Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Краткая характеристика артрита-энцефалита коз 12
1.1.1. Клиническая картина 15
1.1.2. Патологоанатомические изменения 16
1.2. Морфология, физико-химическая характеристика и строение генома лентивирусов 17
1.3. Распространение АЭК в мире 22
1.4. Методы диагностики, вирусологического и серологического мониторинга АЭК 24
1.4.1. Выделение вируса АЭК 25
1.4.2. Реакция диффузной преципитации (иммунодиффузии) 27
1.4.3. Твердофазный иммуноферментный анализ 28
1.4.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 30
1.4.5. Реакция непрямой иммунофлуоресценции 32
1.4.6. Экспериментальная инфекция 33
1.5. Дифференциальная диагностика 34
1.6. Профилактика и меры борьбы 34
1.7. Заключение по обзору литературы 37
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Материалы 38
2.1.1. Вирусы 38
2.1.2. Животные 38
2.1.3. Культуры клеток 38
2.1.4. Питательные среды и добавки 39
2.1.5. Сыворотки крови 39
2.1.6. Полевой материал 40
2.1.7. Ферменты 40
2.1.8. Реактивы и оборудование, использованные в работе 40
2.2. Методы 42
2.2.1. Культивирование вируса АЭК 42
2.2.2. Приготовление специфических и нормальных культуральных антигенов 44
2.2.3. Получение форменных элементов крови 44
2.2.4. Выделение'нуклеиновых кислот 44
2.2.5. Синтез к ДНК 46
2.2.6. Постановка ПЦР 46
2.2.7. Анализ ПЦР продуктов 47
2.2.8. Компьютерный анализ 47
2.2.9. Выделение РНК вируса АЭК из инфицированных лейкоцитов периферической крови, клеток культуры ЛЭО и проб патологического материала 48
2.2.10. Экспериментальное заражение животных 48
2.2.11. Получение сывороток крови 48
2.2.12. Статистические методы исследования 49
2.2.13. Единый метод эпизоотологического исследования 49
2.3. Результаты собственных исследований 49
2.3.1. Сравнительно-географический и сравнительно-исторический анализ распространения АЭК в мире 49
2.3.2. Определение и ранжирование зон риска возникновения АЭК в различных географических и климатических зонах РФ 58
2.3.3. Разработка тест-системы для выявления РНК вируса артрита-энцефалита коз методом полимеразной цепной реакции 60
2.3.4. Эпизоотологический мониторинг АЭК на территории РФ 69
2.3.5. Изучение восприимчивости культур клеток, лабораторных и сельскохозяйственных животных к вирусу АЭК 84
2.3.6. Изучение особенностей клинического проявления и патоморфологических изменений при АЭК у естественно инфицированных коз.89
2.3.7. Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации АЭК в хозяйствах РФ и апробация их на практике 93
3. ОБСУЖДЕНИЕ 95
4. ВЫВОДЫ 102
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 104
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 116
- Морфология, физико-химическая характеристика и строение генома лентивирусов
- Культивирование вируса АЭК
- Сравнительно-географический и сравнительно-исторический анализ распространения АЭК в мире
Введение к работе
Актуальность темы. Артрит-энцефалит коз (АЭК) - болезнь,
характеризующаяся длительным инкубационным периодом,
продолжительным течением и персистенцпей вируса. Артрит-энцефалит коз поражает коз, вызывая гибель 100% зараженных животных.
Возбудителем артрита-энцефалита коз является вирус, относящийся к семейству ретровирусов, роду лентивпрусов, куда входят также антигенно и генетически родственные вирусы висиа-маеди овец, инфекционной анемии лошадей и иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2)[1; 10; 28; 91].
Болезнь поражает козлят, ягнят и телят. Предположительно, спектр восприимчивых к вирусу АЭК животных не ограничивается парнокопытными жвачными и в эпизоотологический процесс могут вовлекаться грызуны, собаки, кошки, приматы и т.д. [14; 40; 45].
