Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Грибы - возбудители болезней зерновых культур в различных регионах России 7
1.2. Видовое разнообразие и географическое распространение грибов рода Trichoderma 24
1.3. Систематическое положение грибов рода Trichoderma 30
1.4. Механизмы антагонистического действия грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных возбудителей болезней 40
1.5. Применение грибов рода Trichoderma в борьбе с фитопатогенными грибами 44
Глава 2. Объекты и методы исследований 50
2.1. Выделение и идентификация фитопатогенов 52
2.2. Определение фитотоксичности 55
2.3. Выделение и идентификация грибов рода Trichoderma 55
2.4. Взаимоотношения грибов рода Trichoderma с фитопатогенными грибами 57
2.5. Биологический контроль возбудителей корневых гнилей зерновых культур 59
Глава 3. Результаты исследований 61
3.1. Видовое разнообразие фитопатогенных видов грибов в Иркутской области 62
3.2. Культурально-морфологические свойства фитопатогенов, вызывающие корневые гнили 74
3.3. Влияние метаболитов фитопатогенных грибов на прорастание семян пшеницы 83
3.4. Видовое разнообразие грибов рода Trichoderma 86
3.5. Культурально-морфологические признаки грибов рода Trichoderma 89
3.6. Антагонистические и антибиотические взаимоотношения грибов рода Trichoderma с фитопатогенными грибами 99
3.7. Биологический контроль фитопатогенных возбудителей болезней , 115
Выводы 129
Список литературы 130
Приложение
- Грибы - возбудители болезней зерновых культур в различных регионах России
- Выделение и идентификация фитопатогенов
- Видовое разнообразие фитопатогенных видов грибов в Иркутской области
Введение к работе
При выращивании сельскохозяйственных культур складываются благоприятные условия для развития и накопления фитопатогенов. Фитопатогенные грибы являются возбудителями целого ряда болезней, таких как корневые, белые и серые гнили, различного рода пятнистостей, аскохитозов и фузариозов многих сельскохозяйственных растений. Фитопатогенные грибы способны поражать все органы растений, начиная с ранних этапов развития растений. Кроме того, фитопатогены могут быстро размножаться и сохраняться длительное время в почве в виде хламидоспор, склероциев и обрывков мицелия. Почва является одним из основных источников передачи инфекции во времени И в пространстве. Сведения о видовом разнообразии и распространении фитопатогенных микромицетов в почвах сельскохозяйственных угодий в Восточной Сибири немногочисленны, а ежегодные потери урожая зерновых культур значительны. Массовые вспышки болезней регистрируются из года в год. В 2003 году средний процент поражения фитопатогенными грибами по Иркутской области составил 33,9 %. В отдельных районах области процент заражения фузарнозом достигал 43 %, а гельминтоспориозом до 99 % (на ячмене) и 34 % на пшенице (Рекомендации по защите сельскохозяйственных культур..., 2004).
Регулирование распространения патогенов осуществляется в основном при помощи химических препаратов, применение которых приводит к загрязнению окружающей среды и возникновению резистентных изолятов в популяции патогенов, что приводит к нарушению экологического равновесия в ризосфере и ризоплане растений.
Одним из важных направлений по ограничению численности фитопатогенов, наносящих огромный урон сельскому хозяйству, является разработка биологических препаратов, позволяющих отказаться или снизить использование пестицидов, которые не обладают избирательным спектром действия и зачастую уничтожают не только патогенную микрофлору, но и грибы-антагонисты.
