Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15-97
1.1. Бруцеллез, историческая справка 15-16
1.2. Распространение, источники, пути передачи и течение инфекции 16-22
1.3. Диагностика бруцеллеза животных 22-42
1.3.1. Серологические методы диагностики бруцеллеза 22-36
1.3.1.1. Реакция агглютинации (РА) 22-23
1.3.1.2. Реакция связывания комплемента (РСК) 23-25
1.3.1.3. Кольцевая реакция с молоком (КР) 25-27
1.3.14. Розбенгал проба (РБП) 27-28
1.3.1.5. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) 28-31
1.3.1.6. Реакция нейтрализации антител (РИА Т) 31 -32
1.3.1.7. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) 32-33
1.3.1.8. Иммуноферментный анализ (ИФА) 34-37
1.3.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза 37-38
1.3.3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза 38-39
1.3.4. Молекулярно-генетические методы диагностики бруцеллеза 39-42
13.4.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40-42
1.4. Специфическая профилактика бруцеллеза 42-46
1.5. Средства специфической профилактики бруцеллеза 46-46
1.5.1. Живые противобруцеллезные вакцины 47-57
1.5.2 Инактивированные противобруцеллезные вакцины 57-72
1.5.3. Изыскание оптимальных доз и схем применения противобруцеллезных вакцин 72-75
1.6. Инфекционный эпидидимит баранов (ИЭБ) 75-85
1.6.1. Распространенность болезни 75-77
1.6.2. Диагностика ИЭБ 78-83
1.6.3. Специфическая профилактика ИЭБ 83-85
1.7. Анализ обзора литературы 85-97
2. Собственные исследования 98-189
2.1. Материалы и методы исследований 98-107
2.2. Результаты исследований 108-189
2.2.1. Ретроспективное изучение эпизоотического со
стояния по бруцеллезу животных в Киргизии 108-134
2.2.1.1. Бруцеллез крупного рогатого скота 108-125
2.2.1.2. Бруцеллез мелкого рогатого скота 125-132
2.2.1.3. Инфекционный эпидидимит баранов 132-134
2.2.2. Изучение противоэпизоотическои эффективности вакцины из штамма 104М В.abortus на крупном рогатом скоте 134
2.2.3. Изучение противоэпизоотическои эффективности вакцины из штамма 19 В. abortus в уменьшенной дозе 147
2.2.4. Изучение иммуногенных свойств вакцин из штаммов B.abortusKB17/100 и B.abortus 75/79-АВ в опыте на крупном рогатом скоте 154
2.2.5. Изучение свойств адъювант-вакцин из штаммов В. abortus 45/20 и B.melitensis 53Н38 в опыте на овцах 161-170
2.2.5.1. Изучение реактогенности адъювант-вакцин 161 -165
2.2.5.2. Изучение антигенных свойств адъювант-вакцины 165
2.2.5.3. Изучение иммуногенных свойств адъювант-вакцин 168
6. Изыскание средств для специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов 170-173
7. Изучение возможности применения роз бенгал пробы с цельным молоком для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота 173-181
8. Изучение возможности применения КР с молоком для диагностики бруцеллеза овец и коз 181 -186
9. Экономическая эффективность противобруцеллезных мероприятий, проводимых без применения и с применением вакцины из штамма 19 187-189
3. Обсуждение результатов исследований 190-216
Выводы 217-221
Практические предложения 222-223
Список литературы 224-294
Приложение 295-298
- Серологические методы диагностики бруцеллеза
- Изыскание оптимальных доз и схем применения противобруцеллезных вакцин
- Изучение противоэпизоотическои эффективности вакцины из штамма 104М В.abortus на крупном рогатом скоте
- Изыскание средств для специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов
Серологические методы диагностики бруцеллеза
Реакцию агглютинации стали применять для диагностики бруцеллеза одной из первых (370). Со временем было установлено, что исследование проб сыворотки крови в РА в начальный период болезни позволяет выявить большее количество больных бруцеллезом животных, чем исследование в более поздние сроки с момента заболевания (24, 37, 41, 48, 157, 174, 188, 190, 241, 302, 453).
В ходе многочисленных исследований в этой реакции проб сыворотки крови был установлен «феномен зоны» - (прозона). Про-зоной считают отсутствие аггллютинации антигена сыворотками в малых разведениях (1:25, 1:50) и наличие ее при исследовании сывороток в последующих разведениях. Исчерпывающего объяснения этому феномену нет. Некоторые исследователи считают возможной причиной прозоны присутствие в сыворотке крови неполных антител или их более высокий авидитет к антигену по сравнению с полными антителами. Возможно причиной проявления прозоны являются некоторые физико-химические изменения в структуре белков сыворотки крови, о чем свидетельствует более частое блокирование антигена сыворотками, инактивированными при температуре 70 С (55).
