующие задачи:
изучить развитие гриба М. phaseolina в тканях растений сои, в том числе в условиях водного стресса;
изыскать эффективные фунгициды, снижающие вредоносность пепельной гнили;
определить связь между периодом массового образования микросклероциев гриба М. phaseolina и концентрацией клеточного сока в тканях растений сои;
разработать метод определения осмотического давления клеточного сока гриба и установить его критический уровень, препятствующий развитию патогена;
изучить онтогенетическую динамику осмотического давления клеточного сока (ОДКС) в тканях растений сои;
выделить формы сои с гипотоническими концентрациями клеточного сока в условиях водного стресса не вызывающими образование микросклероциев, и на их основе создать рабочую коллекцию сои с повышенной устойчивостью к пепельной гнили.
Научная новизна. Установлено, что формирование микросклероциев пепельной гнили в тканях растений сои на всех этапах онтогенеза растений происходит при достижении изотонических уровней осмотического давления клеточного сока гриба и тканей растения-хозяина.
Установлено, что микросклероции возбудителя пепельной гнили могут формироваться не только из сплетения нескольких гиф, но также интеркалярно или терминально из отдельных гиф, находящихся в сосудах ксилемы, что повышает риск трахеомикоза в растениях сои.
Определена биологическая эффективность современных протравителей семян, защищающих сою от возбудителя пепельной гнили.
Показана вредоносность пепельной гнили сои при повышении концентрации клеточного сока в тканях растения-хозяина в условиях водного стресса в период засухи и искусственного дефицита воды.
Установлено, что наиболее надёжной является оценка осмотического давления клеточного сока нижнего яруса растений в течение всей первой половины дня.
Доказано, что рост гриба М. phaseolina прекращается при достижении изотонического уровня осмотического давления питательной среды - 930 кПа. Дальнейшее увеличение осмотического давления питательной среды является гипертоническим для гриба, что приводит к прекращению роста мицелия.
Впервые разработан метод отбора толерантного к возбудителю пепельной гнили исходного материала для селекции сои. Метод предусматривает выделение форм растений с осмотическим давлением клеточного сока, не превышающим 930 кПа в фазы бобообразования и налива семян.
Выделен исходный материал с пониженным уровнем ОДКС для создания толерантных к пепельной гнили сортов сои.
Практическая значимость исследований. Установлено, что для защиты растения от инфекционного начала пепельной гнили на начальных этапах роста сои необходимо проводить предпосевную обработку семян препаратом ТМТД, ВСК (400 г/л) при норме расхода 6,0 л/т.
Оценку и отбор исходного материала для селекции сои на устойчивость к возбудителю пепельной гнили проводить в критические по потреблению воды фазы бобообразования и налива семян. При создании толерантного к патогену исходного материала сои выделять формы растений с осмотическим давлением клеточного сока ниже 930 кПа, которое является критическим для возбудителя пепельной гнили и приводит к массовому формированию микросклероциев.
При селекции толерантных к пепельной гнили сортов сои в качестве родительских форм использовать: Парма-Т, Вилана, Альба, Славия, Фора, КСХИ-709, Т-102.
Основные положения, выносимые на защиту:
Особенности патогенеза гриба М. phaseolina и причины формирования микросклероциев в растениях в условиях водного стресса.
Высокая эффективность фунгицида ТМТД, ВСК (400 г/л) от возбудителя пепельной гнили на начальных этапах роста растений сои, который рекомендован на различных культурах против других болезней.
Метод определения осмотического давления клеточного сока гриба М. phaseolina, основанный на установлении критического осмотического давления среды, при которой полностью прекращается рост мицелия патогена.
Метод отбора форм сои с до критическими для гриба М. phaseolina концентрациями клеточного сока, не вызывающими образования микросклероциев в тканях растений.
Исходный материал с пониженным уровнем ОДКС для создания толерантных к пепельной гнили сортов сои.
