Содержание к диссертации
Введение
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1. Механизмы симбиотических взаимоотношений сои с клубеньковыми бактериями 11
1.2. Видовое разнообразие природных популяций ризобий сои Приамурья 15
1.3. Влияние некоторых агроэкологических факторов на симбиотические взаимоотношения сои с клубеньковыми бактериями 17
1.3.1. Экологические факторы 17
а) Влажность 17
б) Температура 18
в) Реакция почвы 18
г) Солевой стресс 19
1.3.2. Влияние техногенных факторов на клубеньковые бактерии и на симбиотический аппарат сои 20
а) Действие минеральных удобрений 20
б) Действие микроэлементов (Мо, Со, В, Zn) 22
1.4. Инокуляция бобовых растений клубеньковыми бактериями и ее эффективность 24
1.5. Использование ризобий сои в биологических приемах повышения продуктивности сельского хозяйства :. 29
II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ... 33
2.1. Микросимбионты 33
2.1.1. Среды.. 38
2.1.2. Выделение в чистую культуру клубеньковых бактерий из клубеньков сои 39
2.1.3. Пересевы чистых культур коллекционных штаммов клубеньковых бактерий 40
2.1.4. Изучение распространения видов ризобий сои в природных популяциях Приамурья 40
2.2. Макросимбионты 41
2.3. Изучение свойств ризобий сои, выделенных из природных популяций 42
2.3.1. Культуральные свойства 42
2.3.2. Физиолого-биохимические свойства 43
а) Отношение к хлористому натрию 43
б) Оценка устойчивости штаммов ризобий сои В. japonicum и S. fredii к изменениям рН среды и температурам выращивания.. 44
в) Усвоение углеводов 45
г) Изучение способности ризобий изменять реакцию среды 45
д) Определение вирулентности штаммов клубеньковых бактерийсои 46
е) Воздействие ризобий на семена 47
ж) Сравнение нуклеотидных последовательностей гена SpPHK ризобий сои 49
з) Эффективность отселектированных штаммов клубеньковых бактерий сои 50
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 53
3.1. Видовой состав природных популяций ризобий сои 53
3.2. Культуральные и физиолого-биохимические свойства ризобий сои 62
3.2.1. Культуральные свойства 62
3.2.2. Отношение к NaCl 66
3.2.3. Оценка устойчивости штаммов ризобий сои к изменениям рН и температуры выращивания 71
3.2.4. Усвоение углеводов 74
3.2.5. Влияние ризобий на реакцию питательной среды 78
3.2.6. Вирулентность 82
3.2.7. Стимулирующий и оздоравливающий эффект ризобий сои . 95
3.2.8. Производственное значение клубеньковых бактерий сои 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 113
ВЫВОДЫ 116
РЕКОМЕДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.. 118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
- Механизмы симбиотических взаимоотношений сои с клубеньковыми бактериями
- Изучение способности ризобий изменять реакцию среды
- Отношение к NaCl
Введение к работе
Понятие «симбиоз» как феномен совместной жизни разных организмов было впервые предложено немецким ботаником А. де Бари в 1879 году (Шле-гель, 2002). Исходно понятие «симбиоза» включало несколько типов биотических отношений между партнёрами:, мутуализм, комменсализм, паразитизм. В свою очередь эти типы имеют множество градаций и переходных состояний.
О. Гертвиг (1906, цит. по Тихонович, 1989) сузил границы употребления этого термина, используя его лишь для обозначения взаимовыгодных для обоих партнеров отношений (мутуализм). В такой трактовке понятие «симбиоза» было воспринято русскими учёными и прочно укоренилось в отечественной литературе. В современной биологии термин «симбиоз» чаще используется в его первоначальном широком значении за рубежом (Квиспел, 2002), в России паразитические отношения выделяются особо.
Ярким примером мутуалистических отношений служит взаимосвязь между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями: бактерии получают от растения образованные ими в процессе фотосинтеза углеводы и в свою очередь снабжают растения азотом, фиксированным ими из воздуха. За счёт использования этого азота все ткани бобовых растений обогащены белками, и белок у них является важнейшим запасным веществом семян. Однако мутуализм (симбиоз) клубеньковых бактерий и бобовых растений иногда, особенно на первых стадиях заражения корней и развития клубеньков, переходит в паразитизм со стороны бактерий, в это время ещё не усваивающих молекулярный азот, вследствие чего наблюдают временную остановку роста молодых растений. Кроме того, если растение инокулировано неэффективным штаммом клубеньковых бактерий, то бактерии тоже паразитируют на высшем растении (Костычев, 1951; Кретович, 1987). Поэтому важное значение для эффективности бобоворизобиального симбиоза в отношении азотфиксации и урожайности бобовых растений имеет обеспечение почв высокоэффективными штаммами клубеньковых бактерий, обладающих высокой конкурентоспособностью и эко-
номичным расходом углеводов ассимилятов на фиксацию азота. Эту задачу можно решить, лишь досконально изучив свойства каждого симбионта и особенности их взаимодействия в различных условиях внешней среды.