В результате усовершенствования РА в пробирках была предложена, как казалось вначале, более специфичная, чувствительная, экономичная по времени постановки и используемым средствам пластинчатая РА на стекле (435). Однако при исследовании в модифицированной реакции длительно хранившихся проб сыворотки крови было отмечено появление неспецифических реакций (111, 132, 141, 193).
Впервые для диагностики бруцеллеза РСК была применена Holt в 1909 году. Тогда, с помощью этой реакции удалось распознавать больных бруцеллезом животных задолго до появления клинических признаков болезни. В последующем РСК была изучена рядом отечественных и зарубежных исследователей, которые пришли к выводу о ее специфичным и чувствительности при диагностике бруцеллеза (115, 320, 339, 425). Результаты исследования проб сыворотки крови в РА и РСК совпадают не всегда (4, 37,48, 62, 111, 141, 188, 190, 241, 524). Цветковым Н.Е. на основании результатов собственных исследований было установлено, что РСК превосходит по чувствительности РА (345). Согласно данным ряда авторов, изучавших возможность диагностики бруцеллеза с использованием РА и РСК у животных с различной давностью инфекции, было установлено, что комплементс-вязывающие антитела появляются в сыворотке крови животных позже, чем агглютинины, но сохраняются дольше последних (147, 314, 307, 336). В целом РСК является достоверным, но труднодоступным, особенно в полевых условиях, методом серологической диагностики бруцеллеза (324). С учетом результатов постановки РСК при различных температурных режимах была предложена реакция длительного связывания комплемента, которая в некоторых случаях является более чувствительной и специфичной, чем РСК (131, 263, 311). Большой интерес представляет обнаружение бруцеллезного антигена в инфицированном организме иммунобиологическими методами. Впервые метод обнаружения микробного антигена в организме с помощью высокоактивной диагностической сыворотки в РДСК был разработан В.И. Иоффе (125). Возможность использования РДСК для обнаружения антигена с целью ранней диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота была подтверждена исследованиями Аливердиева А.А. (8). По данным авторов, в свежих очагах бруцеллеза крупного рогатого скота, сыворотки крови которого не реагируют в РА, РСК, исследование материала от этих животных на наличие антигена в РДСК дает положительный результат, а в дальнейшем такие коровы абортируют и дают положительные РА и РСК (287). Жованик П.Н. исследовал материал от 128 животных неблагополучного по бруцеллезу стада в РДСК и обнаружил у 60 голов бру 25 целлезный антиген. При этом пробы сыворотки крови от животных, у которых выявили наличие антигена, реагировали положительно в РА иРДСК(ЮО). Впервые кольцевая реакция с молоком для исследования дойных коров на бруцеллез была предложена Fleichauer О. (463). Сущность реакции заключается в том, что при наличии в молоке специфических антител происходит агглютинация антигена окрашенного гематоксилином, а образовавшийся комплекс антиген-антитело адсорбируется жировыми шариками молока, которые поднимаясь вверх, образуют кольцо, окрашенное в синий цвет. Основная часть молока в пробирке не окрашена.
В результате многочисленных исследований установлено, что кольцевая реакция с молоком является специфичным и чувствительным методом диагностики бруцеллеза у животных с острым и хроническим течением инфекции и может применяться для контроля благополучия дойных стад по бруцеллезу (52,65, 155, 158, 184, 186, 195, 197,225,262, 321).
Триленко П. А. провел сравнительное изучение чувствительности и специфичности КР с молоком с другими серологическими методами и сделал вывод, что эта проба по количеству положительных реакций приближается к результатам исследования в РА и РСК (323).
Изыскание оптимальных доз и схем применения противобруцеллезных вакцин
Своевременно поставленный диагноз имеет главное значение в комплексе мер по ликвидации инфекционного эпидидимита баранов. Со времени открытия B.ovis было предложено много средств и методов диагностики этой болезни. Одним из первых диагностических методов стал клинический, который и до сих пор не утратил своей ценности, пальпацией семенников у баранов легко обнаруживают патологические изменения. У здоровых животных тестикулы подвижны в мошонке и легко сдвигаются вверх, у больных - их подвижность ограничена или совсем отсутствует. При пальпации тести-кулов отмечают отклонение от нормы их размеров, формы и консистенции (атрофия и гипертрофия) (395, 400).