Биологические методы защиты растений основаны на естественных регуляторных механизмах и они являются наиболее приемлемыми с точки зрения охраны биосферы. Одним из направлений биологического метода является использование грибов-антагонистов для борьбы с фитопатогенными грибами и бактериями. Известно, что биологические препараты на основе штаммов-антагонистов рода Trichoderma Pers.: Fr. позволяют не только регулировать численность фитопатогенных микроорганизмов, но и способствуют оздоровлению почв. В основе механизма действия грибов рода Trichoderma лежит явление природного антагонизма, а также способность грибов этого рода продуцировать антибиотические вещества, под действием которых происходит угнетение фитопатогенных возбудителей болезней. Поиск новых штаммов грибов-антагонистов становится всё более актуальным. Важно учитывать и природно-климатические условия нашего региона, так как известно, что сибирская популяция фипопатогенов является наиболее агрессивной по сравнению с теми же видами из других географических регионов (Чулкина, 1985). Поэтому необходимо выделять и проводить исследования активных сибирских штаммов-антагонистов грибов рода Trichoderma в отношении возбудителей наиболее значимых болезней зерновых культур, поскольку исследования в Восточной Сибири отсутствуют.
Цель работы: изучение биоэкологических особенностей грибов рода Trichoderma в отношении возбудителей корневых гнилей зерновых культур.
Задачи исследования:
Определение видового состава и географического распространения фитопатогенов в различных хозяйствах Иркутской области.
Изучение культурально-морфологических особенностей фитопатогенов, вызывающих корневые гнили.
Выявление видового состава и географического распространения грибов рода Trichoderma в почвах Восточной Сибири.
Определение влияния метаболитов фитопатогенных грибов на прорастание семян пшеницы.
*
$
5. Выявление штаммов, обладающих наибольшей антагонистической и
антибиотической активностью в отношении фитопатогенных возбудителей
болезней.
6. Изучение влияния активных штаммов грибов рода Tnchodeima на патогенез
и стимуляцию прорастания зерновых в лабораторных условиях.
7. Оценка биологической эффективности наиболее активных штаммов-
антагонистов в отношении фитопатогенных возбудителей.
Грибы - возбудители болезней зерновых культур в различных регионах России
Огромный ущерб сельскому хозяйству наносят болезни, вызываемые фйтопатогенными грибами. Они составляют большое количество возбудителей наиболее значимых болезней (Хацкевич, Нестеров, 1994; Назарова, Жемчужина, 2002; Монастырский, 2003; Овсянкина, 2004; Жалиева, 2005; Clark, 1990; Summerell, 1990).
В последние десятилетия общие мировые потери зерновых составляют 34,9 % от потенциального урожая сельскохозяйственных культур (Череменский, 1987; Ахтамов, 1990).
К широко распространённым и вредоносным болезням зерновых культур относят корневые гнили. Их ареал распространения часто совпадает с ареалом возделывания этих культур (Чулкина, 1985; 1991; Рекомендации по защите сельскохозяйственных культур ...., 2003; 2004). Потери урожая яровой пшеницы от возбудителей корневых гнилей могут достигать в среднем 15 %, а в отдельные годы превышать 25-50 % (Кузьмичев Соколова, Фиссюра, 1993; Тютерев, 2005).
По данным фитосанитарной оценки семян зерновых культур, проведённой на Федеральной государственной территориальной станции защиты растений Иркутской области в 2002-2004 году, установлено, что весь посевной материал под урожай 2002-2004 года инфицирован возбудителями корневых гнилей: гельминтоспориозной, фузариозной и альтернариозной. Большая инфицированность зерна и почвы фйтопатогенными грибами, а также низкие объёмы протравливания семян и неустойчивые погодные условия обусловили повсеместное распространение корневых гнилей в 2002, 2003 и 2004 году (Отчёт ФГУ СТАЗР за 2002 год и прогноз развития вредителей и болезней сельскохозяйственных культур на 2003 год; отчёт ФГУ СТАЗР за 2003 г....; отчёт ФГУ СТАЗР за 2004 год и прогноз развития вредителей и болезней на 2005 год).
Возбудители корневых гнилей относятся к классам низших грибов. Дня них характерны различные паразитические свойства (Чулкина, 1991; Билай, Гвоздяк и др., 1988; Новотельнова, Пыстина, 1978; Чумаков, Ишкова, 1993). Диагностические признаки разных видов патогенных грибов детально описаны в литературе (Чумаков, Минкевич, Власов и др., 1974; Билай, 1977; Бенкен, Коршунова и др., 1977; Квашнина 1979; Nelson, Hoitink, 1983; Билай, Курбацкая, 1990; Watanabe, 1994).