В почвах Амурской области обитают единственные в России природные популяции ризобий сои, представленные родами Sinorhizobium и Bradyrhizo-bium и обладающие большим разнообразием свойств (Тильба, 1998).
Впервые штаммы ризобий сои амурской селекции были выделены в чистую культуру в 1974 году научным сотрудником лаборатории микробиологии ВНИИ сои С.А. Бегуном (Бегун, 1983). С этого времени в лаборатории отрабатывались и осваивались различные методы селекционной работы по оценке и отбору перспективных штаммов ризобий сои.
Второй партнёр по симбиозу - соя, занимает первое место в мировом земледелии по распространенности среди зернобобовых культур. Большой удельный вес сои в группе растений, богатых белком, объясняется главным образом особенностями химического состава её зерна.
Соя - белково-масличная культура. В зависимости от условий произрастания и сорта содержание белка в семенах обычно колеблется в пределах 37-45% и масла - 16-27%. По содержанию белка соя превосходит все полевые культуры, кроме люпина. По количеству масла в группе зернобобовых культур сою превосходит только арахис.
Важнейшим преимуществом сои в сравнении с другими зернобобовыми культурами является то, что она содержит много белка высокого качества. В нём имеются все незаменимые аминокислоты. По своему составу белок сои относится к числу хорошо усвояемых, высокопитательных и близок по составу к белкам животных (Баранов, 2002).
Центром производства зерна этой культуры в России является Дальний Восток. Южные районы российского Дальнего Востока являются ареалом распространения дикорастущей сои (Glycine soja Siebold et Zucc), которая находится в симбиотических взаимоотношениях с аборигенной популяцией ризобий
7 сои. За счёт этого симбиоза растение может обеспечиваться биологическим азотом до 80% от общей потребности (Тильба, 1998).
Актуальность темы. Максимальное вовлечение азота воздуха в биологический круговорот является одной из важнейших задач сельскохозяйственной науки во всех регионах страны.
Особенностью юга Дальнего Востока является повсеместное распространение дикой сои и сложившиеся за достаточно продолжительный естественно-исторический отрезок времени симбиотические (мутуалистические) отношения со специфичными для сои клубеньковыми бактериями. Благодаря этим взаимоотношениям растение сои может обеспечить себя биологическим азотом на 80-90% от общей потребности (Тильба, 1998).
Изучение свойств указанной популяции дает возможность научно обосновать мероприятия повышения продуктивности соево-зерновых севооборотов и разработать приемы устойчивого функционирования уникального агрофито-ценоза.
Использование высокоактивных штаммов ризобий сои позволит дополнительно получить значительное количество белковой продукции. Одновременно появляется возможность повысить энергетический уровень почвенных процессов агроэкосистемы за счет поступления в почву органических веществ с повышенным содержанием белка (Тильба, 1998).
Рациональное использование свойств аборигенной популяции ризобий сои, в перспективе, несомненно, является важным элементом "биологизации земледелия и создания адаптивно-интенсивной стратегии соеводства" (Жучен-ко, 1995).
Цель работы. Биологический потенциал микросимбионтов и различия в реакции партнеров симбиоза на одни и те же экологические факторы изучены недостаточно, поэтому целью работы является исследование культуральных и физиолого-биохимических свойств выделенных из природных популяции Приамурья ризобий сои в разных экологических условиях для выявления и отбора пригодных для хозяйственного использования эффективных штаммов.
8 Задачи исследования. При выполнении работы были определены следующие задачи:
Изучить основные физиолого-биохимические, культуральные, практически значимые свойства клубеньковых бактерий сои, выделенных из аборигенных популяций.
Выявить различия в свойствах ризобий видов Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii.
Используя методы аналитической селекции, рекомендовать наиболее эффективные штаммы, положительно воздействующие на урожай семян сои, для дальнейшего использования биологической азотфиксации в сельском хозяйстве с целью повышения эффективности азотфиксирующего симбиоза.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Аборигенные штаммы ризобий сои видов В. japonicum и S. fredii суще
ственно различаются по степени адаптации, культуральным, физиологическим
и хозяйственно-ценным свойствам.