Одновременно с клиническим в лабораторную практику начали внедрять и серологические методы диагностики. Причем, реакция агглютинации не получила широкого распространения, так как B.ovis в связи с утратой поверхностных антигенов, характерных для S-форм бруцелл, находится в стабильной R-форме и имеет тенденцию к самоагглютинации (404).
В ряде зарубежных стран в качестве основного метода диагностики инфекционного эпидидимита баранов используют РСК с корпускулярным антигеном (430).
В нашей стране применяют более чувствительную РДСК, предложенную Триленко П.А.. По данным автора, суть метода заключается в том, что более мелкие молекулы глубинного антигена R-форм бруцелл имеют более простую конфигурацию по сравнению с поверхностными антигенами и в связи с этим, для того чтобы осуществилась прочная связь между антигеном и антителом требуется больше времени и иные условия. Результаты данного метода в значительной степени зависят от качества антигена, так как многие антигены обладают антикомплементарной активностью.
Biberstein E.L., et al. первыми использовали водорастворимый антиген, полученный путем разрушения бактериальных клеток ультразвуком и не обладающий антикомплементарностью (406). Согласно результатам некоторых исследований РДСК позволяет выявлять зараженных животных на одну неделю раньше, чем РСК и титры в первой реакции чаще бывают вдвое выше, чем во второй (423). Существенными недостатками РА и РСК, несмотря на их достаточно высокую чувствительность, является наличие неспецифических показаний при исследования некоторых проб сыворотки крови, обусловленные различной степенью антикомплементарности применяемых антигенов (422, 541), а также утрата положительных показаний при исследовании проб сыворотки крови от заведомо больных баранов (77, 245, 442, 438, 450). В последние годы выполнены исследования по разработке новых, простых и эффективных методов серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов, таких как реакция иммуноф-луоресценции (РНИФ) (245, 286), реакция непрямой гемагглютина-ции (РИГА) (312, 286), реакция диффузной преципитации в агаровом геле (РДП) (515, 516), реакция нейтрализации антител (РНА), имму-ноферментный анализ (ИФА). Первые сообщения о результатах испытания метода имму-нофлюоресценции для идентификации возбудителей бруцеллеза в СССР были сделаны Песиной А.Г. с соавт. (276). Возможность обнаружения бруцелл в различных объектах с помощью РНИФ была установлена Moody M.D., et al (512) и Ганнуш-киным М.С. с соавт. (95). Хо-Шу-Тань исследуя на бруцеллез органы от абортировавших животных и абортированные плоды, подтвердил высокую чувствительность метода (344). Игнатьева О.В. с помощью РНИФ выявила бруцеллы в органах животных в ранние сроки после заражения (119, 120, 121). Чистов Н.П. с соавт. сравнивая прямой и непрямой варианты метода, выявил преимущества первого (353). Чернышева М.И. с соавт. (350) испытала прямой и непрямой варианты метода для дифференциации бруцелл с использованием, полученных ею, монорецепторных сывороток. Провести дифференциацию прямым методом авторам не удалось из-за слабого свечения бруцелл при обработке сыворотками. В непрямом варианте дифференциация бруцелл была осуществлена, что послужило основанием рекомендовать этот метод для дифференциации B.melitensis и В.abortus Katasec Е. изучал РНИФ при диагностике бруцеллеза животных, подвергавшихся лечению антибиотиками, и установил, что кратковременная антибиотикотерапия не отражается на степени свечения бруцелл, тогда как рост бруцелл на питательных средах зарегистрировать не удалось (485). Gentile F. применил непрямой метод иммунофлуоресценции для обнаружения антител в сыворотке крови животных в сравнении с РА и РСК. При исследовании 87,8 % из 500 проб сыворотки крови результаты, зарегистрированные в каждой из трех реакций, совпали (468, 467).
Изучение противоэпизоотическои эффективности вакцины из штамма 104М В.abortus на крупном рогатом скоте
В дальнейшем, за 1-2 месяца до искусственного осеменения их ре-иммунизировали без предварительного исследования на бруцеллез. Вакцинацию проводили ежегодно до прекращения клинического проявления бруцеллеза и сдачи на убой всех старых маточных отар.
