Содержание к диссертации
Введение
. CLASS Обзор литератур CLASS ы
II. 1. Действие экстремальных факторов на метаболизм микроскопических грибов 10
П. 1.1. Механизмы адаптации организмов к действию экстремального фактора (теплового шока). Влияние гипертермии на микроскопические грибы 10
II. 1.2. Фунгициды как один из способов защиты от биоповреждений. Действие фунгицидов на метаболизм грибов 19
П.2. Особенности энергетического обмена микроскопических грибов 27
П.2.1. Полифосфатная система микроскопических грибов 27
II.2.2. Современные представления о строении и свойствах фосфатаз микроскопических грибов 36
П.2.3. Компоненты адениловой системы микроскопических грибов 43
III. STRONG Экспериментальная часть
STRONG III. 1. Объекты исследования и постановка опытов 52
III. 1.1. Объекты исследования 52
III. 1.2. Получение культуры плесневых грибов 52
III. 1.3. Исследование динамики роста 53
III. 1.4. Определение стрессирующих доз действующих факторов (ТШ и биоциды) для микроскопических грибов A. niger
и P. ochro-chloron 53
III. 1.5. Постановка экспериментов по оценке стрессирующего воздействия (ТШ и биоциды) на микроскопические грибы 54
ІІІ.2. Методы исследования 55
Ш.2.1. Определение содержания неорганических полифосфатов 55
Ш.2.2. Определение полифосфатазной активности 55
III.2.3. Определение содержания адениловых нуклеотидов 56
Ш.2.4. Определение АТФазной активности 56
Ш.2.5. Определение интенсивности дыхания 56
Ш.2.6. Определение фосфатазной активности 57
Ш.2.7. Определение пирофосфатазной активности 57
Ш.2.8. Определение содержания неорганического фосфата в культуральной среде 58
Ш.2.9. Определение содержания сахарозы в культуральной среде 58
IIL2.10. Статистическая обработка результатов 58
Ш.З. Результаты и их обсуждение
Ш.3.1. Определение стрессирующих доз действующих факторов (ТШ и биоциды) для микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron 59
Ш.З. 1.1. Исследование динамики роста микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron в процессе культивирования на жидких питательных средах 60
Ш.З. 1.2. Подбор стрессирующей дозы температуры для микроскопических грибов 62
Ш.З. 1.3. Подбор стрессирующей концентрации биоцидов (метацида и АБП-40) для микромицетов 64
Ш.З.2. Влияния экстремальных воздействий на полифосфатную систему микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron 66
Ш.З .2.1. Содержания неорганических полифосфатов у микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron 67 Ш.
З.2.2. Исследование содержания неорганических полифосфато у грибов A. niger и P. ochro-chloron в условиях теплового стресса 69
Ш.3.2.3. Исследование содержания неорганических поли фосфатов у грибов A. niger и P. ochro-chloron в условиях воздействия биоцидами 72
Ш.3.2.4. Влияния экстремальных воздействий на поли-фосфатазную активность микроскопических грибов 75
Ш.3.2.4.1. Изучение некоторых свойств полифосфатаз грибов A. niger и P. ochro-chloron 75
Ш.3.2.4.2. Полифосфатазная активность микроскопических грибов в условиях экстремальных воздействий (тепловой шок и действие биоцидов) 80
Ш.3.3. Адениловая система микроскопических грибов в условиях экстремальных воздействий 82
Ш.3.3.1. Содержание адениловых нуклеотидов в мицелии микроскопических грибов A. niger и P.ochro-chloron 82
Ш.3.3.2. Содержание адениловых нуклеотидов у микроскопи ческих грибов в условиях ТШ 84
Ш.3.3.3. Содержание адениловых нуклеотидов у микроскопи ческих грибов в условиях «химического стресса» 86
Ш.3.3.4. Исследование влияния ТШ на АТФ-гидролазную активность грибов A. niger и P. ochro-chloron 88
Ш.3.3.5. Исследование влияния биоцидов на АТФазную активность грибов A. niger и P. ochro-chloron 90