АЭК является медленной инфекцией животных - традиционно сложившееся наименование группы инфекционных болезней, которая представляет собой серьёзную проблему для животноводства в связи с их скрытым течением, летальным исходом, отсутствием средств лечения и профилактики [5]. В основном - это болезни, поражающие только один орган или систему тканей и один вид животных или родственные виды, принадлежащие к одному семейству или отряду [15]. К группе медленных инфекций животных относятся как болезни, вызываемые прионами -губкообразная энцефалопатия КРС, скрепи, так и вирусами - алеутская болезнь норок, инфекционная анемия лошадей, артрит-энцефалит коз и другие болезни [54].
Для медленных инфекций характерно отсутствие сезонности и периодичности эпизоотии, географической приуроченности. В то же время чётко прослеживается энзоотичность болезней [10].
Дувас Анджелин и Эресман Гленн из Университета Южной Калифорнии, используя ПЦР-анализ, представили доказательства инфицирования вирусом АЭК людей. Возбудитель АЭК передается со свежим (не подвергавшимся пастеризации) козьим молоком, что объясняет его широкое распространение среди людей в странах с активным козоводством: Мексика, Центральная Америка. Контакт человека с вирусом АЭК может стимулировать иммунный ответ на него, обуславливающий перекрестную реакцию с ВИЧ-1 в лабораторно-диагностических методах [14].
В Российской Федерации по последним данным 23 млн. голов мелкого рогатого скота (овцы, козы). В последнее время интерес к козоводству связан с возрастающей потребностью населения в диетических продуктах питания, к которым относится козье молоко. Наметилась тенденция к формированию системы фермерских козоводческих хозяйств, пополняющих отечественный генофонд животных по каналам Международной Ассоциации Козоводов.
По данным Всемирной организации здоровья животных OIE АЭК встречается во многих странах мира и на всех континентах (Австралия, Дания, Германия, Франция, Канада, Кения, Норвегия, Великобритания, Новая Зеландия, США и др.). В недавних сообщениях отмечается, что болезнь обнаруживают в тех странах, где до этого ее не регистрировали. Так, в сообщении OIE от 20 апреля 2005 года говорится о возникновении инфекции в Боснии и Герцеговине [45].
Учитывая эпизоотологические особенности АЭК, можно предположить вероятность гораздо более широкого распространения этой болезни в зарубежных странах, чем это отражается данными МЭБ.
Наличие на территории РФ потенциально-восприимчивых животных в сочетании с социально-экономическими фоновыми показателями, указывает на высокую вероятность возникновения и распространения АЭК в России. Кроме того, в козоводческих хозяйствах
России обнаружены случаи заболевания коз, по клиническим и патологоанатомическим признакам напоминающие симптомы АЭК, описанные в научной литературе. Эпизоотологический анализ показал, что такие животные завезены из неблагополучных по АЭК стран. В тоже время, в РФ отсутствуют как средства диагностики болезни, так и меры борьбы с ней.
В связи с вышеизложенным, проведение научных исследований по изучению эпизоотологии АЭК, разработке средств и методов диагностики, мер борьбы с болезнью является актуальным.
Цель и задачи исследований
Цель работы: провести эпизоотологический мониторинг артрита-энцефалита коз в Российской Федерации, разработать средства и методы диагностики болезни, а также комплекс мероприятий по ликвидации и профилактике АЭК.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Провести эпизоотологический анализ нозоареала АЭК в мире.
Определить и ранжировать зоны риска возникновения АЭК на территории РФ. Разработать пространственно-динамическую модель АЭК на территории РФ.
Провести эпизоотологическое обследование парнокопытных жвачных для выявления вируса АЭК в зонах высокого риска возникновения болезни.
Разработать тест-систему на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК.
Определить восприимчивость культур клеток, КРС и белых мышей к заражению вирусом АЭК.
Разработать и апробировать на практике комплекс мер по профилактике и борьбе с АЭК в животноводческих хозяйствах.
Научная новизна работы:
В результате проведенных исследований впервые установлена циркуляция вируса АЭК на территории РФ в стадах коз молочного направления. Изучены клиническое проявление и патологоанатомические изменения у естественно инфицированных АЭК коз.
