Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Химический состав древесины 12
1.1.1. Целлюлоза 13
1.1.2. Гемицеллюлозы 15
1.1.3. Лигнин 16
1.2. Типология гнилей на основе химических изменений при ксилолизе.. 18
1.2.1. Деградация 20
1.2.2. Деструкция 21
1.2.3. Коррозия 23
1.3. Механизм разрушения лигнина 27
1.4. Значение ксилолиза в лесных экосистемах 30
1.5. Применение ксилолитических процессов в биотехнологиях 32
1.6. Заключение 38
Глава 2. Программа и методика исследований 39
2.1. Программа 39
2.2. Методика 40
2.2.1. Среды и субстраты 40
2.2.2. Подготовка образцов 41
2.2.3. Культуры 42
2.2.4. Заражение образцов древесины грибами 45
2.2.5. Обработка результатов по кинетике микогенного ксилолиза 46
2.2.6. Определение лигнина 48
2.2.7. Гидролиз мицелия грибов 51
2.2.8. Определение углеводов 52
2.2.9. Обработка результатов хроматографирования 55
2.2.10. Полевые исследования 57
Глава 3. Микогенное разложение древесины 58
3.1. Стадии ксилолиза 58
3.2. Ксилолиз образцов осины, грибами вызывающими делигнификацию 59
3.3. Ксилолиз образцов ели, грибами вызывающими делигнификацию 61
3.4. Ксилолиз образцов осины, грибами вызывающими коррозию 62
3.5. Обсуждение результатов 64
3.6. Параметры моделей ксилолиза 66
3.7. Обсуждение результатов 71
Глава 4. Микогенное разложение компонентов древесины 73
4.1. Разложение лигнина грибами, вызывающими коррозию и делигнификацию 73
4.1.1. Потери массы лигнина 73
4.1.2. Эскизные модели разложения лигнина 75
4.1.3. Обсуждение результатов 78
4.2. Разложение углеводов древесины грибами, вызывающими коррозию и делигнификацию 80
4.2.1. Расчет содержания моносахаридов в гидролизатах древесины 81
4.2.2. Разложение углеводов под действием P. sanguinea 16-65 84
4.2.3. Разложение углеводов под действием С. subvermispora L-14807 88
4.2.4. Разложение углеводов под действием грибов, вызывающих коррозию .91
4.2.5. Разложение древесины P. obovata под действием P. nigrolimitatus 94
4.2.6. Состав мицелия грибов Т. pubescens 5-08 и В. adusta 13-07 95
4.2.7. Обсуждение результатов 96
Глава 5. Распределение p. sanguinea на древесном детрите разных пород и размеров 100
Выводы 101
Список литературы
- Гемицеллюлозы
- Обработка результатов по кинетике микогенного ксилолиза
- Ксилолиз образцов осины, грибами вызывающими коррозию
- Разложение углеводов под действием P. sanguinea 16-65
Введение к работе
Актуальность темы. Большой интерес для науки и промышленности представляет уникальная группа ксилотрофных грибов (КТГ), вызывающих коррозию и делигнификацию древесины. От других грибов их отличает способность к синтезу оксидазных ферментов, позволяющих разрушать лигнин, являющийся наиболее устойчивым компонентом клеточной стенки [Головлева, Мальцева, 1986; Crawford, 1981; Kirk, Farrell, 1987; Cullen, Kersten, 2004]. Неспецифический характер действия и высокий окислительный потенциал этих ферментов позволяет использовать их для разрушения органических ксенобиотиков (диоксинов, пентахлорфенолов, полиароматических углеводородов), очистки сточных вод пищевых, текстильных и целлюлозно-бумажных фабрик [Bezalel et al., 1996; Eggen, Majcherczyk, 1998; Lamar et al., 1999; Raghukumar, Rivonkar, 2001]. В лесопромышленном комплексе ферменты лигнинразрушающих грибов можно использовать для биологической отбелки целлюлозы [Александрова, Медведева, 1999; Jasper et al., 1994], а также получения модифицированной древесины с заданными свойствами и древесностружечных плит [Кадималиев и др., 2001; Рабинович и др., 2001], не требующих применения синтетических смол. Древесные отходы лесопромышленного комплекса, прошедшие предварительный процесс ферментации, можно использовать в энергетике для получения этанола [Kim, Dale, 2004; Dashtban et al., 2009], а в сельском хозяйстве - для кормления домашних жвачных животных [Малышева и др., 1986; Albores et al., 2006]. Особый интерес представляют грибы, избирательно разрушающие лигнин с сохранением целлюлозного компонента древесины, получившие название биоделигнификаторов. Использование таких организмов может существенно изменить технологические схемы производства бумаги и целлюлозных полуфабрикатов, наносящие непоправимый ущерб природе [Соловьев, 1986; Kirk et al., 1997]. В этом направлении с 1985 г. в России интенсивно изучается Phanerochaete sanguined (Fr.) Pouzar [Соловьев и др., 1985], а за рубежом с 1990 г. - Ceriporiopsis subvermispora (Pilat) Gilb. et Ryvarden [Setliff et al., 1990].