Апробация результатов исследований. Основные результаты исследований доложены на расширенных заседаниях методической комиссии ВНИИМК (2008-2011 гг.); 8-ой Региональной научно-практической конференции молодых учёных «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2006 г.); Всероссийских научно-практических конференциях молодых учёных «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2007, 2008, 2010 гг.); 5-ой Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Краснодар, 2008 г.); 2-ой Международной конференции по сое «Современные проблемы селекции и технологии возделывания сои» (Краснодар, 2008 г.); 4-ой Международной научно-практической конференции молодых учёных «Состояние и перспективы развития растениеводческой отрасли в условиях изменения климата» (Харьков, 2009 г.); 5-ой Международной конференции молодых учёных и специалистов «Перспективные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур» (Краснодар, 2009 г.); 6-ой Международной конференции молодых учёных и специалистов «Инноваци-
онные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур» (Краснодар, 2011 г.); 1-ой Всероссийской интернет-конференции «Растения и микроорганизмы» (Казань, 2011 г.).
Публикация результатов исследований. Материалы диссертации опубликованы в 19 печатных работах общим объёмом 6,12 печатных листа, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах компьютерной верстки и состоит из введения, 7 глав, выводов, предложений для практической селекции и производства, содержит 58 рисунков, 27 таблиц и 2 приложения. Список литературы включает 250 наименований, в том числе 113 - иностранных авторов.
Декларация личного участия автора. Автор выполнила диссертацию в рамках тематического плана научно-исследовательских работ государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур Российской академии сельскохозяйственных наук имени B.C. Пустовойта по заданию 04.07.04.01 «Разработать экологически безопасные, экономически оправданные адаптивные технологии производства масличных и эфи-ромасличных культур, обеспечивающие повышение их урожайности на 10-15 %», номер государственной регистрации - 0120.0950170.
Диссертация содержит фактический материал, непосредственно полученный автором в течение 2007-2010 годов на центральной экспериментальной базе ВНИИМК, г. Краснодар.
Характеристика сои, как растения-хозяина возбудителя пепельной гнили
Возбудителем пепельной гнили является гриб Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Патоген наиболее изучен в США, где помимо основного названия «charcoal rot» (угольная, гниль) по характерной чёрной окраске микросклеро-циев, имеет синонимы, основанные на его эколого-биологических особенностях, таких как «dry weather wilt» (увядание сухой погоды) или «summer wilt» (летнее увядание) [Dhingra, Sinclair, 1977; 1978 ; Sinclair, Backman, 1989]; Действительно, симптомы пепельной гнили наиболее часто проявляются при жаркой; сухой погоде, когда неблагоприятные условия1 внешней среды вызывают стресс у растений сои. Однако4 патоген способен атаковать растение сои в течение всего-вегетационного периода, зачастую вызывая прогрессирующее истощение растения-хозяина [Sinclair, Backman; 1989].
Егоустаревшие синонимы: Sclerotium bataticola Taubenh.; Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby; Tiarosporella phaseoli (Maubl.); Rhizoctonia bataticola (Taubenh.) Butler; Rhizoctonia lamellifera W. Small; Botryodiplodia phaseoli (Maubl.) Thirum. [Хохряков, 1966; Пидопличко, 1977; Dhingra, Sinclair, 1978; Билай, 1982; Wyllie, 1989; Aboshosha, 2007].
Впервые пепельная гниль была описана в 1905 году А. Мобланом (А. Maublanc) как Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby на фасоли из Туниса. В 1912 году при обнаружении пепельной гнили на сеянцах джута, арахисе и хлопчатнике в Индии Ф. Шоу ошибочно назвал этом-гриб как Rhizoctonia sola ni Kiihm [Dhingra, Sinclair, 1977]. В 1916 году Савада (Sawada) описал болезнь джута, возбудителем которой о» назвал Macrophomina corchori Saw., в чистой культуре которого склероции были приняты за незрелые пикниды. Сходную пикнидиальную стадию на стеблях кунжута на Филиппинах описал Петрак (Petrak) под названием Macrophomina phillippinensis Petr. [Шишкина, 1954]. Позже Ф. Шоу опубликовал результаты исследования болезни на джуте, сообщив, что гриб Macrophomina corchori Saw. постоянно образует чёрные мелкие склероции. Чистая моноспоровая культура гриба давала склероциальную форму [Dhingra, Sinclair, 1977]. В 1925 году X. Р. Брайтон-Джонс назвал обнаруженного в Египте возбудителя корневой гнили на хлопчатнике и фасоли как Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler на том основании, что Батлер в результате сравнительного изучения чистых культур гриба из Индии, Египта и Америки установил их идентичность [Dhingra, Sinclair, 1977].