Определена чувствительность первичных и перевиваемых культур клеток и лабораторных животных (мышей) к вирусу АЭК.
Определены и ранжированы зоны риска возникновения артрита-энцефалита коз на территории РФ. Разработана пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ.
Разработана тест-система на основе метода ПЦР для выявления генома вируса АЭК, определена ее диагностическая чувствительность и специфичность.
Разработан проект «Правил по борьбе с артритом-энцефалитом коз».
Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделу «Разработка набора препаратов для выявления РНК вируса АЭК методом ПЦР» практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Цыбанов С.Ж., Жигалева О.Н., Бурдинский В.Г., а по разделу «Определение чувствительности культур клеток к заражению вирусом АЭК» - Юрков С.Г., Филатов А.В.
Практическая значимость и реализация результатов исследования
Разработанные "Методические рекомендации по выявлению РНК вируса артрита-энцефалита коз методом полимеразной цепной реакции", утверждены РАСХН от 12 декабря 2007 г. и рекомендованы для использования при идентификации указанного возбудителя и его дифференциации от генетически родственных вирусов семейства Ретровирусов.
Полученные в экспериментальных исследованиях данные использовались при разработке мер профилактики и ликвидации артрита-энцефалита коз. Разработанные "Правила по борьбе с артритом-энцефалитом коз" рассмотрены учёным советом ВНИИВВиМ 14 октября
2005 года и представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ
РФ.
Проведение мероприятий согласно предложенным "Ветеринарным правилам" позволило в течение 2-х лет оздоровить от АЭК ранее неблагополучное козоводческое хозяйство Тверской области.
Выделен и идентифицирован на перевиваемой культуре клеток и лабораторных животных вирус АЭК.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (г. Ульяновск,
2006 г.) и представлены на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2005-
2007гг.).
Публикация результатов
Результаты основных этапов диссертационной работы опубликованы в 9 статьях в материалах Международных научно-практических конференций ВНИИВВиМ (г. Покров), УГСХА (г. Ульяновск), Уральского НИВИ (г. Екатеринбург), Бурятского СХИ (г. Улан-Уде); 3 статьи опубликованы в журнале «Ветеринария».
Основные положения, выдвигаемые на защиту
Результаты эпизоотологического анализа мирового нозоареала АЭК.
Пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ.
Тест-система на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК.
Эпизоотологический мониторинг, клинические, патологоанатомические проявления АЭК в неблагополучных хозяйствах, у естественно и экспериментально зараженных животных;
Рекомендации по профилактике и ликвидации артрита-энцефалита коз.
Благодарности
Выполнение настоящей работы, качественный анализ её результатов были бы невозможны без непосредственного участия ряда сотрудников ВНИИВВиМ. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с коллективом лаборатории "Эпизоотологии", а также сотрудниками лабораторий "Биофизики", "Культур клеток с музеем клеточных штаммов": А.Ю. Чичикиным, О.Н. Бурдинской, С.Ж. Цыбановым, О.Н. Жигалевой, С.Г. Юрковым, за что автор выражает глубокую признательность.
Морфология, физико-химическая характеристика и строение генома лентивирусов
По современной классификации международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) возбудитель артрита-энцефали га коз относится к роду Lentivirus семейства Retroviridae [5; 14; 30].
Морфогенез вируса АЭК идентичен морфогенезу вируса ВМО: частицы типа С ретровируса диаметром 100-120 нм почкуются на плазматических мембранах инфицированных клеток. Почкующаяся частица содержит электронноплотную внутреннюю структуру, имеющую форму полумесяца. После созревания частицы отпочковываются в межклеточное пространство; зрелые зкстрацеллюлярные вирионы имеют отчетливый промежуточный слой и элекгронноплотное, центрально расположенное ядро [5; 23; 28; 33].
Вирион сферический (диаметр, примерно, 100 им) оболочечный, с гликопротеиновыми поверхностными выступами (8 нм в длину). Внутреннее ядро включает сферический нуклеокапсид (нуклеоид), расположенный в виде стержня или усеченного конуса у представителей рода лентивирусов.