Ш.3.3.6. Влияние экстремальных воздействий (гипертермия и действие биоцидов) на различные типы АТФаз микроскопических грибов 93
III.3.4. Влияние «химического стресса» на дыхание грибов A. niger и P. ochro-chloron 96
Ш.3.5. Фосфатазная активность микроскопических грибов в условиях экстремальных воздействий 98
III.3.5.1. Изучение некоторых свойств фосфатаз микромицетов 99
Ш.3.5.2. Исследование влияния гипертермии на фосфатазную активность микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron 102
Ш.3.5.3. Исследование действия биоцидов на фосфатазную активность грибов A. niger и P. ochro-chloron 104
Ш.3.6. Влияние экстремальных воздействий (ТШ и действие биоцидов) на пирофосфатазную активность микроскопических грибов 107
Ш.3.6.1. Изучение некоторых свойств пирофосфатаз микро скопических грибов A. niger и P. ochro-chloron 107
Ш.3.6.2. Пирофосфатазная активность микроскопических грибов в условиях теплового шока и действия биоцидов 111
Ш.3.7. Влияние экстремальных факторов (гипертермии и действия биоцидов) на содержание неорганического фосфата у микроскопических грибов 113
VI. CLASS Заключени CLASS е 116
V. Выводы 122
VI. Список литературы 124
VII. Приложение
- Механизмы адаптации организмов к действию экстремального фактора (теплового шока). Влияние гипертермии на микроскопические грибы
- Исследование динамики роста микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron в процессе культивирования на жидких питательных средах
- Исследование содержания неорганических поли фосфатов у грибов A. niger и P. ochro-chloron в условиях воздействия биоцидами
- Влияние экстремальных воздействий (гипертермия и действие биоцидов) на различные типы АТФаз микроскопических грибов
Механизмы адаптации организмов к действию экстремального фактора (теплового шока). Влияние гипертермии на микроскопические грибы
Организмы постоянно подвержены воздействию различных экстремальных факторов (радиационный, температурный, химический стресс и др.). По мнению ряда авторов (Селье, 1972; Меерсон, 1986; Войников, 1989; Полевой, 1989; Кузнецов и др., 1990; Блехман, 1992; Пахомова, 1995; Тка-ченко и др., 1998; Андреищева, Звягильская, 1999), самые различные факторы (кислоты, щелочи, гипо- и гипертонические растворы, температура, соли тяжелых металлов, радиоактивные изотопы и др.) вызывают однотипные морфологические и физиологические изменения в животных и растительных клетках. В данном разделе более подробно остановимся на механизмах адаптации к тепловому стрессу, как наиболее изученному. Повышенная температура, по сравнению с обычной физиологической нормой, относится к одному из широко распространенных экстремальных воздействий, и осуществление процессов жизнедеятельности организмов в этих условиях представляет одно из интересных биологических явлений. Способность выжить, а также расти и развиваться при воздействии повышенной температуры, является одним из совершенных механизмов, выработанных в процессе эволюции, - механизмом адаптации. Этот механизм сходен у разных форм организмов и характеризует не только влияние гипертермии, но и воздействие других экстремальных факторов (Карасевич, 1975; Билай, 1985).
Общеизвестно, что концепция стресса была сформирована Г. Селье. По определению Селье, стресс - это совокупность всех неспецифических изменений организма, возникающих под влиянием любого сильного воздействия и являющихся результатом работы неспецифического защитного организма, увеличивающего сопротивляемость организма к стрессовым факторам, или стрессорам (Пахомова, 1995). Селье (1972) разделил весь адаптационный процесс организма на три стадии: 1 - реакция тревоги, 2 - стадия адаптации, 3 - стадия истощения.