Английский фитопатолог С. Ф. Ашби, изучая в культуре экссудаты и штаммы ранее изученных грибов, нашёл, что они идентичны с видом, описанным в 1905 году А. Мобланом как Macrophomina phaseoli Maubl. на фасоли из Туниса и предложил для всех этих видов новое название Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby [Ashby, 1927; Dhingra, Sinclair, 1978]. Ранее было установлено, что изоляты, полученные с различных сельскохозяйственных культур, всегда образуют склероции и только некоторые, например, с фасоли, формировали пикни-диальную стадию [Luttrell, 1947]. На основании этого Дж. Рейкерт и Ф. Хеллин-гер посчитали, что название Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler - неправильное [Reickert, Hellinger, 1947]. По их мнению, это название нужно употреблять в тех случаях, когда гриб образует только склероции, а название — Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby, если гриб образует только пикниды. Когда гриб во время своего развития образует и пикниды, и склероции, следует употреблять название Macrophomina (Sclerotium) phaseoli (Maubl.) Ashby. В 1955 году А. Ковур опять переименовал этот гриб в Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler [Kovoor, 1955].
Отечественный фитопатолог M. К. Хохряков насчитывал около 16 синонимов названий этого возбудителя, но чаще всего в литературе его называли Sclerotium bataticola Taub. с пикнидиальной стадией Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby. Несмотря на то, что и сейчас среди специалистов сохраняются различные мнения по таксономическому положению возбудителя пепельной гнили, в настоящее время общепринятое международное название гриба — Ма-crophomina phaseolina (Tassi) Goid.
Такое большое количество синонимов патогена обусловлено тем, что отдельные систематики относят гриб к классу Ascomycetes (аскомицеты), а другие - к классу Deuteromycetes (несовершенные).
Известно, что большое количество несовершенных грибов представляет собой стадию развития сумчатых, реже базидиальных грибов (гаплоидную стадию) [Курсанов, 1940]. Однако для огромного количества несовершенных грибов связи между ними и аскомицетами не установлено. Не исключено, что в процессе эволюции многие несовершенные грибы (аскомицеты, базидиаль-ные) полностью утратили способность развивать высшие спороношения [Ячевский, 1933]. Доказательством этого может служить тот факт, что многие несовершенные грибы, для которых связь с диплоидными стадиями доказана, телеморфную (сумчатую) стадию дают чрезвычайно редко, но широко распространены в анаморфной (конидиальной, гаплоидной) стадии, а также другой менее известный факт, что сумчатые стадии нередко занимают намного меньший ареал, чем их конидиальные стадии [Наумов, 1940]. Примером такого явления и служит гриб М phaseolina. Некоторые исследователи считают, что роль высшей формы спороношения, в данном случае сумчатой, в распространении и сохранении вида становится все более незначительной, и что сумчатая и пикнидиальная стадии находится на пути к исчезновению [Фробишер, 1965].
Название конидиальной стадии имеет подчинённое значение, но система несовершенных грибов сохраняется и даже совершенствуется. В целом, классификация несовершенных грибов искусственна, хотя многие исследователи несколько приближают системы несовершенных грибов к естественным [Ячевский, 1933; Наумов, 1940; Пидопличко, 1977].
По данным В. Б. Енкена, пепельная гниль сои иногда определяется1 без должных, оснований как склероциальное увядание, возбудителем которой является Sclerotiwn bataticola. В 1939 и 1947 годы во Всесоюзном институте защиты растений в обоих случаях в качестве возбудителя указывалась Масго phomina phaseolina — гшкнидиальная стадия Sclerotium bataticola [Енкен, 1959].