Протеины составляют около 60 % сухой массы вириона. Два оболочечных протеина: SU (surface - поверхностный) и ТМ (transmembrane - трансмембранный), кодируются вирусным геном env. Внутренние неглпкозилированные 3-6 структурных протеинов кодируются геном gag. Расположение от N-конца: MA (matrix - матрикс); протеин, обнаруженный у некоторых вирусов, с неопределенной функцией; СА (capsid protein -капсидный протеин); NC (nucleocapsid - нуклеокапсид). Протеин МА часто ацилирован с меристиловой частью, ковалентно связанной с аминоконцевым глицином. К другим протеинам относятся: протеаза (PR, кодируемая геном pro), обратная транскриптаза (RT, кодируемая геном ро!) и интеграза ([N, кодируемая геном рої). У некоторых вирусов присутствует Эитраза (DU), роль которого не ясна. Геном представлен двуцепочной РЫК (мономер РНК: односпиральная, линейная с позитивной полярностью, размер 7-11 kb), составляющей 2 % сухого веса вириона. Структура генома лентивирусов представлена на рис. 1. Размер генома 9,3 kb; расположение генов: gag-pro-pol-vif-vprat-rev-vpu-env-nef. Размер длинных концевых повторов (LTR) 600 нуклеотидов, 450 нуклеотидов -регион U3, 100 нуклеотидов - R, 80 нуклеотидов - U5 [16; 44; 80].
Вирионы чувствительны к нагреванию, детергентам и формальдегиду. Поверхностные гликопротеины могут быть частично удалены протеолитическими ферментами. Относительно устойчивы к УФ облучению. Плавучая плотность вируса АЭК составляет 1,16-1,18 г/см3, Sao» 600S (в сахарозе), т.е. идентична плотности вируса ВМО [ 16].
Культивирование вируса АЭК
Кровь от больных АЭК коз в объёме 20 см брали стерильно из ярёмной вены во флакон, содержащий 1-2 см ЭДТА, приготовленного на физиологическом растворе. К объёму взятой крови приливали 500 см стерильной дистиллированной воды, что приводило к лизису эритроцитов вследствие гипотонического шока. Через 10-15 секунд вносили 400 см3 ФБР. Содержимое флакона перемешивали (не допуская образования пены) и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 20 см3 ФБР, центрифугировали при 800 g в течение 5 минут (отмывание физ. раствором повторяется 2 раза). Все операции проводили в стерильных условиях. Осадок клеток после последнего цикла отмывания ресуспендировали в 10 мл среды Игла-MEM с 10 % сыворотки КРС. Подсчитывали количество живых клеток. Для этого суспензию клеток и краску (1 % раствор трипанового синего на физ. растворе) смешивали в лейкоцитарном меланжере и сразу же заряжали в камеру Горяева. Живые клетки краску не воспринимали и выглядели бесцветными, тогда как, мёртвые клетки и их детрит окрашивались в синий цвет.
Сокультивирование ЛПК с клетками культуры ЛЭО При выращивании ЛПК на матрасах, объёмом 50 см3, смешивали 20 см3 суспензии ЛЭО с 5 CMJ суспензии ЛПК (концентрация клеток в 1 мл лейкоцитарной суспензии 1-24 01). При работе на чашках Кар ел я по 2 см3 ЛПК сокультивировали с 8 см" суспензии клеток ЛЭО. Инфицированную культуру клеток инкубировали в стационарных условиях при 37 С в течение 7-Ю дней. После чего проводили сокультивирование заражённой культуры с чистой суспензией. Монослой снимали трипсин-версеновым раствором в соотношении 1:4. Сокультивирование заражённой суспензии ЛЭО с чистой проводили в соотношении 1:1. Выявление накопления генома ВАЭК определяли постановкой ПЦР с использованием специфичных праймеров, комплементарных последовательности gag-гена ВАЭК, полученных из GeneBank.
Монослойную инфицированную вирусом АЭК культуру клеток ЛЭО выращивали на чашках Кареля. Затем культуральную жидкость удаляли и монослой промывали двукратно ФБР. Клетки снимали со стекла механически. Собранные клетки ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора (1/100 от исходного объёма вируссодержащей жидкости), осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клетки трижды замораживали - оттаивали, и клеточный детрит удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость использовали в качестве антигенов. Нормальный антиген готовили аналогично из неинфицированыой культуры клеток ЛЭО.