Однако первоначально стресс - это напряжение организма во время развития в нем универсальной защитной реакции на всевозможные воздействия. Стресс, как форма преодоления живой материей экстремальных условий, должен иметь общебиологический смысл, т. к. обеспечивает переход на новый уровень метаболизма. Нарушение гомеостаза - не критерий гибели клетки, а условие для перехода в новое состояние (Войников и др., 1989).
В первой фазе стресса развивается целый комплекс однотипных изменений, зависящих как от типа и дозы стрессора, так и от вида организма. К начальным обратимым неспецифическим процессам, происходящим в клетке при действии стрессора, относятся: переход Са2+ в цитоплазму из вакуолей, митохондрий, эндоплазматической сети; изменение молекулярного состава в отдельных классах липидов и текучести мембран; активация гидролаз; снижение синтетических процессов (но одновременно активируется синтез РНКазы); разрыхление белковых глобул, изменение их вторичных, третичных и четвертичных структур; повышение проницаемости мембран и выход из клеток различных веществ; деполяризация мембран; сдвиг рН цитоплазмы в сторону более низких значений; нарушение окислительного фосфорилиро-вания; развитие свободнорадикальных реакций; синтез стрессовых белков на фоне падения общего количества белка и т. д. (Александров, 1985; Браун, Моженок; 1987; Полевой, 1989; Войников и др., 1989; Кулаева и др., 1991; Андреищева, Звягильская, 1999; Андреищева и др., 1999; Watson et al., 1999).
По мнению Г.Л. Шкорбатова (1982), адаптивный процесс может быть расчленен на следующие этапы:
1. Мобилизационная фаза (активация защитных механизмов); 2. Фаза перестройки адаптационных процессов;
3. Фаза включения новых механизмов адаптации;
4. Фаза стабилизации механизма.
Возможность адаптации обусловлена зависимостью термодинамических, химических, кинетических констант от температуры. Эта зависимость определяет направление и скорость химических реакций, конформационных переходов биологических макромолекул, фазовых переходов липидов, изменения проницаемости мембран и других процессов, функционирование которых обеспечивает жизнедеятельность организмов при повышенной температуре (Билай, 1985).
В.Я. Александров (1975) выдвинул гипотезу о механизмах адаптации организмов к повышенной температуре, заключающуюся в том, что для нормального функционирования организмов при высокой температуре их белки, нуклеиновые кислоты и липиды должны обладать определенным уровнем конформационной гибкости (т. е. они должны находиться в "семилабильном" или "семистабильном" состоянии). При подъеме температуры, несмотря на сдерживающее влияние гидрофобного взаимодействия, имеет место общая или локальная лабилизация молекул. Стрессовые белки, устойчивые к нагреву, находясь в среде, где присутствуют лабильные белковые макромолекулы, подвергшиеся развертыванию в результате стресса, препятствуют их взаимной агрегации, т. к. снижают скорость диффузии.
Согласно денатурационной теории повреждений, основными объектами репарации в клетках, пострадавших от шока, должны быть белки и белковые конструкции с нарушенной пространственной структурой. Их репарация может осуществляться путем замены поврежденных молекул вновь синтезируемыми или путем их ренативации. Для успешного осуществления ренати-вации белков, пространственная структура которых нарушена при стрессе, они должны быть предохранены от протеолиза и агрегации. Этому способствует некоторые стрессовые белки и родственные им конститутивные белки 13 так называемые шапероны (Кулаева и др., 1991; Александров, Кислюк, 1994; Пахомова, 1995).
Биосинтез стрессовых белков в неблагоприятной ситуации - явление общебиологическое. Вызванные тепловым шоком изменения активности генов в клетках сопровождаются двумя характерными событиями на уровне синтеза белка. Во-первых, начинается синтез белков теплового шока (БТШ), и, во-вторых, прекращается (или сильно замедляется синтез всех остальных белков) (Войников с соавт., 1984; Пахомова, 1995). О существенной роли БТШ в жизни клеток говорит их высокая консервативность в эволюции. Например, hsp70 имеет высокое сходство аминокислотной последовательности у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов, растений. Отдельные участки hsp70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека (Войников с соавт., 1986; Кулаева и др., 1991).