Современная классификация грибов по типам гнили указывает на разные способы воздействия грибов на древесину - главнейший продукт леса, но о вкладе отдельного типа разложения в общий поток редукции органического вещества в лесных экосистемах известно мало. Поэтому необходимо детальное изучение грибов, вызывающих коррозию и делигнификацию, для выяснения их функции в лесных экосистемах, а также для всестороннего практического использования в биотехнологиях.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в сравнении особенностей разложения химических компонентов древесины под действием типичных лигнинразрушающих грибов, вызывающих два типа ксилолиза - делигнификацию (Ceriporiopsis subvermispora, Phanerochaete sanguined) и коррозию (Trametes pubescens (Schumach.) Pilat, Bjerkandera adusta (Willd.) P. Karst).
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Оценить потенциальную скорость разложения древесины КТГ.
Определить скорость и избирательность разложения лигнина под действием КТГ.
Уточнить особенности разложения углеводного комплекса древесины, главным образом ее гемицеллюлозной составляющей, в процессе микогенного ксилолиза.
4. Подобрать адекватные задачам методики определения компонентов древесины.
Научная новизна. Впервые проведено сравнение способности штаммов Ceriporiopsis
subvermispora L-14807 и Phanerochaete sanguinea 16-65, считающихся наиболее эффективными делигнификаторами, к избирательному разложению лигнина в древесине хвойных (на примере Picea abies) и лиственных (на примере Populus tremula) пород.
Получены данные по кинетике микогенного ксилолиза образцов и последовательности разложения компонентов древесины двумя группами КТГ - грибами, вызывающими делигнификацию (С. subvermispora L-14807, P. sanguinea 16-65) и коррозию (Т. pubescens 5-08, A adusta 13-07).
Показано, что избирательность разложения субстрата грибами-делигнификаторами предопределена не только особенностями организмов, но и особенностями лигноцеллюлозного субстрата. Впервые установлено, что интенсивная делигнификация древесины лиственных пород сопровождается активным потреблением ксилозы, входящей в состав глюкуроноксиланового гемицеллюлозного комплекса. Делигнификация ели, где содержание ксилозы в несколько раз меньше, идет менее интенсивно. При разложении осиновой древесины грибами, вызывающими коррозию, ксилоза потребляется одновременно с остальными компонентами, и, по-видимому, не представляет для них исключительной пищевой ценности.
Предложены модели для определения степени разложения лигнина в зависимости от времени или стадии ксилолиза древесины, которые могут быть использованы для расчета параметров разложения и других компонентов древесины.
Полученные данные, свидетельствующие о принципиальном отличии грибов, вызывающих коррозию и делигнификацию, уточняют типологию древесных гнилей и критерии их разделения.
Показано, что P. sanguinea неспецифичен к древесной породе и развивается преимущественно на мелком древесном субстрате.
Практическая ценность работы. Для качественной и количественной оценки углеводного состава древесины на разных стадиях микогенного ксилолиза был модифицирован метод определения ацетатов альдононитрилов моносахаридов.
Получены модели, позволяющие рассчитать потребление компонентов древесины КТГ в
зависимости от потери массы, а также от времени. Модели могут быть использованы для
контроля за биотехнологическими процессами при получении древесной массы, обогащенной
целлюлозой.
