Содержание к диссертации
Введение 6
2. Обзор литературы 11
2.1. Определение болезни АЭК 11
2.2. Этиология АЭК. 11
2.3. Морфология и химический состав ВАЭК 11
2.4. Патогенез артрита-энцефалита коз 14
2.5. Методы диагностики 2.5.1. Клинические признаки АЭК 17
2.5.2. Патоморфологические изменения 19
2.5.3. Распространение и пути передачи лентивирусов мелких жвачных 20
2.5.4. Диагностическое значение геномной и антигенной вариабельности лентивирусов мелких жвачных и их филогенетический анализ 21
2.5.5. Пермиссивность клеточных культур и изоляция ВАЭК 23
2.5.6. Серологическая диагностика 26
2.5.7. Электронная микроскопия ВАЭК 29
2.5.8. Экспериментальная инфекция АЭК 29
2.5.9. Полимеразная цепная реакция
2.5.10. Дифференциальная диагностика 31
2.5.11. Профилактика и меры борьбы 32
2.6. Заключение по обзору литературы 34
3.Собственные исследования 36
3.1. Материалы 36
3.1.1. Вирусы и вируссодержащий материал 36
3.1.2. Животные 36
3.1.3. Сыворотки 36
3.14. Полевой материал 37
3.1.5. Антигенные препараты 37
3.1.6. Культуры клеток 37
3.1.7. Питательные среды и сыворотки 38
3.1.8. Реактивы и оборудование, используемые в работе 38
3.2. Методы 40
3.2.1. Получение культуры клеток СМК 40
3.2.2. Культивирование клеток СМК 40
3.2.3. Криоконсервация клеток СМК 41
3.2.4. Определение концентрации и жизнеспособности клеток СМК. 41
3.2.5. Культивирование ВАЭК 42
3.2.6. Культивирование вируса Висны овец (штамм К-796) 42
3.2.7. Изоляция полевого ВАЭК в культурах клеток 43
3.2.8. Определение инфекционной активности ВАЭК и вируса Висны овец.43
3.2.9. Получение сывороток 3.2.10. Получение специфических и контрольных антигенов 44
3.2.11. Постановка реакции диффузионной преципитации 44
3.2.12. Электрофоретический анализ препаратов 45
3.2.13. Экспериментальное воспроизведение инфекции 46
3.2.14. Выделение нуклеиновых кислот 46
3.2.15. Полимеразная цепная реакция 46
3.3. Результаты собственных исследований 47
3.3.1. Оценка ростовых свойств, переживания клеток, способности субкультивирования СМК 47
3.3.2. Определение пермиссивности культур клеток к ВАЭК и выделение вируса из организма животных- вирусоносителей
3.3.3. Сравнительное изучение биологических свойств изолята «Тверской» и штамма 75G-63 ВАЭК в культуре клеток 62
3.3.4. Изучение устойчивости ВАЭК к температурным воздействиям 68
3.3.5. Определение чувствительности перевиваемой культуры клеток ПЯ к вирусу Висны (Исландский штамм К 796) 69
3.3.6. Изучение течения болезни и патологоанатомических изменений АЭК у животных, заразившихся в естественных условиях 69
3.3.7. Определение чувствительности козлят к штамму 75-G63 ВАЭК 73
3.3.8. Выявление фрагментов генома ВАЭК с помощью ПЦР 74
3.3.9. Получение культурального специфического антигена
3.3.10. Реакция диффузионной преципитации в агарозном геле с использованием специфического антигена ВАЭК для выявления антител к данному вирусу в сыворотках крови коз 80
3.3.11. Серологическое обследование поголовья в районах с развитым козоводством
4. Обсуждение 89
5. Выводы 96
6. Практические предложения 97
7. Список литературы 99
8. Приложения
Введение к работе
Актуальность темы.
Артрит-энцефалит коз (АЭК) - медленно протекающая вирусная болезнь, сопровождающаяся развитием энцефаломиелитов (преимущественно у молодняка), хронических пролиферативных синовитов, периартритов, прогрессирующих интерстициальных пневмоний и интралобулярных маститов.
К вирусу восприимчивы домашние козы и овцы [39]. Экономический ущерб при этом складывается в основном из выбраковки из стад клинически больных животных и вирусоносителей, а также недополучении молока.
Единственное эффективное средство борьбы — убой всех животных в неблагополучных и подозреваемых в неблагополучии хозяйствах, поскольку специфические меры профилактики не разработаны. Кроме того, появление этой болезни ведет к ограничениям при экспорте и импорте племенного поголовья.
Во многих зарубежных странах с промышленно развитым козоводством налажен строгий контроль за данными болезнями. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику программы по их искоренению и недопущению распространения. Основными инструментами для осуществления этих программ являются проведение диагностических, карантинных и ветеринарно-санитарных мероприятий [121].
Персистенция ВАЭК сопровождается появлением антител у клинически больных и инфицированных животных [97]. Поэтому особую важность приобретает обнаружение и своевременное устранение из стада серопозитивных животных. Наиболее простым в исполнении и, одновременно, высокочувствительным методом, позволяющим выявлять антитела к вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК), является реакция диффузионной преципитации в агарозном геле. Во многих странах данный метод используется в качестве рутинного метода диагностики, позволяющнго достоверно определить уровень инфицированности поголовья [28; 30].
