Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Афалина или бутылконосый дельфин (Tursiops truncatus Montagu, 1821) 11
1.2. Краткая характеристика факторов "поогеппой среды обитания" или "условий неволи" 13
1.3. Экологическая иммунология 19
1.4. Адаптация на уровне организма 23
1.5. Организация иммунной системы у китообразных (Cetacea) 27
2. Собственные исследования 38
2.1. Материал и методы исследований 38
2.1.1. Материал исследований 38
2.1.2. Методы исследований 41
2.1.2.1. Определение количественного и видового состава Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей 41
2.1.2.2. Определение гематологических показателей 43
2.1.2.3. Методы исследования иммунного статуса 43
2.1.2.3.1. Определение относительного и абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови 44
2.1.2.3.2. Определение относительного и абсолютного количества Т- и В-популяций лимфоцитов 45
2.1.2.3.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови афалины 45
2.1.2.3.2.2. Разделение лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного антителами к иммуноглобулинам ("пэннинг") 46
2.1.2.3.2.3. Метод иммунологического фепотипировапия с помощью панели моноклональных антител в реакция непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) 47
2.1.2.3.3. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов 49
2.1.2.3.4. Определение относительного содержания сывороточных иммуноглобулинов, классов G и М 52
2.1.2.4. Статистический анализ 58
2.2. Результаты исследований 59
2.2.1. Количественный и видовой состав Грампололсительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи 59
2.2.2. Гематологические показатели у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи 66
2.2.3. Показатели иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи 78
2.2.3.1. Уровень относительного и абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови 78
2.2.3.2. Уровень относительного и абсолютного количества Т- и В- лимфоцитов 81
2.2.3.2.1. Содержание Т-, В- популяций лимфоцитов, которое было определено методом "пэннинг" 81
2.2.3.2.2. Относительный состав популяций лимфоцитов, который был определен в реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) с помощью моноклональных антител 87
2.2.3.3. Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов 92
2.2.3.4. Относительное содержание сывороточных иммуноглобулинов, классов IgG и IgM 98
2.2.4. Мониторинг иммунологических показателей у выборочного количества афалин в процессе адаптации к условиям неволи 103
3. Список литературы 119
4. Приложения 139
- Краткая характеристика факторов "поогеппой среды обитания" или "условий неволи"
- Экологическая иммунология
- Организация иммунной системы у китообразных (Cetacea)
- Результаты исследований
Краткая характеристика факторов "поогеппой среды обитания" или "условий неволи"
Попытки содержать в неволе различных представителей морских млекопитающих предпринимались на протяжении многих лет. Около ста лет назад (1861-1862гг.) в искусственном бассейне Нью-Йоркского отделения музея "Аквариел Гарденс" довольно успешно содержался самец белухи {Delphinapterus leucas), отловленный в заливе Св. Лаврентия. В 1914 г. в Ныо-Йоркском аквариуме содержали афалин {Т. tnmcatus), проживших всего около 15 месяцев и погибших по разным причинам (Вуд Ф.Г., 1979).
Самый первый в мире океанариум, названный "Морской студией", был открыт в 1938 г. в курортном городе Сент-Огастин во Флориде. Наиболее крупный в мире океанариум - Калифорнийский "Мэринелэнд" был сооружен в 1954 г. недалеко от г. Лос-Анжелес (в Палос-Верде), США. В настоящее время в мире существует развитая сеть весьма различных по характеру океанариумов - от чисто исследовательских (например, океанариум ВМС США в Пойнт-Магу) до коммерческих. Кроме того, океанариумы можно рассматривать, как культурно-просветительные и туристские центры, а также базы для подготовки кадров молодых исследователей (Клумов С. К., Соколов В.Е., 1971)
В России, в начале и середине 60-х гг. были созданы три основные научно-экспериментальные морские базы: океанариум ВМФ в Севастополе, биостанция ИНБЮМ на Карадаге и Утришская морская станция ИЭМЭЖ АН СССР (в настоящее время ИПЭЭ РАН) им. А.Н. Северцова, расположенная на черноморском побережье между гг. Анапой и Новороссийском.