2. Выявлены закономерности проявления свойств ризобиями видов
В. japonicum и S. fredii. В составе аборигенных популяций ризобий сои имеются
штаммы с различными сроками появления колоний в чашках Петри на мине
рально-растительной среде (МРС), отношением к различным источникам угле
родного питания, способности изменять реакцию среды, осмоустойчивости, от
ношению к различным рН и температурам выращивания, в том числе способ
ные существенно повышать зерновую продуктивность растений за счёт сим-
биотических (мутуалистических) отношений.
Научная новизна. Впервые в России проведено системное изучение и дана сравнительная оценка штаммов клубеньковых бактерий сои В. japonicum и S. fredii, выделенных из самых северных в мире природных популяций этих бактерий.
Выделено около 300 штаммов клубеньковых бактерий.
Выявлена способность чистых культур ризобий сои стимулировать энергию прорастания семян, их всхожесть.
Впервые проведен сравнительный рестрикционный анализ 16S - фрагментов ДНК штаммов S. fredii и В. japonicum.
Установлены различия основных свойств S. fredii и В. japonicum, изучено их влияние на урожай растения - хозяина.
Практическая ценность работы. Выделенные штаммы клубеньковых бактерий сои, обладающие высокой эффективностью, предложены для производства соевого нитрагина, которым в опытно-производственном хозяйстве ВНИИ сои обрабатываются семена.
4 штамма ризобий сои из изучаемой коллекции ежегодно передаются в научно-исследовательские учреждения КНР для исследований.
В 2002 году штаммы МБ-86 и БМ-60, показавшие высокую эффективность в полевых опытах, были переданы во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов ВНИИСХМ, Географическую сеть опытов с нитрагином.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на годичном собрании Дальневосточного научно-методического центра (ДВ НМЦ) по проблеме использования природного потенциала почв региона при формировании урожая сельскохозяйственных культур в условиях изменения природной и хозяйственной ситуации (Уссурийск - п. Тимирязевский, 1998); III Дальневосточной региональной конференции "Новые научные технологии в Дальневосточном регионе" (Благовещенск, 1999); на научной конференции, посвященной памяти Е.Н. Мишустина "Научное наследие Е.Н. Мишу-стина" (Благовещенск, 2001); координационном совещании по сое (Благовещенск, 2002); VII региональной школе - конференции по актуальным проблемам биологии и химии (Владивосток, 2003); международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы биологии, селекции и семеноводства сои" (Благовещенск, 2003); V региональной научно-практической конференции "Молодежь XXI века: шаг в будущее" (Благовещенск, 2004); 8-й
10 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пушино, 2004); XII международном научном форуме "Ломоносов -2005" (Москва, 2005); III школе-семинаре "Территориальные исследования Дальнего Востока" (Биробиджан, 2005).
Публикации результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 10 работ.
Исследования проводили в течение 1996-2004 гг. по государственным заданиям:
Тема 02.01 "Повышение потенциала биологической азотфиксации в почвах Дальнего Востока (соево-зерновые севообороты) с помощью новых штаммов ризобий сои", № гос. регистрации 01.9.70006103; Тема 02.03.04 "Интенсифицировать симбиотическую азотфиксацию в соесеющей зоне с использованием новых штаммов ризобий, с учетом сортовых особенностей культуры, как составной части адаптивных агроландшафтов", № гос. регистрации 01.200.117058.
Механизмы симбиотических взаимоотношений сои с клубеньковыми бактериями
"Мало найдется примеров, где бы так ясно определилась взаимная роль теории и практики, как в тех исследованиях, в которых научный вопрос о происхождении азота растения неразрывно сплелся с чисто практическим вопросом о пользе возделывания бобовых растений" К.А. Тимирязев (1937).
Взаимоотношения организмов, в том числе микроорганизмов и высших растений, чрезвычайно сложны. Поэтому рассматривать то или иное проявление сожительства, не поняв его суть и не выяснив управляющие им механизмы нельзя, четких и резких различий между отдельными формами взаимосвязей в природе обычно не наблюдается. Один и тот же тип влияния единого организма на другой можно и даже нужно рассматривать во многих аспектах (Мильто, 1982).