БТШ представлены группой высокомолекулярных (110-60 KDa) и низкомолекулярных (35-15 кОа) белков. Уотсон К. с соавторами (1999) исследовали стрессовую реакцию у дрожжей, выделенных из различных экологических ниш, на различные виды воздействий: тепло, спирт, а также окислительный и свободнорадикальный стресс. Были выявлены заметные различия в стрессовой реакции в отношении, например, к данному виду стресс - температуре, при которой индуцируются стрессовые белки, и в степени приобретаемой устойчивости. Однако для всех исследованных дрожжей наблюдался одинаковый набор БТШ: hspl04, hsp90, hsp70 и hsp60. Аналогичные исследования с Neurospora crassa показали, что тепловая обработка стимулирует образование у данного вида гриба БТШ с молекулярной массой 105, 99, 78, 43 и 23 кОа; значительные количества hsp99 и hsp78 связаны с ядром (Войников с соавт., 1984).
Исследование динамики роста микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron в процессе культивирования на жидких питательных средах
Устойчивость организма к стрессовому воздействию зависит от многих факторов, в том числе и фазы онтогенеза. Известно, что наиболее чувствителен к действию стресса молодой мицелий (Злочевская, Галимова, 1980; Александрова и др., 1985; Чадаева, Романова, 1985). В связи с этим были проведены исследования по изучению процесса онтогенеза микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron.
Результаты экспериментов показали, что 1-4 сутки характеризуются высокой интенсивностью анаболических процессов, наращивания массы мицелия (Рис. 1, 2).
Н.И. Чадаевой и Н.М. Романовой (1985) установлено, что для A. niger прирост белка за 1 сутки в этот период очень высок и составляет в среднем около 40%. И.В. Злочевская и Л.М. Галимова показали, что на 3-5 сутки содержание большинства аминокислот у грибов рода Penicillium достигает максимума, что также свидетельствует об интенсивной метаболической активности.
Период с 6 по 10 сутки можно охарактеризовать как стационарную фазу роста: прирост биомассы в этот период стабилизируется, и начинается активный процесс спороношения. Данные изменения сопровождаются закислени-ем культуральной среды и снижением сахарозы, вероятного лимитирующего фактора, на фоне незначительного изменения содержания в ней фосфата (Рис. 1,2).
Полученные результаты характерны для обоих видов грибов. Однако в процессе роста у исследуемых микромицетов имеются и различия: A. niger способен наращивать больше биомассы и закислять культуральную среду более интенсивнее, чем P. ochro-chloron за то же время.
Концентрация ионов водорода является одним из лимитирующих факторов при культивировании микромицетов. Так, для грибов рода Aspergillus показано, что наибольшее количество биомассы образуется при рН 5-6 (Щербаков и др., 1988).
Известно также, что микроскопические грибы родов Aspergillus и Penicillium выделяют в среду большое количество органических кислот, закисляя среду и создавая тем самым благоприятные условия для деструкции материалов (Смирнов и др., 2002).
Таким образом, на 5-6 сутки роста исследуемых микроскопических грибов происходит переход на стационарную фазу, характеризующую мицелий как полностью сформировавшийся. Поэтому для дальнейших исследований использовалась 7-суточная культура грибов.
Температура является одним из главных факторов в распространении, регуляции роста и физиологической активности грибов. Грибы по отношению к температуре разделяют на:
- психрофильные, растущие при температуре от -3 до +10С; - мезофильные: растут при 10-38С;
- термофильные: растут в пределах 10-50С и выше (Билай, 1974, 1985; Смирнов и др., 2002).