С целью сделать борьбу с бруцеллезом эффективной в хозяйствах осуществляли поотарный учет иммунизированных животных, регистрировали все случаи абортов и рождения ослабленных и мертвых ягнят. Особое внимание уделяли своевременной изоляции и удалению из отар абортировавших овцематок. Регулярно проводили дезинфекцию - плановую и вынужденную. Баранов производителей и пробников не вакцинировали, а только исследовали на бруцеллез серологическим методом.
Ежегодная иммунизация овец в неблагополучных отарах с одновременным осуществлением мероприятий общей профилактики бруцеллеза способствовали оздоровлению многих овцеводческих ферм. Хотя в целом, количество неблагополучных пунктов в республике снизилось не существенно. В частности, в 1966 году в республике насчитывалось 346 ферм неблагополучных по бруцеллезу овец, и было зарегистрировано 296 случаев абортов овцематок бруцеллезной этиологии. Рост числа новых неблагополучных пунктов шел за счет инфицирования поголовья ранее благополучных ферм.
В связи с этим с 1967 года иммунизацию овец вакциной из штамма 19 стали проводить на всех угрожаемых по бруцеллезу фермах. Эффективность массовой иммунизации ярок и овцематок выразилась в значительном улучшении эпизоотологических и эпидемиологических показателей (таблица 5).
Как видно из материалов таблицы в республике значительно уменьшилось выделение больных животных. Уже в 1967 году было выделено только 0,9% больных овец, тогда как в 1966 их было 2,4 %.
Снижение заболеваемости овец наблюдалось и в последующие годы. Значительно сократилось количество неблагополучных отар с 346 в 1966 году до 88 в 1976 году. Существенно уменьшилась заболеваемость баранов-производителей, с 0,12% в 1966 году до 0,05% в 1976 году при сокращении в 1,6 раза количества неблагополучных отар. В течение десятилетнего применения вакцины из штамма 19 наблюдалось неуклонное снижение количества абортов у овцематок, с 219 в 1966 году до 71 в 1976 году, и количества ежегодно заболевающих бруцеллезом людей. Хотя, необходимо отметить, что за достаточно долгий период применения вакцины из штамма 19 полностью искоренить бруцеллез мелкого рогатого скота в республике не удалось. В связи с чем с 1976 году для иммунизации овец начали применять вакцину из штамма В. melitensis Rev-1.
Наставлением по применению регламентировалась однократная иммунизация данной вакциной ярок, так как считалось, что она создает иммунитет до конца хозяйственного использования овцематок. Животных, ранее привитых вакциной из штамма 19, вакциной из штамма Rev-1 не иммунизировали. Материалы, отражающие состояние овцеводства по бруцеллезу в период иммунизации ярок вакциной из штамма Rev-1 представлены в таблице 6.
Табличные данные свидетельствуют о значительном последовательном ухудшении эпизоотической обстановки по бруцеллезу. Так, в 1989 году в сравнении с 1977 годом, количество заболевших овцематок увеличилось более чем в 6 раз, а баранов-производителей - в 17 раз, почти в 7 раз больше было зарегистрировано абортов бруцеллезной этиологии, в 2,6 раза увеличилось количество неблагоплучных по бруцеллезу отар и в 2, 65 раза больше заболело людей.
Осложнение эпизоотической обстановки по бруцеллезу овец можно объяснить неверной схемой применения вакцины. Известно, что им-муногенность вакцины из штамма Rev-1 для овец превышает таковую вакцины из штамма 19 в 2 раза. Однако однократная иммунизация только ярок обеспечивала защиту от заражения бруцеллезом в течение 1-2 лет. Поэтому в последующем было необходимо проводить ежегодную реим-мунизацию всего привитого поголовья, а этого сделано не было.
В связи с осложнением эпизоотической обстановки по бруцеллезу овец была предложена новая схема применения вакцины из штамма 19. Наряду с вакцинацией ярок указанной вакциной начали ежегодно ревакцинировать овцематок, что незамедлительно отразилось на эпизоотической ситуации по бруцеллезу овец в республике (таблица 7).
Согласно данным, представленным в таблице 7, в 1993 году через три года с момента применения вакцины из штамма 19 по новой схеме число абортов бруцеллезной этиологии сократилось в 2,5 раза, а процент культур бруцелл, выделенных при бактериологическом исследовании абортплодов - в 8,8 раз; количество положительно реагирующих при серологическом исследовании баранов-производителей уменьшилось в 2,7 раза и в 3 раза сократилось число заболевших бруцеллезом людей.