В 70-80 годы XX века возбудитель пепельной гнили в классификации М. В. Горленко был отнесён к классу Deuteromycetes (несовершенные), порядок Mycelia sterilia, род Sclerotium. Фитопатологами М. Е. Вагг и F. L. Hawkworth гриб также был отнесён к несовершенным в следующей редакции таксономии: отдел Eumycota, подотдел Deuteromycotina, класс Coelomycetes, вид Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. В современных зарубежных источниках в настоящее время можно обнаружить совсем другую классификацию гриба: царство Fungi, отдел Ascomycota, класс Dothideomycetes, Incertae sedis, порядок Botryos-phaeriales, семейство Botryosphaenaceae, вид Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. [Barr, 1987; Горленко, 1991; Hawkworth, 2004; Index Fungorum, 2009].
Климат и погодные условия
Грибы представляют одну из самых многочисленных и филогенетически самостоятельных групп организмов, уступающую по численности лишь насе комым. В почве до 90 % биомассы всех микроорганизмов и беспозвоночных животных составляют грибы [Whittaker, 1969; Дьяков, 1997; Deshmukh, Rai, 2005]. По современным палеонтологическим данным возраст грибов насчитывает не менее миллиарда лет. Хотя по новейшим данным сравнительной гено-мики предполагается, что грибы отделились от простейших еще раньше — около полутора миллиардов лет назад, а разделение на высшие и низшие грибы произошло не позже, чем миллиард лет назад [Наговицин, 2008].
Первые классификации грибов и попытки определения их систематического положения предпринимались еще в IV веке до новой эры древнегреческим учёным Теофрастом, и в I веке новой эры древнеримским натуралистом Плинием Старшим (Гай Плиний Секунд) [Чистовский, 2008]. Однако таксономическое положение грибов в системе организмов так и не поддавалось определению на протяжении почти двух тысячелетий. Даже-Карл Линней при создании своей «Системы природы» (System naturae) так и не смог найти систематическое положение для грибов [Linnaeus, 1735].
Действительно, грибы имеют ряд общих признаков, как с растениями, так и с животными. Как и у растений, у грибов имеется хорошо выраженная клеточная стенка, состоящее из гиф тело грибов представлено в вегетативном состоянии, оно неподвижно, адсорбция питательных веществ происходит из раствора субстрата.
Схожесть грибов с животными определяется образованием мочевины в процессе метаболизма, в качестве запасных питательных веществ образуется гликоген, в клеточных стенках содержится хитин, питательные вещества поглощаются в готовом виде [Дьяков, 1997; Отличие грибов от растений ..., 2009]. Только в середине XIX века Эрнстом Геккелем впервые было определено место грибов в системе живых организмов, которые наравне с бактериями, водорослями и одноклеточными животными- были включены в новое царство Протистов или простейших [Margulis, 1974; Красильников, 2004; Систематика органического мира, 2009].
В 1969 г. Р. Г. Виттейкером (Whittaker, 1969) была предложена более совершенная система живых организмов, состоящая из пяти царств. Из царства растений он впервые выделил грибы в самостоятельное царство. Одним из основных критериев, по которым Виттейкер выделил грибы из растений, был особенный, только им присущий способ питания - осмотрофный или микотрофный [Whittaker, 1969].
В отличие от растений, питающихся автотрофно (фототрофно) - организмов, синтезирующих из неорганических веществ необходимые для жизни органические вещества, а также животных, питающихся зоотрофно, то есть поедающих другие организмы или продукты их метаболизма, грибы питаются, поглощая питательные вещества из окружающей среды. Кроме этого грибы вместе с животными и некоторыми бактериями отнесены к категории гетеро-трофов - организмов, которые сами для себя не могут синтезировать все жизненно необходимые продукты- обмена веществ, а получают их извне. В настоящее время принято относить грибы к гетеротрофным эукариотическим организмам, но обладающим осмотрофным способом питания, обеспечивающим поглощение необходимых питательных веществ из окружающей среды всей поверхностью [Вертьянов, 2001; Домарадский, Градов, 2007].
Ещё одной особенностью всех представителей царства Грибы является специализация их ферментативного аппарата на разложение углеводов, что объясняет приспособленность большинства грибов-паразитов, симбионтов и сапротрофов к осмотрофному питанию, прежде всего, клеточным соком или гидролизированными тканями хозяев [Дьяков, 1997].