Исследуемые представители видов грибов отличаются терморезистентностью: A. niger относится к группе факультативных термофилов, P.ochro-chloron является типичным мезофилом. Каждый из видов грибов характеризуется своими температурными границами роста, температурным оптимумом и степенью толерантности к повышенной температуре (Билай, 1980; Билай, 1985). Для A. niger оптимальной является температура роста около 30С, для P. ochro-chloron оптимум роста - около 26С. A. niger способен расти как при низких, около нуля, температурах, так и при 45С. Минимальной температурой для P. ochro-chloron является около 4С, максимальной - около 37С (Лугаускас и др., 1987).
На первом этапе исследования были определены границы нелетального теплового шока для каждого из видов грибов. Несмотря на то, что данные виды грибов относятся к разным терморезистентным группам, результаты опытов оказались сходными. Установлено, что при 2х часовом воздействии температуры от 30 до 60С мицелий обоих видов грибов сохраняет свою жизнеспособность. При действии температуры 70 и 80 С в течение двух часов наблюдалась гибель мицелия обоих видов грибов (Таблица 1). Таким образом был сделан вывод, что нелетальный ТШ (НЛТШ) для грибов A. niger и P. ochro-chloron возможен при температуре от 60 до 70С.
Более детальные исследования по температурному воздействию с использованием системы тестов на выживаемость, таких как: прирост биомассы, определение скорости роста колоний, способности к спороношению - позволили установить стрессирующие температуры для обоих видов грибов (Прилож., табл. 1-3). Так, для P. ochro-chloron стрессирующая температура составляет 60С, для A. niger - 62С. Данные значения и использовались в дальнейшей работе по влиянию теплового шока (гипертермии) на микроми-цеты.
Известно, что одним из эффективных средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, а также средств защиты сельскохозяйственных растений являются различные химические соединения (фунгициды). Арсенал биоцидных средств должен постоянно пополняться, поскольку микроскопические грибы обладают большими адаптационными возможностями.
Так, В.Ф. Смирновым с соавт. (1999) были выделены и идентифицированы штаммы микроскопических грибов родов Trichoderma и Fusarium, устойчивые к действию хром- и цинкорганических соединений в концентрации, в несколько раз превышающей их МФК, определенную ранее для стандартных культур этих же видов грибов, и проявившие способность использовать в качестве источника питания лако-красочные материалы, содержащие в своем составе Сг- и Zn-органику.
Исследование содержания неорганических поли фосфатов у грибов A. niger и P. ochro-chloron в условиях воздействия биоцидами
Известно, что действие самых различных стрессовых факторов (кислоты, щелочи, гипо- и гипертонические растворы, температура, соли тяжелых металлов, радиоактивные изотопы и др.) приводит к однотипным морфологическим и физиологическим изменениям (Селье, 1972; Пахомова, 1995; Ткаченко и др., 1998; Андреищева, Звягильская, 1999). Однако каждый из вышеперечисленных факторов наряду с неспецифическим эффектом способен оказывать и специфическое воздействие. Так, например, различные химические соединения могут обладать высоко специфичным механизмом действия на живые организмы и иметь своей мишенью одно или несколько звеньев метаболизма.
В этой части работы изучалось влияние фунгицидов, как еще одного стрессирующего фактора, на содержание различных фракций неорганических ПФ микроскопических грибов при введении токсикантов в сублетальной концентрации в культуральную среду (in vivo). В контрольном варианте общее количество неорганических ПФ у P.ochro-chloron ниже, чем у A.niger, и составляет 3546 мкг Р; / г сух. массы и 3045 мкг Р; / г сух. массы, соответственно.
В результате исследования химического воздействия на культуры грибов A.niger и P.ochro-chloron обнаружено, что, независимо от вида микромицета и используемого фунгицида, действие биоцидов не приводит к значительным изменениям общего пула неорганических ПФ, а оказывает влияние на перераспределение ПФ по фракциям (Прилож., табл. 11). Так, например, наблюдается падение количества ПФ солерастворимой фракции, что, по-видимому, объясняется особенностями локализации и выполняемых функций. Как было установлено ранее, солерастворимые ПФ фракции ПФ2 специфично связаны с обменом нуклеиновых кислот и, в частности, РНК. Они выступают в роли депо избыточного фосфора при синтезе РНК. Вероятно, при стрессовых воз 73 действиях стимулируется гидролиз ПФ и использование образующегося свободного ортофосфата для синтеза РНК и, соответственно, белков, отвечающих за адаптационные реакции.