В Сибири основная роль в патогенезе принадлежит грибам рода Fusarium Lk. et Fr., Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker = Helminthosporium sativum Pammel, King et Bakke, которые относятся к классу несовершенных грибов (Deuteromycetes), порядка Hyphales, а также другим патогенам: Alternaria Nees ex Fr., Cladosporium Link, Verticillium Nees ex Wallroth., Botrytis Mich., Sclerotinia, Щ Rhizoctonia D.C. ex Fr.
Грибы рода Fusarium вызывают болезни колоса и зерна, корневую гниль, отмирание продуктивных стеблей в Сибири, Ростовской области, на Украине, в центральных районах России, в азиатской части России, на северо-западе России (Квашнина, 1979; Иващенко, Шипилова, Нефедова и др., 1997; Иващенко, Шипилова, Левитин, 2000; Иващенко, Шипилова, Кирцидели, 1997), на территории Белоруссии (Буга, 2005), Воронежской области (Сидорова и др., 1992). Грибы этого рода являются возбудителями корневых гнилей яровой пшеницы в различных эколого-географических зонах Башкирии (Бенкен, Жукова, Ї974), а также возбудителями фузариоза озимой ржи на территории Башкирии (Гарифуллина, Долгова, 1996) и в Нечерноземной зоне России (Жохова, Назарова, 1994).
Определённые закономерности имеются в распространении грибов рода Fusarium. В восточной части Западно-Сибирской равнины наиболее распространены виды секции SporotricMella, такие как F. sporotrichoides Sherb., F. роае (Peck) Wr., F. tricinctum (Cda) Sacc, доминирующими видами считают F. avenaceum (Fr.) Sacc, F. acuminatum (EH. et Evenh.) Booth., F. equiseti (Corda) Sacc. 1 Следует отметить схожесть видового состава характерного для лесостепи и степи Западно-Сибирской равнины. Доминирующее положение занимают виды F. moniliforme Sheldon., F. sporotrichoides и F. avenaceum. В центральной части Западно-Сибирской равнины наиболее распространены виды F. avenaceum, F. роае, F. equlseti, F. culmorum (W. G. Sm.) а также доминируют виды F. momllforme и F. sporotnchoides. Наименьшее количество видов представлено на юго-востоке Среднесибирского плоскогорья (Иркутская область), где имеют распространение 2 вида секции Discolor - F. sambucinum Fuck, и F. heterospomm Ness: Fr. (Иващенко, Шипилова, Левитин, 2000).
Грибы рода Fusarium способны вызывать различные патологические явления: гниль корней, семян, плодов и преждевременное увядание растений (Цветкова, Симон, 1994; Шешегова, 2002; Левитин, Тютерев, 2003). Тип проявления болезни зависит, с одной стороны, от видовой принадлежности патогенов, а с другой — от экологических условий, в которых они развивались (Горленко, 1976; Чумаков, Ишкова, 1993), а также от локализации возбудителя в тех или иных органах растений-хозяев и от восприимчивости различных органов и тканей к инфекции (Билай, 1988; Чулкина, 1991).
Грибы родов Cochliobolus и Fusarium поражают различные полевые культуры.
В литературе имеются сведения о сильных эпифитотиях многих сельскохозяйственных культур, таких как ячмень, сахарный тростник и кукуруза (Pringle, 1977; Никуленко, Чкаников, 1987). Опасными также являются скрытые формы инфекции грибов рода Fusarium у дикорастущих злаков (Jenkmson, Perry, 1994). По сведениям Н. М. Алпатьева и 3. И. Шестипёровой (1981), грибы рода Fusarium являются возбудителями болезней люцерны, вследствие чего происходит увядание до 22 % растений, преимущественно на посевах первого года жизни. Частота встречаемости видов варьировала: в южных районах более 90 % составлял F. oxysporum Schlecht.; в центральной части - F. oxysporum, F. culmorum, F. solani (Mart.) Appel. et Wr., F. avenaceum. По данным H. H. Гусевой с соавторами (1991), развитие фузариозной инфекции нарастает к августу, к октябрю - снижается. При смешанной инфекции фузариозной и вертициллёзной происходил больший процент поражения растений.