Показано, что P. sanguined 16-65 обладает всеми необходимыми свойствами для эффективного использования в биотехнологии для предобработки щепы с целью получения древесной массы, обогащенной целлюлозой.
Апробация работы. Результаты исследований неоднократно обсуждались на ежегодных научно-технических конференциях СПбГЛТА. Материалы работы доложены на конференции International Academy of Wood Science "Forest as a renewable source of vital values for changing world" (Санкт-Петербург, 2009), Всероссийской конференции молодых ученых "Молодые исследователи - регионам" (Вологда, 2009), IV Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ (в том числе 2 работы в издании из списка ВАК).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице, состоит из введения, 5 глав, выводов и 3 приложений. Список литературы включает 163 наименования, в том числе 113 на иностранных языках. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 22 рисунками.
Гемицеллюлозы
Лигнин встречается во всех высших растениях, кроме мхов и печеночников, и является вторым по распространенности биополимером на Земле, после целлюлозы [Kirk, Farrell, 1987]. Лигнин - аморфный, нерегулярный, гетероцепной, преимущественно ароматического строения полимер, представленный фенилпропановыми структурами, который выполняет инкрустирующую функцию в клеточной стенке [Adler, 1977; Kirk, Farrell, 1987]. Макромолекулы лигнина построены из фенилпропановых структур, обозначаемых Се-С3. В хвойных породах, филогенетически появившихся раньше лиственных, лигнин представлен гваяцилпропановыми структурными единицами (G-единицы), которые являются производными пирокатехина. В состав лигнина лиственных пород, кроме того, входят сирингилпропановые единицы (S-единицы), являющиеся производные пирогаллола [Никитин и др., 1978; Фенгель, Вегенер, 1988]. Таким образом, содержание метоксильных групп в лигнине хвойных пород составляет 15-16 %, в то время как лигнине лиственных оно доходит до 21 % [Rowell, 2005].
В соответствии с типом преобладающих структур лигнины хвойных пород относят к гваяцильным лигнинам, а лигнины лиственных пород к гваяцил-сирингильным. В состав обоих типов лигнина в небольшом количестве могут входить n-гидроксифенилпропановые единицы. Большое распространение такие структуры получили в однодольных растениях. Содержание лигнина в древесине лиственных пород колеблется в пределах 18-25 %, в то время как содержание лигнина в хвойных породах значительно выше - 25-35 % [Никитин и др., 1978; Оболенская и др., 1991].
Пропановые боковые цепи структурных единиц могут иметь различное строение в зависимости от содержащихся в них функциональных групп. Лигнины лиственных пород древесины имеют более сложное строение, чем хвойных. Структура лигнина лишена регулярности, характерной для многих других природных элементов. В отличие от полисахаридов в нем отсутствует единый тип связи между структурными единицами. Наоборот, для него характерно многообразие связей, в результате чего он имеет макромолекулы с высокой степенью разветвленности.
Лигнин с гемицеллюлозами образуют устойчивые химические связи, формируя лигноуглеводные комплексы. Полагают, что в срединной пластинке лигнин связан с арабинаном, галактаном и пектиновыми веществами, во вторичной стенке с глюкуроноксиланом в древесине лиственных пород и арабиноглюкуроноксиланом и галактоглюкоманнаном -в древесине хвойных пород. Поэтому в древесине лиственных пород содержатся в основном лигнин-ксилановые комплексы, а в древесине хвойных - лигнин-ксилановые и лигнин-маннановые. С целлюлозой лигнин химически не связан, но во время биосинтеза клеточной стенки, он может оказываться внутри микрофибрилл целлюлозы механическим путем [Азаров и др., 1999].
Сложная срединная пластинка у хвойных пород на 60-90 % состоит из лигнина. Однако этот слой тонкий и лигнин срединной пластики соответствует лишь небольшой части (15-30 %) общего его количества в клеточной стенке (см. рис. 1). У лиственных пород срединная пластинка менее лигнифицирована. Наибольшее количество лигнина находится во вторичной оболочке, где его доля у хвойных пород составляет 20-25 % массы слоя, а у лиственных пород 12-15 %.