Согласно сообщениям ряда исследователей (Клумов С. К., Соколов В.Е., 1971; Яблоков А.В. и др., 1972; Томилин А.Г., 1974; Сыкало А.И., 1982; Биркун А.А. и др., 1986; Колесса О.В. и др., 1986; Романов В.В. и др., 1986; Тюпелеев П.А., Мельников В.В., 1986; Воронков А.С., 1990; Романов В.В., 1991) основными биотическими и абиотическими факторами ноогенной среды обитания, или условий неволи, которые негативно влияют на состояние иммунной системы афалины в неволе, являются следующие: 1. Зоогигиенические параметры содержания особей афалины в неволе, не обеспечивающие животным оптимальных условий жизнедеятельности : а) лимит пространства (гиподинамия, скученность); б) недостаточный водообмен (как следствие этого - накопление в воде экскрементов, остатков пищи, продуктов их распада, т.е. бактериальное и химическое загрязнение воды); в) перепад температуры воды (перегрев, переохлаждение); г) нефизиологичный состав воды (непривычный солевой состав, отличающийся от такового в естественной среде обитания; активное хлорирование воды в совокупности с продуктами распада экскрементов и остатков пищи образуют токсичные хлорорганические соединения и т.п.); д) повышенная микробная обсемененность воздуха, в т.ч. ноогенной микрофлорой, и высокое содержание пылевых частиц в воздушном пространстве в замкнутых помещениях, где содержатся дельфины; в случае открытого морского вольерного типа содержания этот фактор действует в минимальной степени; ж) в морских дельфинариях с открытыми вольерами или водоснабжением из прибрежной зоны действует фактор загрязнения токсическими отходами и патогенами наземных животных и человека в результате сброса в море промышленных и бытовых стоков из близлежащих населенных пунктов и т.д. 2. Биотические факторы условий неволи, к которым относятся бактерии, вирусы, грибы, простейшие и другие патогенные микроорганизмы от наземных млекопитающих от человека. 3. Патофизиологические факторы, связанные с действием острых и хронических стрессов (в процессе отлова и перевозки животных), травм, ушибов, обострения хронических заболеваний не инфекционной этиологии, а также длительная терапия антибиотиками и гормонами. Кроме того, авторами было отмечено, что весь комплекс указанных факторов, негативно действуя на иммунную систему животных, способствует высокой подверженности афалины инфекционным заболеваниям различной этиологии, которые могут привести к гибели животных. В процессе адаптации к условиям жизни в неволе особи афалины инфицируются микрофлорой ноогенного происхождения (от обслуживающего персонала, наземных млекопитающих), с которой в естественной среде обитания им не приходилось сталкиваться. В результате животные подвергаются массированной атаке патогенных факторов, которые дают мощную нагрузку на иммунную систему, истощая ее и вызывая деструктивные изменения в органах лимфатической системы. В литературе существуют сведения о различных заболеваниях китообразных инфекционной и неинфекционной этиологии (Яблоков А.В. и др., 1972; Захарова Т.Н., Дралкин А.В., 1985; Биркун А.А., 1990; Романов В.В., 1991; Medway W., 1980; Smith A.W. et al , 1983; Joseph B.E., Cornell L.H., 1986; Graham M.S., Dow P.R., 1990; Nunoya T. et al, 1990; Smith A.W., Boyt P.M., 1990; Wantzelius E.O.B., 1990; Heide-Jorgensen M.-P. et al, 1992; Eisner Т., Dalton L.M., 1993; Tanaka E. et al, 1994; Domingo M. et al, 1995; Lipscomb T.P. et al, 1994; Wilson B.A. et al, 1999).
Экологическая иммунология
Экологическая иммунология как новое направление в науке возникла сравнительно недавно. Эта научная дисциплина объединяет всю проблематику, связанную с изучением воздействия факторов окружающей среды на состояние иммунной реактивности организма (Шубик В.М., 1976; Хаитов P.M. и др., 1995).
Экологическая иммунология является частью давно сформировавшегося эколого-физиологического направления в экологии. Как отмечает академик И.А. Шилов (2000) в своей монографии "Экология", в начале-середине XX века в аутэкологическом направлении среди работ по изучению образа жизни животных выделилась серия исследований, посвященная физиологическим механизмам адаптации. В России это направление в основном сформировалось в 30-е годы трудами зоолога Н.И. Калабухова и физиолога А.Д. Слонима.