При индивидуальном анализе щелочерастворимых фракций можно отметить увеличение количества ВНПФ при химическом воздействии на мик-ромицетные культуры обоих видов исследуемых грибов. Местонахождение этих более высокополимерных фракций полифосфатов (ПФЗ и ПФ4), длина цепи которых составляет 200 остатков и выше, было достоверно установлено в конце 90-х годов прошлого века. Они находятся в клеточной оболочке, где осуществляют регуляцию синтеза гликопротеидов и влияют на величину заряда клеточной оболочки грибов. Поверхность клеточной оболочки несёт, как правило, отрицательный заряд. Колебания величины этого заряда имеют существенное значение в жизнедеятельности грибов, влияя на взаимодействия клеток в популяции, усиливая или ослабляя флокуляционные и адгезивные свойства поверхности. Величина и знак суммарного заряда клеточной оболочки определяются соотношением и плотностью распределения ионо-генных групп, составляющих оболочку соединений, а в примембранном слое также и активностью транспортных процессов через плазмалемму.
АБП-40 - оловоорганическое соединение, для которого показано снижение проницаемости цитоплазматических мембран (Злочевская, 1975). Имеются сведения о том, что соединения олова тормозят синтез клеточной стенки мицелиальных грибов (Ильичев и др., 1987). Металлы в составе ме-таллорганических биоцидных соединений реагируют с сульфгидрильными группами активных центров многих ферментов, вызывая их блокирование.
Метацид, как известно, относится к четвертичным аммониевым соединениям (ЧАС). Из всех известных в настоящее время биоцидов ЧАС представляют группу органических антисептиков, принадлежащих к большому классу поверхностно-активных веществ. ЧАС являются агентами, вызывающими денатурацию белка и дезорганизацию клеточной мембраны (Вербина, 1973; Злочевская и др., 1980, 1981; Иванов и др., 1996). В результате дейст 74 вия этого соединения на мицелий гриба нарушается целостность клеток, что приводит к снижению адаптационных возможностей организма, способности адекватно реагировать на воздействие стрессового фактора.
Следовательно, можно сделать предположение о том, что увеличение ПФ данных фракций является своеобразной приспособительной реакцией, обеспечивающей адаптацию к воздействию стрессирующих факторов, в данном случае - к действию биоцидов различной химической природы и различного механизма действия, и эти изменения содержания ПФ могут быть связаны с ферментными системами метаболизма ПФ микромицетов.
Влияние экстремальных воздействий (гипертермия и действие биоцидов) на различные типы АТФаз микроскопических грибов
В двух предыдущих главах рассматривалось влияние экстремальных факторов (ТТТТ и действия биоцидов) на общую АТФазную активность микроскопических грибов A. niger и P. ochro-chloron. В настоящее время известны различные типы АТФаз. Наиболее распространенными и наиболее изученными являются митохондриальные АТФазы F-типа, Р-типа плазматических мембран и вакуолярные V-типа. В этой части работы было исследовано влияние тех же стрессовых факторов: гипертермии и действия фунгицидных соединений (метацида и АБП-40) - на вышеуказанные типы АТФаз. Для этого определяли АТФазную активность и ее чувствительность к специфическим ингибиторам трех основных типов АТФаз.
Ингибитором АТФаз F-типа являются азид и олигомицин. В экспериментах был использован азид натрия в концентрации 5мМ. АТФазы Р-типа ингибируются ортованадатом в относительно низкой концентрации (0,1 мМ). Для V-типа ингибитором является нитрат натрия или калия. В экспериментах использовался 50 мМ нитрат натрия. Полученные результаты представлены в приложении, таблице 14.