Выделение и идентификация фитопатогенов
Выделение фитопатогенных грибов проводили из поражённых растений и из почвы и ризосферы зерновых культур. Выделение фитопатогенов является сложным процессом, так как большинство из них не растут на обычных питательных средах (Чапека, сусло-агар). Поэтому при выделении фитопатогенов использовали различные селективные питательные среды (Чекаников, Соколова, 1997). Для выделения и определения грибов рода Fusarium использовали картофельный агар с 2-5 % декстрозы, кислый картофельный агар (для спороношения), для пигментирования - рис, ломти картофеля (Спесивцева, 1964).
В нашей работе для выделения фитопатогенных грибов использовали методику В. И Билай (1977). Стебли, листья и колосья каждого образца дезинфицировали помещением их в 70 % - й раствор спирта на 5-8 минут, затем тщательно промывали проточной водой. Каждое продезинфицированное растение делили на несколько частей и раскладывали по чашкам Петри с увлажнённым стерильным фильтром. Затем чашки Петри помещали в термостат при температуре 23-25 С для дальнейшего прорастания мицелия.
Для выявления скрытой заражённости зерна фитопатогенами проводили поверхностную дезинфекцию зёрен в растворе спирта — ректификата 70 % , продезинфицированные зерна раскладывали на поверхность агара.
Степень глубинного поражения зерна определяли ориентировочно, выводя процентное соотношение выросших колоний каждого гриба к общему количеству посеянных зёрен.
Для определения видов и дальнейшего изучения грибов проводили выделение их в чистую культуру, пересевом в чашки или пробирки с агаром Чапека или на другие среды на которых развивается спороношение и пигментация колоний.
Культурально-морфологические признаки фитопатогенных грибов изучали при высеве их на сусловый агар.
Определение фитопатогенов вели в соответствии с диагностическими признаками, описанными в работах Т. Watanabe (1994), Н.М. Пидопличко (1977), МЛ. Литвинова (1967), В.И. Билай (1977), З.А Курбацкой и В.И. Билай (1990), Nelson eta!., (1983).
Образцы почвы исследовали в лаборатории методом почвенных разведений (Звягинцев, 1990; Сэги, 1983). Полученную почвенную суспензию рассевали на чашки Петри со средой Чапека с добавлением 0, 1 г Zn S04 и 0,1 г KI или средой Билай. Инкубацию проводили при температуре 23-25 С в течение 7-10 суток. Бактерии, использующие органические формы азота, учитывали на мясопептонном агаре (МПА).
Детальное изучение строения конидиеносяого аппарата, макро - и микроконидий проводили в микрокамерах Пешкова. В связи с тем, что грибы ,» быстро используют питательный субстрат (в капле среды), происходило типичное спорообразование у разных видов грибов уже в пределах 72 часов. При непосредственной микроскопии представлялось возможным проследить развитие гриба от прорастания конидий до их образования.
Среду Билай использовали для культивирования фузариев. На этой среде наблюдали обильное спорообразование, а также на ней производили разделение и очистку культур.
Грибы рода Verticillium: Минимальная среда (г/л): КН2Р04 - 1,4, КНР04 - 1,7, Na2S04 - 3,2, Ca(N03)2 4Н20 - ОД, KN03 - 4,6, Mg S04 7Н20 - 0,7, NaCl - 0,5, сахароза - 20, 0, агар - 20,0, дистиллированная вода - 1 литр. Добавляли по 1 мл растворов (г/л): ZnS04 х7Н2О-1,0, МпС12х4Н2О-1,0, Н3ВОз-1Д Fe С13 х 6Н20 - 0,5, Си S04 х 5Н20 - 0,1, KI - 0,1, Na2Mo04 х 2Н20- 0,1 (Francl et al., 1988).