Согласно взглядам P.M. Хаитова с соавторами (1995), экологическая иммунология, является новым направлением клинической иммунологии. Авторы определяют экологическую иммунологию, как науку, изучающую влияние факторов физической, химической и биологической природы на иммунную систему человека.
Одной из основных задач экологической иммунологии является изучение общих закономерностей перестроек иммунологической реактивности организма в период адаптации человека и животных к изменению условий среды обитания, а также при изменении экологической ситуации в пределах ареалов и в экстремальных условиях. Наглядным примером являются космические орбитальные станции (условия невесомости), высокогорные местности (условия пониженного содержания кислорода), атомные электростанции (повышенный радиоактивный фон), а также районы чрезвычайных ситуаций в период природных катаклизмов и т.д. (Шубик В.М., 1976).
Как известно, иммунная система млекопитающих представляет собой физиологический адаптивный механизм, который наиболее быстро и тонко реагирует на любые изменения окружающей среды (Шубик В.М., 1976; Хаитов P.M. и др., 1995). Этот механизм имеется у большинства современных живых организмов и постепенно совершенствуется в процессе эволюции (Ройт А. и др., 2000; Галактионов В.Г., 2005). В связи с этим изучение изменения показателей иммунного статуса у человека и животных в экологическом аспекте является весьма удобным показателем для определения состояния экологической безопасности в любой экосистеме.
В настоящее время наиболее актуальной становится проблема, связанная с изменением экологической обстановки в различных бассейнах Мирового океана, вследствие его загрязнения токсическими веществами антропогенного происхождения (ДДТ, ПХБ, соли тяжелых металлов, радионуклиды и др.), которые представляют большую угрозу для здоровья человека и животных (Одум Ю., 1986; Шилов И.А., 2000; Varanasi U. et al, 1993; Dierauf L.A., Gulland F.M.D., 2001). Неуклонно нарастающее загрязнение Мирового океана токсическими промышленными отходами, бытовыми стоками, нефтепродуктами способствует значительному увеличению концентрации вредных органических и неорганических токсических соединений в водной среде. Это негативно влияет на всю биоту морей и океанов. Известны смертельные случаи среди взрослых особей атлантической афалины в заливе Матагорда в результате интоксикации их органов и систем полихлорид бифенилом, который был найден в подкожной жировой клетчатке у животных (Finklea В. et al, 2000). Существуют данные о высоком содержании изомер-специфичных и токсичных соединений полихлорид бифенила в подкожной жировой ткани у разных видов китообразных в северной части Тихого океана и Азиатских прибрежных водах (Minh Т.В. et al, 2000), а также у ластоногих, например, у сивучей (Eumetopias jubatus) на побережье Аляски и в Беринговом море (Lee J.S. et al, 1996). В результате интоксикации солями тяжелых металлов, органохлоринами и полицикличными ароматическими гидрокарбонами произошла массовая гибель кашалотов (Holsbeek L. et al, 1999).
Как известно, токсичные вещества обладают способностью распространяться по цепям питания и аккумулироваться органами и тканями животных и человека (Руднева И.И., 2000).
О.В. Полякова (2000) оценила уровень содержания полихлорбифенилов и полициклических ароматических углеводородов в образцах снега, донных отложениях, тканях водных растений, фито- и зоопланктона, рыб и нерпы озера Байкал. Согласно данным автора, которые были получены при исследовании процесса накопления органических загрязняющих веществ по цепи питания в экосистеме озера Байкал, процесс накопления токсикантов идет от низших звеньев трофической цепи к высшим.
Теплокровные гидробионты, замыкающие цепи питания в океане, в наибольшей степени аккумулируют тканями своего организма различные токсиканты антропогенного происхождения (Howard Е.В., Britt J.O., 1983; Reddy М. et al, 1998). На примере кольчатой нерпы (Pusa Hispida) было показано, что токсические соединения, содержащиеся в водной среде, способны вызывать необратимые патологические процессы в почках у морских млекопитающих (Solntseva G.N., 1989). Следует отметить, что соли тяжелых металлов и органические хлорсодержащие соединения имеют свойство попадать непосредственно от самки афалины к детенышу через молоко (Storelli М.М., Marcotrigiano G.O., 2000).