Изыскание средств для специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов
Сравнительное испытание эффективности вакцин из штаммов Rev-1, 104М, 45/20, 53Н38 против инфекционного эпидидимита баранов было проведено в опыте с заражением культурой B.ovis баранов через 9 и 21 месяцев после иммунизации, а также через 9 мес. после реиммунизации указанными вакцинами (рисунок 9).
При бактериологическом исследовании наименьшее количество животных, защищенных от заражения, было зарегистрировано в группе, привитой вакциной из штамма 45/20 - 35 %; среди привитых вакциной из штамма 53Н38 таких оказалось - 45 %; из штамма 104М- 60 %; из штамма Rev-1 - 75 %.
При заражении через 21 месяц другой части животных иммунными оказалось по 20 % баранов в группах, привитых вакцинами из штамма Rev-1 и 104М. Все бараны, иммунизированные вакцинами из штаммов 53Н38 и 45/20, оказались зараженными бруцеллезом.
Количество животных, устойчивых к заражению вирулентной культурой бруцелл, в группах, реиммунизированных вакцинами из штаммов 45/20 и 53Н38, было одинаковым и составило 45%, а в группах, реиммунизированных вакцинами из штамма Rev-1 и 104М, достигло 80 %. Однако, при исследовании в РА, РБП и в РСК проб сыворотки крови баранов, привитых вакциной из штамма Rev-1, антитела, особенно комплементсвязывающие, сохранялись более 270 дней. В то время как антитела, синтезированные в ответ на введение вакцины из штамма 104М, не выявляли уже через 150 дней. Короткий период поствакцинальной серопозитивности позволил приступить к скорейшему проведению диагностических исследований при оздоровлении неблагополучных хозяйств и при продаже животных из благополучных отар.
При бактериологическом исследовании материала от баранов, выполненном в процессе изучения вакцинального процесса через 60 дней после иммунизации их вакциной из штамма 104М, выделить культуру бруцелл не удалось.
Таким образом, вакцина из штамма 104М, с учетом ее низкой остаточной вирулентности, умеренной агглютиногенности и реактоген-ности, выраженной иммуногенности оказалась более предпочтительной для применения с целью профилактики и при оздоровлении баранов от ИЭБ, чем вакцины из штаммов Rev-1, 45/20 и 53Н38.
С учетом результатов испытаний и с разрешения Главного управления ветеринарии Госагропрома Киргизской ССР вакцина из штамма 104ММ была использована в комплексе с другими противобруцеллез-ными мероприятиями при оздоровлении от ИЭБ совхоза «Шамси» Чуй-ского района, неблагополучного по данной болезни с 1975 года.
Согласно результатам двукратного комплексного исследования, проведенного перед применением вакцины, из 236 голов (200 баранов производителей и 36 баранчиков 8-12 месячного возраста) больными оказались 1,6%. После выбраковки больных, условно здоровых баранов в количестве 232 голов иммунизировали вакциной из штамма 104М. Иммунизированных животных содержали в кошаре, водопой и кормление осуществляли тут же. Помещение через каждые 25-30 дней очищали от навоза и дезинфицировали 3 %-ным горячим раствором каустической соды. В летнее время баранов выпасали изолированно на отдельных пастбищах.
Исследование проб сыворотки крови животных проводили в РДСК с овисным антигеном ежемесячно до получения двукратного подряд отрицательного результата. В течение всего периода исследования было выделено 3 положительно реагирующих животных, одно - через три, два - через шесть месяцев после прививки. После получения дважды подряд отрицательных результатов отара была поставлена на шестимесячный контроль. За этот период времени баранов исследовали еще дважды серологическим методом через три и шесть месяцем и шесть раз клиническим методом. Больных животных при этом выявлено не было.
Полученные результаты послужили основанием рекомендовать вакцины из штаммов 104М и Rev-1 для применения в республике с целью профилактики и при оздоровлении животных в неблагополучных хозяйствах от ИЭБ. Вакцины применяли в соответствии с разработанными нами «Рекомендациями по специфической профилактике инфекционного эпидидимита баранов в Киргизской ССР», утвержденными 3 января 1986 года ГУВ МСХ Киргизской ССР.
Кроме того, материалы по изучению вакцины из штамма Rev-1 были использованы при разработке Наставления по применению вакцины живой сухой из штамма Rev-1 Бруцелла мелитензис для иммунизации овец и коз против бруцеллеза и инфекционного эпидидимита баранов, вызываемого возбудителем бруцелла овис", утвержденного ГУВ Госагропрома СССР 1 октября 1986 года.