Для эффективного поступления растворённых в воде низкомолекулярных органических веществ в мицелий из внешней среды в клетках грибов создаётся высокое тургорное давление [Попкова, 1979; Расселл, 1982; Дьяков, 1997].
Все особенности осмотрофного питания полностью справедливы и для патогенных паразитических грибов, поражающих современные культурные растения [Тарр, 1975; Расселл, 1982]. Кроме этого, обязательным условием воздействия многих патогенных грибов на растение является их способность синтезировать токсические вещества, способствующие развитию патогена в тканях [Рубин, Арциховская, 1968; Билай, Гвоздян, Скрипаль, 1988].
Развитие грибных болезней растений, как правило, сопровождается изменениями физико-химических свойств протоплазмы. Одной из характерных сторон этих изменений является увеличение проницаемости прилегающих к мицелию слоев плазмы, выражающееся в увеличении экзоосмоса неорганических солей и органических соединений из клеток вовнутрь гиф гриба, а также в снижении осмотического давления клеточного сока растений. Именно способность выделять в окружающую среду вещества, влияющие на увеличение проницаемости протоплазмы клеток растения-хозяина, является важным адаптивным свойством грибов-паразитов, обеспечивающим им возможность легко использовать питательные вещества, находящиеся в клетках растения-хозяина [Рубин, Арциховская, 1968; Котляров, 2006].
Вто же время исследований физиологических аспектов осмотрофного способа питания грибов в системе патоген - растение-хозяин крайне мало, а имеющиеся сведения скудны и фрагментарны. Это не позволяет эффективно управлять важнейшим механизмом жизнедеятельности грибов - осмотрофным питанием с целью защиты культурных растений от грибной патогенной ми-кофлоры. В немалой степени это связано с тем, что наибольшее внимание в борьбе с грибными болезнями возделываемых культур уделялось агротехническим, химическим, биологическим и селекционным методам. Различные сочетания этих методов, с учётом роли природных регулирующих факторов, а также экологической, экономической и токсикологической целесообразности применения пестицидов позволяют, в целом, обеспечить достаточную защиту культурных растений от патогенных грибов [Черемисинов, 1973; Dhingra, Sinclair, 1977; 1978; Горленко, 1980; Расселл, 1982; Вавилов, 1986; Билай, Гвоздян, Скрипаль, 1988; Sinclair, Backman, 1989; Ndiaye, 2007].
Распространённость и развитие пепельной гнили на сое
Окраска поперечных срезов в прикорневой части стебля визуально здоровых растений в фазу полного созревания имеет светло-жёлтую окраску (рис. 3.9). Кора плотно прилегает к древесине, эпидермис коры не отслаивается. Сосуды ксилемы и радиальные лучи свободны от посторонних включений. Сердцевина стебля заполнена губчатой паренхимой, иногда с воздушными полостями, прилегающими к внутренней части древесины.
Анатомические исследования поперечных срезов поражённых растений сои показали, что симптомы поражения пепельной гнилью не ограничиваются поверхностными изменениями. При раннем и сильном поражении пепельной гнилью ткани древесины у таких растений обесцвечиваются. На поперечном срезе видно, что просветы многих сосудов закупорены микроскле-роциями (рис. 3.10). Из-за обилия расположенных ниже поверхности среза и слегка просвечивающих микросклероциев, древесина приобретает сероватый оттенок. Рыхлая паренхима сердцевины, как правило, разрушена. Последними на поражённом растении погибают флоэма и ткани коры.
Поперечный срез нижней части поражённого пепельной гнилью стебля сои, х20, (ориг.) При проявлении симптомов болезни на растениях в фазе физиологического созревания, ткани древесины могут не обесцвечиваться.
Анатомические исследования созревших растений сорта сои РВБ, выращенных в условиях 2007 года, позволили установить, что наибольшее количество микросклероций локализовано во внутренней части коры, прилегающей непосредственно к древесине (рис. 3.11а). При этом кора за исключением эпидермиса оказалась практически полностью разрушенной, что указывает не только на склероциеобразующую активность гриба, но и на ферментную активность токсина патогена.