Изучение возбудителей болезней растений проводили внешним осмотром больных растений, отмечая появление различных пятен, потемнений, продольных полос, пустул на поверхности листьев, стеблей и других органов с последующим выделением возбудителей в чистую культуру. Для изучения возбудителей болезней использовали практикум по сельскохозяйственной фитопатологии под редакцией В. К. Попковой (Попкова, 1976).
Статистическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности различий проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 97 и Statistica 6.0.
Видовое разнообразие фитопатогенных видов грибов в Иркутской области
Были проведены исследования проростков зерновых культур (овса, ячменя, пшеницы) в различных хозяйствах Иркутской области: ОАО «Хомутовское», в Черемховском районе (2003 год), в ОАО «Мамоны», ОАО «Барки», ОАО «Хомутовское», ОАО «Сибирская Нива» (2004 год) и выделены потенциально опасные виды грибов, вызывающие корневые гнили.
Значительное влияние на развитие корневых гнилей оказывали природно-климатические условия. Исследования проводили в период с 2003 по 2004 год, Весна 2003 года была очень ветренной, сухой, с аномально редким похолоданием во второй декаде апреля и частыми интенсивными заморозками в третьей декаде мая. Во второй половине весны, когда ведутся посевные работы, осадки выпадали крайне редко и были неинтенсивными. Лето 2003 года: первая половина - высокая температура воздуха, интенсивный суховей, вторая половина
— большое количество осадков. Данные климатические условия повлияли на ухудшение состояния растений, наблюдалась потеря тургора, что способствовало развитию корневых гнилей и пустоколосости зерновых культур. Корневые гнили
- это заболевание в области имеет повсеместное распространение во всех районах возделывания зерновых культур. Первые признаки проявления болезни были отмечены на проростках с седьмого июля.
Результаты исследований видового состава фитопатогенных грибов встречающихся на заражённых зерновых культурах представлены в таблице 1-6.
При изучении видового состава грибов рода Fusarium на злаках в Азиатской части России В. Г. Иващенко с соавторами (2000) описано 14 видов рода Fusarium. Авторы указывают на небольшое видовое разнообразие грибов этого рода в Иркутской области, что согласуется с нашими данными, но по видовой представленности имеются значительные отличия. Согласно результатам, полученным в период наших исследований, наибольшее количество выделенных изолятов принадлежало грибам рода Fusarium. Из них преобладали F. moniliforme — 31 изолят, а также F. oxysporum — 19 изолятов. Потенциально неопасными следует считать виды F. nivale и F. graminearum, так как они редко выделялись из поражённых злаковых. Из почвы и ризосферы преимущественно выделялись Р. ф expansum, P. chrysogenum, A. niger, A. flavus и Mucor species. Изоляты V. falcatum выделялись как из вегетативных органов, так и из почвы, ризосферы, Представители других фитопатогенов выделялись реже: число их изолятов составляло 9,2 %.
Данные, приведённые в таблице 2, свидетельствуют о высоком содержании грибов рода Fusarium - до 45 %, преобладали F, moniliforme, часто встречались F. oxysporum. По данным исследований А. Ш. Шералиева с соавторами (2001; 2002), эти виды являются доминирующими в условиях Узбекистана и преобладают в почвах агрофитоценозов и высокогорных поясов Чаткальского горно-лесного заповедкика. Виды F. moniliforme и F. oxysporum были выявлены во всех обследованных регионах, несмотря на совершенно различные почвенные и климатические условия. Исследователи также отмечают, что вид F. moniliforme является новым для микобиоты Узбекистана.
Второе место после Fusarium, по количеству выделенных изолятов, занимали грибы рода Verticillium. Изоляты С. brevi -compactum чаще выделялись из почвы и ризосферы, чем из вегетативных органов.