Организация иммунной системы у китообразных (Cetacea)
О морфологическом строении и функционировании иммунной системы у морских млекопитающих (в т.ч. китообразных) сведения очень ограничены. Тем не менее, изучение особенностей строения и функционирования иммунной системы этой уникальной группы вторичноводных животных представляет большой научный интерес в плане их эволюции. До определенного времени, в эволюционном отношении эта группа развивалась, как и наземные животные. Около 55-60 млн. лет назад эта уникальная группа животных покинула землю и перешла к жизни в водной среде обитания (Gingerich P.D. et ah, 1983).
Рядом исследователей (Bossart G.D., Dierauf L.A., 1990; Romano Т.A. et ah, 1993; De Guise, 2002) было показано, что общее анатомическое строение органов иммунной системы у китообразных не имеет существенных отличий от анатомического строения органов системы иммунитета у наземных млекопитающих. Так, Arvy L., Pilleri G. (1970) и Arvy L. (1976) дали описание макроскопическому строению селезенки, тимуса, лимфатических узлов и ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани у некоторых видов китообразных. L.A. Dierauf и L.J. Gage (1990) описали мезентеральные лимфатические узлы китообразных. Tracy A. Romano с соавторами (1993) описали мезентеральные лимфатические узлы белухи {Delphinapterus leucas).
Как было отмечено некоторыми авторами (Simpson J.G., Gardner М.В., 1972), при гистологическом исследовании органов иммунной системы разных видов морских и наземных млекопитающих имеются небольшие морфологические различия. Исследование некоторых иммунных органов, включающих селезенку, тимус, лимфатические узлы, фарингальные железы и ассоциированную с кишечником лимфоидную ткань (GALT) показало, что морфологически лимфоидные органы у белухи обнаруживают сходство с аналогичными органами других видов млекопитающих. Отличия заключались в отсутствии фолликулов в белой пульпе селезенки (Romano Т.A. et al, 1993). Кроме того, исследователями (Romano Т.А. et al., 2002) были показаны особенности иннервации органов иммунной системы у белухи, в отличие от наземных видов.
У китообразных, на примере белухи, ультраструктурные характеристики морфологии лейкоцитов периферической крови сходны с таковыми у других видов млекопитающих (Williams III, C.R. et al, 1991). Согласно данным B.B. Романова (1991), полученным при ультраструктурном исследовании нейтрофилов и эозинофилов периферической крови у афалины, индекс Гинека полисегментарности ядер нейтрофильных лейкоцитов у афалины (3,69+0,074; N = 17; п = 32) выше (Р 0,01), чем у человека (3,17+0,06; N = п = 6). Ядра этих лейкоцитов обычно состоят из 2-6 сегментов, которые имеют грубую структуру хроматина и соеденены тонкими (менее 1/3 ядерного сегмента) ядерными мостиками. Чаще всего встречаются ядра нейтрофилов, которые содержат 3-4 сегмента, однако встречаются и формы с содержанием до 5-6 сегментов. У самок афалины в зрелых сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитах, а также в эозинофильных гранулоцитах встречаются особые хроматиновые тельца (тельца Барра). Они имеют форму висячей капли, меньше долек ядра по размеру и соединены с одним из сегментов тонкой перемычкой. Автор предполагает, что образование хроматиновых телец у самок афалины, очевидно, обусловлено различием неактивной Х-хромосомы. Гранулы различаюся по форме, размерам, степени компактности и электронной плотности содержимого. Число сегментов в ядрах эозинофилов обычно колеблется от 2 до 4, однако встречаются и полисегментарные формы. Хроматин ядер имеет грубоглыбчатую структуру. Индекс сегментации - 3,0 + 0,078 (N=13; п=15), что значительно превышает таковой у человека. Эозинофилы различаются по размерам и степени зрелости (Романов В.В., 1991).
Моноциты афалин характеризуются резко выраженным разнообразием размеров клеток, структуры ядер и степени развития цитоплазмы. Форма ядер может быть округлой или овальной, бобовидной или подковообразной, лопастной (вплоть до сегментированной). Это сравнительно малочисленная популяция агранулоцитарных клеток периферической крови афалин, их относительное содержание составляет 3,0 + 0,20% (Мисюра А.Г., Богданова Л.Н., 1997).