Большое количество микросклероциев также было обнаружено в тканях древесины. В этих тканях микросклероций формировались преимущественно в сосудах ксилемы, полностью их закупоривая. Вследствие прекращения поступления воды из корневой системы ткани древесины вокруг закупоренных сосудов отмирали и обесцвечивались (рис. 3.116).
Наличие микросклероций на внутренней поверхности древесины, примыкающей к сердцевине, свидетельствует о развитии мицелия гриба и в этой части стебля (рис. 3:11 в). Полное разрушение рыхлой сердцевины также указывает на наличие токсина гриба и его ферментную активность. Во всех тканях размеры микросклероций были одинаковыми и в среднем составляли 50-75 мкм. Микросклероций аналогичного размера формируются на свободно растущем мицелии гриба на среде Чапека в чашках Петри (рис. 3.11 г).
В целом, наши исследования показали наличие микросклероциев М. phaseolina во всех тканях стебля. Наиболее вредоносным представляется образование микросклероциев в древесине, которое вызывает закупорку сосудов ксилемы и приводит к нарушению водоснабжения и питания и, как следствие, к преждевременной гибели растений сои.
При исследовании поражённых тканей сои были обнаружены различные морфотипы микросклероциев (рис, ЗЛ2а-г). в г
Локализация микросклероциев в тканях стебля сои: а — микросклероции во внутренней части коры; б- микросклероции в древесине (отдельные микросклероции закупорили сосуды ксилемы), при поперечном разрезе стебля; в - микросклероции на границе между древесиной и сердцевиной (ткани сердцевины полностью разрушены грибом) при продольном разрезе стебля прикорневой части. г — образование микросклероциев в чистой культуре гриба на среде Чапека. Рисунок 3.12 - Морфотипы микросклероциев в тканях сои (ориг.): а - типичные сферические микросклероции во внутренней части коры, 0 = 50-75 мкм; б- «незрелые» микросклероции в древесине при продольном срезе, 0 = 50-75 мкм; в — цилиндрические микросклероции в ксилеме при продольном срезе, 0 = 25—75 мкм; г- нитевидные микросклероции гриба в радиальных пучках древесинны, 0 = 5-Ю мкм.
Наряду с типичными, ранее описанными другими авторами, сферическими микросклероциями диаметром 50-75 мкм (рис. 3.12а) в древесине на границе между поражённой и свободной от патогена тканью выявлены незрелые микросклероции, представляющие собой рыхлые коричнево-бурые образования типичного для макрофомины диаметра 50-75 мкм (рис. 3.126) В сосудистых пучках ксилемы, сформировался цилиндрический тип микросклероций с диаметром 25-75 мкм и длиной до 200 мкм (рис. 3.12в). Причиной формирования такой формы, по всей видимости, стали одревесневшие стенки сосудов ксилемы, не позволившие микросклероциям сформировать телам сферическую форму.
Кроме этого в древесине был обнаружен еще один ранее не описанный морфотип - нитевидные микросклероций (рис. 3.12г). Их диаметр не превышал 5-10 мкм, при этом длина могла достигать нескольких мм. Типичное место их локализации - тонкие радиальные пучки древесины, которые видны при продольном срезе стебля.
Микросклероций всех выделенных морфотипов быстро прорастали на питательных средах и давали типичный для гриба М. phaseolina мицелий.
В лабораторных условиях были изучены влияние температуры и. рН питательного субстрата на развитие гриба М. phaseolina. Для выделения возбудителя в чистую культуру, изучения морфологических признаков и хранения культуры использовали твёрдые органические среды: среда Чапека и картофельно-глюкозный агар (КГА).
Выделение в чистую культуру проводили путём помещения кусочка стебля с микросклероциями гриба в чашки Петри с питательной средой КГА или Чапека (рис. 3.13). Через 7 суток культивирования при температуре 27 С в термостате осуществляли пересев на свежую среду выросшего мицелия гриба М. phaseolina. Культивировали гриб 5-7 суток при той же температуре, получая таким образом чистую культуру гриба (рис. 3.14).