В последнее время при диагностике АЭК возникло ряд проблем, связанных с генетической и антигенной изменчивостью. Данное обстоятельство предполагает, что географическое распространение различных штаммов может оказывать влияние на результаты диагностических исследований. Таким образом, необходимо постоянно совершенствовать диагностические тесты и при этом брать за основу новые изоляты и штаммы вируса [39].
В настоящее время в РФ возрастает интерес к отрасли козоводства. Это диктуется все более возрастающей потребностью населения в диетических продуктах питания, особенно молоке, а также продуктах его переработки.
В связи с этим происходит регулярное пополнение отечественного поголовья высокопродуктивными животными, импортируемыми из зарубежных стран. На этом фоне моногократно возрастает риск заноса в страну и распространения болезней, присущих данному виду животных, в том числе и медленных инфекций, таких как: лентивирозы мелких жвачных (артрит—энцефалит коз, висна-маеди овец), аденоматоз легких овец.
АЭК для нашей страны является экзотической и неизученной болезнью. Имеются лишь единичные работы по разработке молекулярно-генетических методов диагностики [144]. Данные по исследованию биологических свойств вируса, средствам и методам лабораторной диагностики, а также эпизоотической ситуации в РФ отсутствуют.
В связи с вышеизложенным, существует необходимость в проведении фундаментальных вирусологических исследований по данной проблеме, без которых невозможно выполнение точной диагностики болезни и разработка мер профилактики и борьбы.
Цель и задачи исследований
Цель наших исследований заключалась в определении основных биологических свойств вируса артрита-энцефалита коз.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи: 1. Провести поиск и оценить возможности использования пермиссивных культур клеток для изучения вируса артрита-энцефалита коз in vitro.
2. Выделить отечественный изолят вируса артрита-энцефалита коз и адаптировать его к чувствительной культуре клеток.
3. Изучить основные биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз in vitro и in vivo.
4. Получить специфический антиген вируса артрита-энцефалита коз для использования в реакции диффузионной преципитации (РДП).
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту
1. Биологические свойства и характеристика лабораторной клеточной системы (клеток синовиальной мембраны козлят) для изучения вируса АЭК.
2. Изоляция полевого вируса АЭК (изолят «Тверской») в культуре клеток синовиальной мембраны козленка (СМК) и его биологические свойства.
3. Выявление антител к вирусу АЭК в сыворотках крови клинически больных коз и коз-вирусоносителей с использованием специфического антигена изолята «Тверской» ВАЭК в РДП.
Научная новизна исследований
1. Оптимизированы условия получения и культивирования клеток синовиальной мембраны козленка и показана возможность эффективного использования данной субкультуры клеток в качестве лабораторной модели для изучения ВАЭК.
2. Выделен изолят «Тверской» вируса артрита-энцефалита коз в культуре клеток синовиальной мембраны козленка. 3. Впервые дана сравнительная характеристика биологических свойств полевого изолята «Тверской» и штамма 75G-63 (США) ВАЭК в КК.
4. Показана возможность использования специфического антигена из изолята ВАЭК «Тверской» в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агарозном геле для выявления антител к вирусу АЭК в сыворотках крови коз.
Практическая значимость и реализация результатов исследования
Заключается в разработке «Методических рекомендаций по получению, культивированию клеток синовиальной мембраны козленка и применению данной культуры в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита-энцефалита коз», регламентирующих методы и условия получения, выращивания первичной и субкультуры клеток синовиальной мембраны козленка и использования ее для изоляции из патологического материала, накопления, определения инфекционной активности вируса артрита-энцефалита коз и «Методических рекомендаций по постановке реакции диффузионной преципитации для выявления антител к антигенам вируса артрита-энцефалита коз в сыворотках крови коз при диагностике на артрит—энцефалит коз».
Получен изолят «Тверской» вируса АЭК от козы-вирусоносителя с использованием метода сокультивирования клеточных элементов в культуре клеток синовиальной мембраны козленка.
Методики могут использоваться для производства диагностических препаратов и проведения прижизненной ретроспективной диагностики АЭК.
Так, с использованием метода РДП проведено исследование 385 проб сывороток крови коз и выявлено 59 животных из хозяйств Московской, Владимирской и Тверской областей РФ, в сыворотке крови которых обнаружены антитела к вирусу АЭК, что свидетельствует о циркуляции вируса АЭК на территории РФ. Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновская ГСХА, 2008г.) и на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2006-2008гг.).
Публикация результатов
Основные результаты диссертационной работы изложены в 7 работах, в том числе в журнале «Ветеринария», включенном в перечень ВАК Министерства образования науки РФ - 1 работа.
Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования и анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГІГУ .
Благодарности
Выполнение настоящей работы и качественный анализ её результатов были бы невозможны без непосредственного участия ряда сотрудников ВНИИВВиМ. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с сотрудниками лаборатории «Биофизика» (зав.лаб. С.Ж. Цыбанов; О.Л. Колбасова; О.Н. Жигалева), лаборатории «Эпизоотология» (А.Ю. Чичикин; И.Ю. Волкова). Практическую и консультативную помощь оказывали: Н.С. Неверовская, С.Г. Юрков, А.В. Филатов, СП. Живодеров, Е.Г. Анохина, Б.В. Новиков, И.М. Калабеков, В.М. Бурдинский, а также заведующий кафедрой биологии, вирусологии и генной инженерии Московского государственного университета прикладной биотехнологии д.б.н., профессор А.Ф. Валихов, за что автор выражает глубокую признательность.