Среди лимфоцитов афалины, как и у других видов наземных млекопитающих, выделяются малые, средние и большие формы. В основном, преобладают малые лимфоциты (их около 60%) с округлыми или овальными ядрами. Средняя площадь ядер лимфоцитов афалины составляет 54,57 мкм при коэффициенте вариации 22,1 - 24,4% (Глушен СВ., 1982).
Результаты исследований
Рядом исследователей (Колесса О.В., 1986; Романов В.В., 1991; Сыкало А.И., 1982) было показано, что в 50 % случаев основной причиной гибели афалин при адаптации к условиям неволи являются инфекционные заболевания бактериальной этиологии. Эти наблюдения дают основание предполагать, что одним из основных лимитирующих факторов ноогенной среды обитания, определяющим выживание афалины в условиях неволи, является патогенная бактериальная микрофлора. Как известно, у высокоорганизованных животных антибактериальная защита организма обеспечивается развитием целого комплекса иммунных реакций в ответ на внедрение патогенных микроорганизмов. Таким образом, можно предположить, что "успешный" процесс адаптации к условиям неволи будет возможен для афалин с высоким уровнем иммунного статуса организма.
В 80% случаев бактериальные инфекции у афалин в условиях неволи вызывают Грамположительные кокки (стафилококки и стрептококки)( Колесса О.В., 1986; Varaldo Р.Е. et ah, 1988). Поэтому в данной работе мы сочли необходимым исследовать количественное и видовое соотношение верхних дыхательных путей именно этих микроорганизмов.
Результаты микробиологических исследований представлены в таблицах 2 и 3, а также в виде графика (Рис. 7) и диаграммы (Рис. 8). под наименованием "другие" подразумеваются микроорганизмы, выделенные из верхних дыхательных путей у афалин и принадлежащие к следующим семействам, родам и видам: Escherichia coli, Providencia, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Hafnia alvei,Yersinia kristensenii, Citrobacter braaki, Salmonella choleraesuis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Campylobacter и дрожжеподобные грибы Candida albicans.
Для наглядности динамики количественного состава Гр "+" кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей у афалин на разных сроках адаптации к условиям жизни в неволе эти данные также показаны на рисунке 7.
При бактериологическом исследовании материала из верхних дыхательных путей афалин был выделен довольно широкий спектр микроорганизмов, принадлежащих к разным семействам, родам и видам. Отмечали, что видовой и количественный состав микробных ассоциаций верхних дыхательных путей у афалин различался на разных сроках адаптации к условиям неволи (Табл. 2, 3; Рис. 7).
Грамположительные (Гр"+") кокки были выделены из верхних дыхательных путей всех обследованных животных. Выделенная Гр"+" кокковая микрофлора была представлена следующими видами: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes. В результате проведенных исследований было установлено, что на разных сроках адаптации в опытных группах № 2, 3, 4, 5, 6 состав микрофлоры в биологическом материале от адаптирующихся афалин статистически значимо отличался по количественным характеристикам как по сравнению с контрольной группой №8, так и по сравнению с группой №1 (период отлова). Так было отмечено, что у афалин данные показатели на сроках адаптации: от 2-х до 3-х недель (группа 2), от 5-ти до 7-ми недель (группа 3), от 8-ми до 9-ти недель (группа 4), от 10-ти до 12-ти недель (группа 5), от 13-ти до 14-ти недель (группа 6) были статистически значимо выше (при р 0,05) как по сравнению с контрольной группой адаптированных, клинически здоровых животных (группа 8), так и по сравнению с особями, которые были обследованы в период отлова (группа 1). При сравнении параметров количественного состава Гр"+" кокковой микрофлоры у афалин, полученных в период отлова (группа №1) по сравнению с контрольной группой №8 статистически значимых отличий выявлено не было (Табл. 2, Рис.7).
Кроме того, отмечали отличия по качественным характеристикам состава Гр"+" кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей в биологическом материале от адаптирующихся афалин. Изменение состава Гр"+" кокковых микробных ассоциаций верхних дыхательных путей наблюдалось в зависимости от времени пребывания афалин в условиях неволи (Табл. 3, Рис. 8).
Похожие диссертации на Иммунный статус черноморской афалины (Tursiops Truncatus Ponticus Barabash, 1940) в период адаптации к условиям жизни в неволе