Ранее, при выделении из подсолнечника чистой культуры S. bataticola (син.: М. phaseolina), в описании А, С. Бондарцева [1954] и В. К. Неделько [1977] было отмечено, что мицелий гриба был стелющимся, высотой около 1 мм на КГА, а на среде Чапека он был воздушным, высотой около 5 мм.
Чистая культура гриба М. phaseolina (ориг.) В наших исследованиях таких отличий в особенностях роста мицелия возбудителя пепельной гнили сои на средах КГА и Чапека отмечено не было. В обоих случаях мицелий с равной скоростью заселял всю поверхность чашек Петри и одновременно формировал микросклероции. Мицелий гриба был стелющийся, высотой 0,7 мм, вначале пепельной окраски, затем пепельно-серый. Характер образования микросклероциев во всех случаях радиальный (от центра чашки Петри к периферии).
В. К. Неделько [1977] в своих исследованиях отмечала, что оптимальная температура для роста и развития гриба М. phaseolina, выделенного из ткани подсолнечника на питательной среде составляла 30-35 С. Для определения диапазона оптимальных температур для развития пепельной гнили, выделенной из сои, выращивание гриба проводили при различных температурных режимах: 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 С. Скорость роста гриба фиксировали ежедневно измерением диаметра колоний. Установлено, что в исследуемом диапазоне температур динамика роста мицелия подчиняется полиномиальной кривой. Максимальный прирост мицелия составлял 15,7 мм/сут. и отмечался в диапазоне температур от 25 до 30 С (рис. 3.15).
Инициация формирования микросклероциев пепельной гнили на начальных этапах онтогенеза сои
Критическим осмотическим давлением среды, при котором был зафиксирован минимальный прирост мицелия в эксперименте, оказался уровень 930 кПа, формируемый концентрацией ПЭГ-6000, равным 9,5 % (рис. 5.10 в).
Дальнейшее увеличение концентрации полиэтиленгликоля в среде до 10 % и выше, что соответствовало осмотическому давлению 1100 кПа и более, рост мицелия гриба прекращался полностью (рис. 5.10 г).
Аналогичные результаты были получены в трёх циклах выращивания мицелия гриба М. phaseolina на жидких средах Чапека в период 2007-2008 гг.
Таким образом, при изучении осмотического давления клеточного сока внутри мицелия возбудителя пепельной гнили было установлено, что рост гриба М. phaseolina прекращается при осмотическом давлении среды около 930 кПа. Такой уровень ОД среды нами был принят за критический уровень ОДКС исследуемого гриба, при котором ОДКС внутри и вне мицелия становится равной, а для патогена наступает физиологическая засуха и полностью прекращается рост мицелия. Дальнейшее увеличение ОД питательной среды является сверхкритическим для гриба и приводит к полной гибели мицелия.
Экспресс-метод определения осмотического давления клеточного сока в тканях растений сои Известные в физиологии методы определения осмотического давления клеточного сока, основанные на выдерживании высечек листовых пластинок в серии растворов с разной концентрацией осмотически активных веществ, оказались практически непригодны для решения поставленных в наших экспериментах задач. Эти методы, во-первых, были адаптированы под оценку ОДКС в клетках листьев и не позволяли определить ОДКС в тканях стеблей; во-вторых, на проведение одного анализа требовалось до 30 мин и набор из В связи с этим за основу полевого экспресс-метода был взят рефрактометрический анализ, основанный на методике Н. Н. Третьякова (1990), позволяющий определить ОДКС через концентрацию растворённых в клеточном соке веществ.
При помощи ручного пресса получали клеточный сок из каждого образца. На рефрактометре определяли показатель его преломления с учётом температурного коэффициента (рис. 6.1). Затем по разработанной на основе справочных таблиц Н. Н. Третьякова эмпирической формуле 4 (см. лава 2) находили величину осмотического давления, соответствующую найденной концентрации клеточного сока.
Ручной пресс для полевого экспресс-метода был специально изготовлен в мастерских отдела механизации ВНИИМК. За основу была взята стандартная конструкция бытового ручного пресса для чеснока. Однако общие размеры пресса и длина рычагов были увеличены в два раза. Также был увеличен объём прессовой камеры (рис. 6.2).