Вариабельность в соотношении компонентов представлена не только в слоях клеточных стенок, но и в разных типах анатомических структур. Сосуды и волокнистые трахеиды отличаются высоким содержанием гваяцильного лигнина. Волокна либриформа, напротив, содержат больше S-единиц. Стенки паренхимных клеток в древесине хвойных пород по сравнению с трахеидами лигнифицированы в большей степени: массовая доля лигнина достигает 40- 44 %. У лиственных пород степень лигнификации стенок сосудов почти в два раза выше, чем у волокон либриформа, но в отличие от хвойных пород стенки паренхимных клеток лигнифицированы меньше, чем у волокон [Азаров и др., 1999; Baum et al., 2001; Schwarze, 2007]. Лигнин инкрустирует полисахариды и создает непроницаемый защитный барьер для микроорганизмов. Только грибы-ксилотрофы способны преодолеть лигниновый барьер и разложить полисахариды (целлюлозоразрушающие грибы), а многие из них способны разложить также и лигнин (лигнинразрушающие грибы). Биологическое разложение лигнина -ключевой процесс в круговороте веществ в лесу.
Разрушение древесины в естественных условиях является длительным и многостадийным процессом, протекающим со сменой многих групп организмов. Фрагментацию древесины, т.е. ее механическое разрушение, осуществляют главным образом насекомые-ксилофаги, которые одновременно являются агентами переноса инфекции.
Элементы лигноуглеводного комплекса могут разрушаться бактериями, актиномицетами, а также консорциями микроорганизмов. В основном их целью являются углеводы, а наличие лигнина лимитирует их воздействие. Бактерии - одноклеточные организмы и не способны активно проникать в субстрат. Ущерб, причиняемый ими, часто несущественный и развивается довольно медленно. Почвенные актиномицеты в сравнении с бактериями имеют преимущество благодаря способности приобретать мицелиальное строение. Считается, что актиномицеты способны вызывать мягкую гниль в древесине, эксплуатируемой в условиях повышенной влажности [Zabel, Morrell, 1992].
Обработка результатов по кинетике микогенного ксилолиза
Подготовленные для работы образцы древесины номеровали, подписывая карандашом. Затем их помещали в эксикатор, где они несколько дней выдерживались для достижения равновесной влажности, после этого образцы взвешивали. 10 % образцов сушили при температуре 100-105 С не менее трех часов до абсолютно сухой массы. При температуре ниже 100 С удаление воды может произойти не полностью, а при температуре выше 105
С может наблюдаться деградация компонентов древесины, что делает их непригодными для последующего химического анализа. Из сушильного шкафа образцы помещали в эксикатор на 10 минут, где они остывали. Время охлаждения должно быть строго постоянным. Затем рассчитывали влажность образцов (W) и находили для каждой породы в отдельности ее среднее значение (Wzp), которое использовали для вычисления абсолютно сухой массы остальных образцов (то): w = (mw-m0)/m0, (2) щ = щЛсР-У (3) где W - влажность образцов; mw, mo - масса соответственно сырой и сухой древесины, г. Преимущество такого способа определения абсолютно сухой массы заключается в том, что образцы, непосредственно участвующие в анализе, не подвергаются высушиванию и воздействию высоких температур, что может негативно повлиять на дальнейшее развитие гриба и пр. В работе использованы штаммы грибов, хранящиеся в коллекции культур кафедры общей экологии, анатомии и физиологии растений Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии. Грибы культивировались на косом агаре и хранились при комнатной температуре и влажности. Перечень использованных для работы грибов приведен в табл. 1.
Гриб С. subvermispora штамм L-14807 был получен 9.08.06 из Forest Product Laboratory (USA, Madison, Department of Agriculture) на следующих условиях: использовать только в контролируемых лабораторных условиях по указанному почтовому адресу, все культивируемые организмы должны быть уничтожены стерилизацией после окончания работ.
Дополнительно проведен химический анализ состава древесины ели [Picea obovata), разложенной грибом-делигнификатором Phellopilus nigrolimitatus (Romell) Niemela, Т. Wagner et M. Fisch. в природных условиях. Гриб вызывает неравномерное разрушение древесины с формированием участков, где происходит избирательное разложение лигнина, характеризующихся светлыми пятнами.