Все вышеуказанные ингибиторы в той или иной степени подавляют АТФазную активность как у A. niger, так и у P. ochro-chloron. Причем наибольшая степень подавления АТФазной активности отмечена у A. niger: азид натрия снижает АТФазную активность на 63%, ортованадат и нитрат натрия - на 48% каждый; тогда как у P. ochro-chloron процент ингибирования соста 94 вил 35%, 30% и 31%, соответственно. Полученные данные позволяют предположить наличие всех трех типов АТФаз (митохондриальной, плазматической и вакуолярной) у изучаемых микроскопических грибов.
Далее изучалось влияние экстремальных воздействий на АТФазную активность в присутствии исследуемых ингибиторов. Для этого в гомогенат, приготовленный из культуры микроскопического гриба, предварительно подвергнутой экстремальному воздействию (гипертермии или действию биоцидов), добавляли один из вышеуказанных ингибиторов.
Результаты экспериментов показали, что при действии ТШ на культуру гриба A. niger процент ингибирования ортованадатом или нитратом натрия АТФаз снижается на 8 и 28%, соответственно, а для митохондриальной АТФазы эффект подавления активности азидом исчезает полностью, что позволяет предположить инактивацию или потерю чувствительности митохондриальной АТФазы при действии ТШ.
У гриба P. ochro-chloron ТШ, наоборот, вызывает повышение чувствительности всех трех типов АТФаз. Наибольший процент ингибирования наблюдается у АТФазы Р-типа (до 93%). Вероятно, такая разница влияния ТШ на АТФазы F-, Р- и V-типа исследуемых микромицетов связана с различной терморезистентностью грибов.
При внесении метацида в культуру гриба АТФазная активность снижается при добавлении азида. При добавлении ванадата или нитрата в гомогенат гриба, подвергшегося воздействию метацида, активность не изменяется, что говорит об инактивации АТФазы или потери ее чувствительности к этим ингибиторам под действием метацида. Данные результаты характерны для обоих видов грибов. По всей видимости, полученные результаты связаны с механизмом действия данного биоцида. Как и любое экзогенное вещество, фунгицид первоначально контактирует с клеточной стенкой и мембраной, проникает через них и затем уже вступает во взаимодействие с внутриклеточным содержимым. Известно, что метацид вызывает дезорганизацию мем 95 бран и, по-видимому, нарушает работу, в первую очередь, плазматических АТФаз.
При внесении оловоорганического соединения АБП-40 в культуру гриба чувствительность активности АТФаз повышается ко всем трем ингибиторам, что позволяет предположить активацию всех трех типов АТФаз у исследуемых микроскопических грибов при действии оловоорганики. Прирост активности при действии данного фунгицида, более выраженный у P. ochro-chloron, вероятнее всего, происходит за счет повышения активности плазматической АТФазы (Прилож., табл. 14).
Таким образом, ингибиторный анализ показал наличие трех основных типов АТФаз: F-, Р- и V-типа, у исследуемых микроскопических грибов А. niger и P. ochro-chloron и позволил определить участие каждого из этих типов АТФаз при действии стрессирующего фактора (гипертермии или действии биоцидов). Ш.3.4. Влияние «химического стресса» на дыхание грибов A. niger и P. ochro-chloron
Одним из важнейших показателей, определяющих жизнедеятельность микроскопических грибов, является процесс дыхания. Известно, что грибы являются организмами, обладающими очень высоким уровнем дыхания. А так как синтез ряда макроэргических соединений, в частности, адениловых нуклеотидов, связан с процессом дыхания, представляло интерес изучить интенсивность дыхания микроскопических грибов. Поэтому, целью данного этапа работы было исследование влияния используемых в этой работе фунгицидов: метацида и АБП-40 на интенсивность дыхания грибов A. niger и Р. ochro-chloron.