Хронометраж времени показал, что на выполнение первых четырёх этапов при определении концентрации клеточного сока в одном сортообраз-це требуется не более 3-5 мин. Таким образом, используемый экспресс-метод позволяет за 4 часа в поле определить ОДКС 40-50 сортообразцов.
Суточный ритм осмотического давления клеточного сока в растениях сои Следующим этапом реализации гипотезы осмотически зависимого образования микросклероциев у пепельной гнили явилась разработка метода контроля концентрации клеточного сока в тканях растений в критические для проявления болезни фазы онтогенеза. Известные из литературы, а также полученные в наших исследованиях экспериментальные данные (см. главы 3 и 5) свидетельствуют о зависимости образования микросклероциев от внешних условий, прежде всего, от окружающей температуры и содержания влаги питательным субстратом.
В полевых условиях массовое формирование микросклероциев в тканях сои контролируется концентрацией клеточного сока растения-хозяина. В свою очередь, на уровень ОДКС тканей сои большое влияние должны оказывать температура окружающей среды и объём запасов влаги в почве. Повышение температуры воздуха, особенно в условиях засухи, должно способствовать усилению транспирации воды из сои, и, следовательно, повышению концентрации клеточного сока. Причем, в зависимости от удалённости различных частей растений от корневой системы с одной стороны, и приближённости тканей к испаряющим органам - с другой- стороны, степень овод-нённости тканей может быть различна. Очевидно, что суточные колебания температур воздуха также будут оказывать некоторое модифицирующее влияние на ОДКЄ тканей сои.
Поэтому первым обязательным этапом разработки метода контроля ОДКС в тканях сои стали исследования суточного ритма колебаний концентрации клеточного сока. Для этого во второй декаде июля (16.07) в течение полных суток оценивали ОДКС в тканях нижнего, среднего и верхнего ярусов растений раннеспелого сорта Лира и среднеспелого хорта Парма. Интервал между определениями ОДКС - 3 часа.
В день проведения эксперимента минимальная температура воздуха в 6 часов утра составила 21,4 С (рис. 6.6). В это же время-относительная влажность воздуха была максимальной и составляла 43 %. По мере восхода солнца и прогревания воздуха температура возрастала и впериод 15-16 ч достигла суточного максимума 33,6 С, относительная влажность воздуха в это время была минимальной и составила 24 %.
Анализ данных ОДКС в разное время суток показал их существенную зависимость от температуры воздуха (табл. 6.1). Минимальные значения ОДКС тканей (510-540 кПа) были отмечены в ночные и утренние часы на фоне минимальной температуры и максимальной относительной влажности воздуха. При этом максимальные значения ОДКС (950 кПа) были установлены в 15 ч дня на фоне максимальной температуры и минимальной влажности воздуха.
Коэффициент корреляции Пирсона между суточной динамикой температур воздуха и ОДКС тканей нижнего, среднего и верхнего ярусов растений составил 0,57, 0,74 и 0,73 соответственно.
Увеличение зависимости ОДКС тканей среднего и верхнего ярусов растений от температуры объясняется удалённостью от корневой системы и развитой листовой поверхностью этих частей растений, активно испаряющих влагу. Подтверждением этого вывода служит высокая отрицательная корреляция между ОДКС верхнего яруса растений и относительной влажностью воздуха, составившая г = -0,82. При этом корреляция между ОДКС тканей нижнего яруса и относительной влажностью воздуха, из-за близкого расположения подающей воду корневой системы составила всего г = -0,33.
Среднее значение ОДКС у сорта Лира по результатам суточного определения составило 686 кПа. Этот уровень оказался ниже критических значений ОДКС для возбудителя пепельной гнили (930 кПа), и в целом, не провоцировал массовое формирование микросклероциев. Только на фоне максимальных значений дневной температуры, составившей в послеобеденный период (15-16 ч) в этот день 33,6 С, ткани среднего яруса растений незначительно превысили критические значения ОДКС гриба и составили 950 кПа.