Phanerochaete sanguinea - базидиомы резупинатные, свободно прикрепленные, гладкие при высушивании иногда растрескивающиеся и отделяющиеся от субстрата. Гимений беловатый, подстилка с отходящими от нее мицелиальными шнурами кроваво-красная, так же как и пораженная древесина. Гриб встречается на разрушенной древесине хвойных и лиственных пород, в лесах, изредка в постройках. Распространен в умеренном поясе северного полушария, встречается то довольно часто, то изредка [Горленко и др. 1980]. Ceriporiopsis subvermispora - базидиомы резупинатные, бледно-кремового цвета. Поры мягкие, угловатые, расслаивающиеся при высушивании. Край отчетливый без ризоморф, участками слегка бахромчатый. Подстилка коричневатая, значительно темнее пор, роговидная или хрящевидная при высушивании.
Bjerkandera adusta — плодовые тела раковинообразные, распростерто-отогнутые, иногда распростертые, волокнисто-кожистые, при высушивании твердые и ломкие. Поверхность шляпок опушенная до волосисто-войлочной, с возрастом шероховатая или голая. Незональная или неясно зональная, радиально-морщинистая, что особенно возможно на высушенных образцах, бледно серая до буроватой. Поверхность гименофора темно-серая. Поры округлые, иногда округло-угловатые, с возрастом слегка извилистые, 4-6 на 1мм.
На пнях, сухостое валеже лиственных, изредка хвойных пород. Встречается на ослабленных живых деревьях. Распространен в умеренном поясе обоих полушарий. Плодовые тела однолетние, могут зимовать. Вызывает белую гниль [Горленко и др. 1980].
Trametes pubescens - базидиомы однолетние сидячие, половинчатые, веерообразные, раковинообразные, одиночные или черепитчатые, срастающиеся основаниями или боками, часто с низбегающим распростертым основанием, тонкие и плоские или толстоватые, с бугорком у основания. Поверхность шляпки ясно или неясно зональная, бархатистая или войлочная, белая, желтоватая, соломенно-желтая, в старости и при высушивании темнеющая до охряной. Край острый цельный иногда слегка подогнутый. Ткань мягко-кожистая до пробково-волокнистой, очень легкая, белая. Трубочки короткие, до 5 мм длиной.
Появляется во второй половине вегетационного периода на отмерших стволах, пнях, и ветвях лиственных пород особенно березы. Космополит. Вызывает активно развивающуюся белую гниль [Бондарцева, 1998]. В изобилии встречается на сплошных вырубках в Лисинском учебно-опытном лесхозе.
Phellopilus nigrolimitatus - базидиомы многолетние, от полностью распростертых до подушковидных и правильно галяпковидных, резупинатные, широко простираются по субстрату, повторяя его конфигурацию, отогнутая часть обычно в виде узких удлиненных шляпок. Шляпки неправильной формы, иногда черепитчатые, поверхность бархатистая, замшевая и войлочно-волосистая, с легко сминаемым покровом, неровная, мягкая, при высыхании более твердая, обычно неясно бороздчатая, у молодых экземпляров рыжевато-буроватая, коричневатая, с возрастом умброво- или шоколадно-коричневая, край острый стерильный снизу, долго сохраняющий желто-охряную окраску. Ткань ржавая или бурая. На границе ткани и трубочек, а иногда и между слоями трубочек пролегает тонкий темный слой плотной ткани, видный на поперечном срезе как черная линия.