Для получения мононуклеарных клеток крови использовали несколько методик. В наиболее простой методике используется явление осмотического лизиса эритроцитов крови при низкой ионной силе раствора. При этом белые кровяные клетки практически полностью выдерживают данную процедуру, сохраняя жизнеспособность.
При обработке крови данным методом для лизиса эритроцитов к одному объему крови добавляют 20 объемов дистиллированной воды, а затем вносят равный объем фосфатного солевого буфера (ФСБ) в двукратной концентрации. После центрифугирования в течение 15 мин при 1500-2000 g, осадок растворяют в 0,5 см3 воды и используют в качестве материала для выделения нуклеиновых кислот.
Сравнительно-географический и сравнительно-исторический анализ распространения АЭК в мире
Исходными данными для исследования послужила информация о неблагополучных по АЭК территориях.
Сформирован перечень (кадастр) неблагополучных по АЭК территорий за период с 1984 по 2004 гг., включающий информацию по всем странам, существовавшим в этот период на карте мира. Страны дифференцированы на группы с учетом природно-сельскохозяйственных особенностей, уровня развития овцеводства и козоводства и характера нозопрофиля. Учитывались неблагополучные, а также свободные от АЭК страны. В перечне указаны: виды восприимчивых к болезни животных, частота регистрации и широта распространения болезни, число эпизоотических вспышек и случаев, число заболевших, павших, вынужденно убитых, уничтоженных, исследованных, перечислены противоэпизоотические мероприятия, применявшиеся в стране.
Проведено биогеографическое районирование земного шара с учетом:
- наличия животных, больных АЭК,
- типа географического ландшафта, включающего радиационно климатические показатели, типы почвенного покрова, зональное
распределение видов, являющихся резервуарами АЭК.
Для анализа динамики нозоареала АЭК использованы данные, изложенные в разделе «Обзор литературы».
На основании анализа регистрации АЭК в мире получены данные о том, что наибольшее число вспышек с 1996 по 2004 год зарегистрировано в странах Европы и Северной Америки, далее по убыванию идут Азия, Африка, Австралия и Океания, Южная Америка. Из 161 страны, задействованной в системе отчётности ФАО по АЭК, циркуляция вируса зарегистрирована в 43-х.
В Швейцарии, Франции, США, Австралии и Новой Зеландии разработана программа борьбы с вирусом АЭК, которая обеспечивает существенное снижение числа инфицированных животных [100].
Несмотря на то, что по физико-химическим свойствам возбудитель АЭК является слабоустойчивым к воздействию факторов окружающей среды (УФЛ, температура, рН) его распространение, как и степень проявления, находятся в слабой зависимости от природно-климатических условий. Вирус АЭК циркулирует во всех географических зонах, где используются в сельском хозяйстве или обитают козы и другие потенциально восприимчивые животные.
Динамику напряженности эпизоотического процесса АЭК оценивали по значениям изменения во времени индексов инцидентности болезни. Под инцидентностью понимали число новых случаев или вспышек, имевших место в популяции риска в конкретном географическом регионе (страна) в пределах определенного интервала времени (календарный год) [26].
Анализ динамики нозоареала АЭК неблагополучных стран свидетельствует о выраженной трансгрессии нозоареала. Как свидетельствуют данные представленные на рис. 3, динамика эпизоотической ситуации по АЭК характеризуется ростом напряженности в период с 1996 по 2004 гг. (табл. 3). В результате анализа закономерностей географического распространения болезни в Евразии, Австралии, Америке и Африке выделено 6 зон (А, В, С, D, Е, F), где болезнь имеет различное распространение.
Энзоотичные зоны А, В и С полностью соответствуют экваториальному, субэкваториальному и тропическому климатическим поясам и частично зонам субтропического пояса, прилегающим к тропическому поясу. Здесь вспышки болезни регистрируют наиболее часто.