В случае бобово-ризобиального симбиоза, как частного примера взаимодействий высших растений и микроорганизмов, имеются постепенные переходы между крайними комбинациями от положения, когда сожительство микроба и высшего растения создает систему, способную к интенсивной фиксации молекулярного азота, до положения, при котором микроорганизмы выступают в роли паразита высшего растения (Кретович, 1987). Это значит, что растения обладают универсальными системами взаимодействия с микроорганизмами, однако они могут быть мутуалистическими или антагонистическими в зависимости от формы микросимбионта, условий среды, генотипа конкретных особей и других (Тихонович, 1997). У нас в стране принято термин «симбиоз» использовать для обозначения взаимовыгодных для обоих партнеров отношений (му-талистических). Паразитические отношения выделяются особо.
Трудно себе представить, чтобы образование симбиотической системы произошло случайно между организмами, которые до этого не имели между собой ничего общего. Высказывается мнение, что симбиотический комплекс мог возникнуть только из первоначальной непостоянной связи двух компонентов. Внешние условия, какие-то неизвестные нам изменения среды, приводили только к укреплению уже существующей связи (Квиспел, 2002).
Среди всех микробно-растительных симбиозов лучше всего изучены симбиозы, образуемые бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями. Это обусловлено легкостью культивирования микросимбионтов, образованием у растений морфологически выраженных симбиотических органов - клубеньков, а также возможностью точного измерения биологического эффекта симбиоза (количество зафиксированного из атмосферы азота, прибавка массы растений). К настоящему времени выяснилось, что образование бобово-ризобиального симбиоза тесно связано со многими фундаментальными функциями растений - цитодифференцировкой и органогенезом, азотным и углеродным обменом, защитой от патогенов и регуляцией развития. Поэтому одной из важнейших причин для изучения симбиоза стала возможность его использования в качестве очень удобной модели для разработки ряда фундаментальных и прикладных проблем биологии и генетики развития высших растений (Спайнк, Кондороши, Хукас 2002). Немаловажным стимулом для изучения бо-бово-ризобиального симбиоза является и его большая практическая значимость: целый ряд бобовых (например, соя, люцерна, горох, арахис) относится к числу ключевых сельскохозяйственных культур, выращивание которых на экологически чистом "биологическом" азоте - весьма актуальная задача.
Открытие клубеньковых бактерий М. Бейеринком (1888) сделало эти микроорганизмы объектом многочисленных микробиологических, а с конца 1950-х гг. - и генетических исследований (Тихонович, 1998). Едва ли ещё какая-либо особенность бобовых растений изучалась столь подробно и в самых различных аспектах, как их корневые клубеньки (Вернер, Гордиенко, 1967).
Изучение способности ризобий изменять реакцию среды
Приготовление сред проводили по стандартной методике (Егоров, 1976) в модификации В.А. Тильбы и С.А. Бегуна (2005). В работе использовали мясо-пептонный агар (МПА) - универсальную питательную среду заводского производства и минерально-растительную агаризованную питательную среду (МРС), основой для приготовления которой служит соевый отвар. МРС имеет следующий состав, г/л: К2НР04- 0,5; КН2Р04 - 0,5; MgS04 - 0,1; CaS04- 0,1; NaCl -0,2; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука - 10, агар-агар - 20.
Соевую муку готовили следующим образом: семена сои проращивали в специальных эмалированных поддонах на влажной фильтровальной бумаге при температуре 26-28С, проростки высушивали в сушильном шкафу при темпера туре 60-80С и размалывали с помощью стандартной лабораторной мельницы МЛ-3. Далее готовили соевый отвар. Для этого брали 10 г соевой муки, заливали 1 л дистиллированной воды и кипятили 30 мин. Затем полученный отвар фильтровали через ватно-марлевый фильтр и доводили объём до 1 л. Сюда же добавляли остальные компоненты МРС, отвешенные на лабораторных весах ВЖТ-500. Питательную среду варили до тех пор, пока не исчезали плотные частицы агара, и жидкость становилась однородной.
После приготовления среду разливали с помощью химического стакана по пробиркам на одну треть объёма. Пробирки закрывали ватными пробками и стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1 атм. После стерилизации пробирки размещали в специальные наклонные пластмассовые штативы с углублениями для пробирок для скашивания агаризованной питательной среды. При этом следили, чтобы питательная среда имела наибольшую площадь, но не доходила до ватных пробок. Через 20-40 мин питательная среда застывала в скошенном состоянии, и пробирки со скошенным агаром были готовы для посева. Пробирки маркировали и использовали.
Выделение в чистую культуру клубеньковых бактерий из клубеньков сои Выделение клубеньков сои проводили по стандартной методике (Лунин, 1977) в модификации В.А. Тильбы и С.А. Бегуна (2005).