Гриб встречается на валежных стволах и пнях хвойных пород, преимущественно пихты и ели, реже сосны, а также обработанной древесине хвойных на складах и в постройках. Распространен по всей таежной зоне, но редко встречается в эксплуатируемых лесах, в заповедниках и горных лесах порой обилен. Вызывает активно развивающуюся пеструю ямчатую гниль. [Бондарцева, Пармасто, 1986]
Ксилолиз образцов осины, грибами вызывающими коррозию
Теоретически в гидролизатах древесины осины по содержанию глюкозы можно оценивать степень воздействия грибов на целлюлозу, потому что доля этого моносахарида в гемицеллюлозах лиственных сравнительно мала. Так, например, гемицеллюлозы в осине представлены преимущественно глюкуроноксиланом (17,1 %), а также небольшим количеством других гомо-и гетерополисахаридов: арабинаном (0,8 %), глюкоманнаном (1,1 %) и галактуронорамногалактаном (1,4 %). В древесине ели такой пересчет не оправдан, так как наравне с целлюлозой источником глюкозы может служить глюкоманнан, содержание которого в хвойной древесине достигает 11 %. Глюкоманнан ели состоит из маннозы и глюкозы, которые присутствуют в нем в соотношении 4:1 соответственно. Вследствие относительно большой доли глюкоманнана в древесине ели глюкоза, извлеченная из него, будет незначительно увеличивать общее содержание глюкозы.
Вполне очевидно, что моносахариды, входящие в состав грибной клеточной стенки будут попадать в раствор при гидролизе, и доля их будет увеличиваться по мере накопления грибного мицелия в древесине. Если с поверхности образца грибной мицелий можно удалить механическим путем, то извлечение его из образца задача неосуществимая. Кроме того, на продвинутых стадиях разложения ( 60 %) мицелий замещает древесную массу, и отделить его, не нарушив целостности образца - практически невозможно. Определенно, на таких стадиях разложения моносахариды, входящие в состав мицелия могут существенно влиять на химический анализ.
Углеводы играют главную роль в питании грибов, так как служат двум основным функциям в метаболизме этих гетеротрофных организмов: снабжают углеродом необходимым для синтеза веществ живой клетки, и участвуют в процессах окисления, где являются единственным источником энергии. Таким образом, если исключить ресинтез моносахаридов КТГ, можно утверждать, что все исследуемые моносахариды относятся к фрагментам клеточной стенки разрушаемой древесины. В этом случае мы можем говорить о химическом анализе не древесины и не грибного мицелия, а о химическом анализе грибной зоны.
Организованный мицелий КТГ вместе с окружающим его субстратом и экстрацеллюлярными ферментами формирует грибную зону, в которой происходит авторегуляция ксилолиза на физиологическом уровне. На результаты анализов углеводной части древесины может существенно сказываться биосинтетическая деятельность КТГ, а также неравномерность освоения субстрата.
Для расчета калибровочных коэффициентов определяемых веществ приготовили модельные смеси с различной концентрацией рамнозы, арабинозы, ксилозы, маннозы, галактозы, глюкозы, так как предполагалось, что их содержание в образцах древесины может значительно изменяться под действием ферментного аппарата КТГ. Всего было приготовлено 6 модельных смесей, три из которых не содержали рамнозы. В табл. 5 содержится информация о массе навески моносахарида, использованного для приготовления пробы (т, мг), и величине, равной процентному отношению площади пика искомого моносахарида к площади внутреннего стандарта (Si/SCT).
При исследовании углеводного состава древесины, разложенной грибом-делигнификатором P. sanguinea 16-65, выяснилось, что отдельные моносахариды разрушались этим грибом неодинаково. При одновременном снижении содержания лигнина, отмеченном в предыдущей главе, происходит параллельное снижение содержания ксилозы. На фоне убывании этих компонентов заметно увеличение доли % от массы сухого образца глюкозы в исследуемой древесине, которое достигает максимума (53,3 %) при 33,9 % разрушения образца (рис. 13). Для более четкой интерпретации полученных результатов, содержание отдельных моносахаридов в разрушенной древесине пересчитали на остаток от их начального содержания в здоровой древесине. Выяснилось, что на всех исследованных стадиях разложения (до 33,9 % потери массы) преимущественно разрушаются пентозы. Особенно сильно расходуется ксилоза, остаток которой при 33,9 % потери массы древесины составлял 11,5 % от ее исходного содержания в осиновых образцах. Меньше всего подвергались разложению манноза и глюкоза.
В древесине ели практически все моносахариды за исключением глюкозы расходуются одновременно. Потребление глюкозы происходило в последнюю очередь. Максимум содержания глюкозы в образце, равный 48,0 %, был определен при 22,0 % потери массы древесины (рис 14), при этом ее остаток составлял 95,4 % от исходного количества глюкозы в здоровой древесине. Очевидно, затем глюкоза потреблялась интенсивнее. Уже при разложении древесины ели на 37,2 % глюкозы осталось 64,4 % от ее изначального количества в исходном образце. Ксилоза разрушается P. sanguinea 16-65 не так избирательно, как при разложении древесины осины. При разложении елового образца на 45,7 % остаток ксилозы был равен 20,8 %. При разложении ели особенно быстро происходит разрушение арабинозы и галактозы.
Потребление моносахаридов в древесине осины грибом С. subvermispora L-14807 напоминает их разложение под действием Р. sanguinea 16-65. Снижение содержания ксилозы происходит одновременно с увеличением доли глюкозы в разлагаемой древесине (рис. 16). Максимум содержания глюкозы приходится на 21,5 % потери массы древесины, при этом ее остаток в разрушенной древесине соответствует 87,8 %. К этому сроку ксилозы в осине остается всего 45,8 %, и ее количество продолжает неуклонно снижаться. Разложение остальных моносахаридов происходит параллельно.
Разложение глюкозы в древесине ели под действием С. subvermispora L-14807 происходит пропорционально ее содержанию в исходной древесине (рис. 17). При определении остатка моносахаридов в разрушенной древесине обнаруживается, что по сравнению с другими углеводами, глюкоза расходуется менее интенсивно (рис. 18). Однако такой характер потребления глюкозы в еловой древесине приближает С. subvermispora L-14807 к симультанному разрушению. Максимум содержания глюкозы приходится на 75,2 % потери массы образца, однако ее остаток в разрушенной древесине уже не значителен и составляет всего 27,3 % от ее начального количества. При разложении древесины ели на 21,9 % остаток глюкозы в ней соответствует 79,7 %. Ксилоза, арабиноза и манноза потреблялись С. subvermispora L-14807 одновременно, и интенсивность потребления была выше, по сравнению с остальными моносахаридами.
Разложение углеводов под действием P. sanguinea 16-65
В процессе микогенного ксилолиза последовательная, от стадии к стадии, редукция исследуемых моносахаридов не всегда может быть выявлена, и в некоторых случаях может наблюдаться несоответствие значения потери массы компонента по отношению к предыдущим результатам. Это связано с тем, что на результаты химических анализов древесины может существенно сказываться биосинтетическая деятельность КТГ, а также неравномерность освоения субстрата. КТГ часто демонстрируют неравномерное освоение субстрата, формируя зоны, в которых разложение может проходить более интенсивно в сравнении с рядом расположенными участками. Таким образом, каждый из анализируемых образцов может обладать индивидуальными особенностями развития в нем грибного поражения, несмотря на сходные потери массы. При неравномерном разложении компонентов два отдельно взятых образца могут показать во время анализа сходные концентрации, но при пересчете на потери результаты будут существенно различаться. Кроме того, сих пор не существует четкого представления о том, какую долю от массы освоенного древесного субстрата занимает грибной мицелий, и как меняется его количество в зависимости от стадии ксилолиза. Поэтому необходимо отметить, что применяемый метод дает качественную и количественную оценку изменений происходящих в отдельном образце, но не раскрывает всей сути процессов, связанных с жизнедеятельностью гриба.
Анализ углеводной части древесины на разных стадиях микогенного ксилолиза показал, что характер ее изменения обусловлен не только видовой принадлежностью гриба, но и породой древесины. Неодинаковое разложение углеводов осины и ели одним и тем же грибом, связано с разным полисахаридным составом хвойных и лиственных пород.
Все исследуемые моносахариды регистрировались вплоть до самых последних стадий ксилолиза. Даже минорные соединения, такие как рамноза, арабиноза и галактоза никогда полностью грибами не разлагались и всегда присутствовали в ограниченном количестве до самых последних стадий разрушения. Разложение галактозы и арабинозы может свидетельствовать о проявлении грибом ферментной активности в срединной пластинке и первичной оболочке клеточной стенки (М+Р), где наравне с лигнином могут потребляться и эти углеводы. Галактоза и арабиноза могли бы стать хорошими маркерами для определения ферментной активности гриба в зоне М+Р, так как в других частях клеточной стенки их содержание ничтожно мало.