В фазы цветения-плодообразования отбирали хорошо развитые растения культурной (Glycine max. (L.) Мегт.) и дикорастущей (Glycine soja Siebord et Zucc.) сои и с их корней отрывали плотные крупные клубеньки. Клубеньки тщательно отмывали водой от почвенных частиц и помещали в фарфоровый тигель Гуна с сетчатым дном. Тигель последовательно погружали на 1 минуту в фарфоровые чашки несколько большего размера сначала с 96% этиловым спиртом. Первое погружение в спирт обеспечивает обезжиривание клубеньков с целью лучшей стерилизации их сулемой. Второе погружение клубеньков в спирт удаляет остатки сулемы с их поверхности (рис. 1).
Отношение к NaCl
Исследователями дальневосточных природных популяций ризобий сои В.А. Тильбой и С.А. Бегуном (1992) были выявлены существенные различия между быстро- и медленнорастущими группами бактерий по солеустойчивости.
В 1997-2002 гг. работы по изучению солеустойчивости штаммов S. fredii и В. japonicum были продолжены. Чувствительность клубеньковых бактерий сои к концентрации NaCl в среде оценивали по их способности расти на минимальной питательной среде с различными концентрациями NaCl (0; 0,3; 23,4 г/л, что соответствует ОМ; 0,005 М; 0,4 М). Опыты закладывали по методике, изложенной в разделе 2.3.2. Ежегодно исследовали не мнее 10 штаммов ризобий сои каждого вида. Каждый штамм оценивали в 3-х кратной повторности. Шкала оценки интенсивности роста штриха четырех балльная. Штаммы ризобий сои В. japonicum на минимальной питательной среде без поваренной сои вели себя неоднозначно (табл. 9).
Часть исследуемых штаммов: БМ-58, БМ-73, ММ-107, ММ-117, ММ-120, ТМ-469, ТМ-474, ТМ-507, ТМ-552, ТМ-558 при нулевой концентрации NaCl в среде показали умеренный рост.
Штаммы 648а, ТМ-437, 944, БМ-68, ММ-113, ТМ-459/ТМ-500, ММ-122, ТМ-553, ТМ-555, ТМ-556, ТМ-560, ТМ-561, СМ-42 давали хороший рост в варианте с нулевой концентрацией NaCl в питательной среде.
Обильный рост показали штаммы ТМ-440, БМ-60, ТМ-455, ТМ-503, ТМ-517,СМ-41.
При добавлении 0,3 г/л поваренной соли в питательную среду, показатели роста штаммов В. japonicum не изменились. Исключение составили штаммы 944, БМ-58, БМ-60, ТМ-455, ТМ-500, ТМ-503, ТМ-553, СМ-41, интенсивность роста которых снизилась на 1 балл.
При повышении концентрации поваренной соли в среде до 23,4 г/л все исследуемые штаммы В. japonicum вели себя однозначно. Показатель роста штаммов ризобий сои медленнорастущего вида на питательной среде с концентрацией 0,4 М составил 1 балл, что соответствует скудному росту. Исключение составил штамм ТМ-507, который при такой концентрации NaCl в среде вообще прекратил свой рост (табл. 9).
Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявили, что при концентрации поваренной соли в питательной среде 23,4 г/л штаммы ризобий соли В. japonicum дают скудный рост или вообще не растут.
Штаммы клубеньковых бактерий сои вида S. fredii БД-32, ТБ-490 и ТБ-498 на минимальной питательной среде без поваренной соли показали умеренный рост. На питательной среде с концентрацией NaCl 0,005 М штаммы БД-32 и ТБ-498 не изменили характера роста (табл. 10).
Штаммы МБ-85, МБ-112, ТБ-471, ТБ-479, ТБ-496, ТБ-506, ТБ-509, ТБ-514, ТБ-523 при нулевой концентрации NaCl в питательной среде давали хороший рост.
Штаммы ТБ-417, ТБ-407, СБ-39, ББ-55, МБ-119, ТБ-472, ТБ-477, ТБ-491, ТБ-508, ТБ-478, ТБ-488, ТБ-491, ТБ-524, ТБ-526, ТБ-549, ТБ-563 показали обильный рост как при нулевой концентрации NaCl в питательной среде, так и при концентрации NaCl 0,005 М.
Штаммы ТБ-425 и ТБ-475, показавшие обильный рост на минимальной питательной среде без поваренной соли, уже при концентрации NaCl в среде 0,005 М снизили рост соответственно на 3 и 1 балл.