В разделе, посвященному разрушению лигнина, мы выяснили, что он почти полностью разрушается P. sangidnea 16-65 в интервале от 30 до 40 % потери массы древесины осины. Из результатов анализа углеводной части мы видим, что моносахарид ксилоза в образцах осины утилизируется Р. sangidnea 16-65 параллельно с лигнином. Содержание ксилозы в древесине снижается с 16,5 до 2,9 % (при 33,9 % потери массы древесины), что соответствует потерям в 88,5 % от ее изначального количества. Одновременно с ксилозой P. sangninea 16-65 потребляет и арабинозу, однако благодаря своему незначительному содержанию в клеточной стенке, она, вероятно, играет незначительную роль в метаболизме гриба. Как отмечалось выше, арабиноза и другие моносахариды, содержащиеся преимущественно в срединной пластинке и первичной оболочке, могут служить индикаторами проявления ферментной активности на этих участках. Разложение образцов осины С. subvermispora L-14807 сопровождается менее резким снижением содержания ксилозы, однако более выраженным по сравнению с грибами коррозии Т. pubescens 5-08 и В. adiista 13-07. При изучении продукции гемицеллюлаз грибами вида С. subvermispora выяснилось, что самым активно производимым ферментом является именно ксиланаза [Heidome et al., 2005]. Ее продукция превосходила синтез других сахаролитических ферментов в несколько раз. Исследование продукции гемицеллюлаз грибом P. sanguinea до настоящего времени не проводилась, однако, исходя из полученных данных, можно ожидать высокого уровня продукции ксиланаз этим грибом.
В древесине лиственных пород ксилоза вместе с лигнином образует ксилан-лигниновые комплексы [Азаров и др., 1999], что возможно и обуславливает их одновременное разрушение. Лигнин имеет высокую энергетическую ценность, однако, метаболизируется только в сопряженных реакциях потребления полисахаридов. Если обеспечить КТГ легкоусвояемый субстрат, например, глюкозу в лабораторных условиях или гемицеллюлозу в природных условиях, то происходит преимущественное разложение лигнина с сохранением целлюлозы [Kirk, Shimada, 1985] Поэтому не исключено целенаправленное использование делигнификаторами ксилозы в качестве косубстрата при разложении лигнина.
При разложении древесины ели грибом P. sanguinea 16-65 существенного снижения содержания ксилозы не наблюдалось. Благодаря тому, что этого моносахарида в хвойных гораздо меньше, чем в лиственных, он может не играть существенной роли в питании гриба. При разрушении обеих пород делигнификаторами наименее затрагиваемым углеводом оказалась глюкоза. На начальных этапах разложения («20-30% потери массы древесины) наблюдалось увеличение содержания глюкозы. Это увеличение объясняется относительным снижением доли других компонентов древесины, при одновременном, сравнительно низком, потреблении глюкозы.
Ранее при изучении гидролитических и окислительных экзоферментов, выделяемых P. sanguinea 16-65, в жидких культурах и на древесном субстрате выяснилось, что уже на ранних стадиях культивирования активность эндоглюконазы очень высока, и ее синтез не прекращается и в дальнейшем [Соловьев, Яковлева, 1987]. При изучении целлюлозолитических ферментов С. subvermispora было определено, что эндоглюконаза продуцируется им так же, как и P. sanguinea [Hidorne et al., 2005]. Таким образом, синтез целлюлозоразрушающих ферментов происходит вопреки избирательности в разложении лигнина и сохранению целлюлозы. Глюкоза разлагалась грибами, вызывающими коррозию, одновременно с остальными компонентами. Ее содержание в разрушаемой древесине оставалось практически постоянным с некоторой тенденцией к снижению на продвинутых сроках ксилолиза. Все изученные грибы были способны разлагать исследуемые углеводные компоненты, но характер и последовательность их разложения в некоторых случаях позволяет ввести дополнительные критерии для четкого разделения грибов, вызывающих коррозию и делигнификацию. Основываясь на данных по разложению моносахаридов грибами делигнификаторами можно предположить, что глубина и избирательность разложения лигнина во многих случаях обуславливается наличием в древесине моносахарида ксилозы.
