Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема стресса, давно привлекавшая внимание биологов, становится особенно значимой в настоящее время в связи с непрерывно ухудшающейся экологической ситуацией в мире. Эффективным способом защиты организмов от стрессорных воздействий является нейроэндокринная стресс-реакция. Сходство в нейрохимических и физиологических изменениях у беспозвоночных и позвоночных в ответ на стрессорное воздействие свидетельствует о том, что реакция на стресс - это совокупность древних, сохраненных в эволюции механизмов (Rauschenbach et al., 1987; Jancovic-Hladni, 1991; Cymborovski, 1991; Neckameyer, Weinstein, 2005).
Известно, что ряд гормонов, задействованных в стресс-реакции насекомых, также контролирует приспособленность, важнейшими компонентами которой являются способность оставить потомство и способность адаптироваться к стрессирующим условиям (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991; Cymborovski, 1991; Rauschenbach, 1991; Раушенбах, 1997). Изучение закономерностей взаимодействия этих гормонов в контроле репродуктивной функции и жизнеспособности насекомых в стрессирующих условиях является одной из актуальных задач современной билогии, поскольку выяснение этих закономерностей имеет не только фундаментальное значение, но также может быть использовано при разработке новых мер защиты от насекомых-вредителей и способов успешного разведения полезных насекомых. Такого рода исследования требуют возможности фармакологического изменения уровня гормонов и проведения генетических экспериментов, для чего максимально удобной моделью является дрозофила, как наиболее изученный объект с генетической точки зрения, и дающий возможность быстрого получения больших выборок экспериментальных насекомых.
Установлено, что у имаго Drosophila стресс-связанными гормонами являются дофамин (ДА), октопамин (ОА), ювенильный гормон (ЮГ) и экдистероиды. Так, через 15 мин после начала стрессирования (38С) содержание ДА резко возрастает за счет его выброса из депо, что сопровождается падением активности первого фермента синтеза ДА, тирозингидроксилазы (ТГ) (Rauschenbach et al., 1993, 1995b). Такая же картина наблюдается в системе метаболизма ОА (Sukhanova et al., 1997; Hirashima et al., 2000b). Система метаболизма ЮГ после 180 мин стрессирования отвечает падением деградации
гормона (возможным повышением его титра) (Rauschenbach et al, 1995а). После 60 мин стрессирования (а возможно и ранее) возрастает уровень 20-гидроксиэкдизона (20Э) (Раушенбах и др., 2000а).
Изучение генетического контроля этих компонентов стресс-реакции у D. virilis привело к заключению о существовании единого пускового звена для всех звеньев стресс-реакции (Раушенбах и др., 20006). Однако, является ли таким пусковым звеном один из стресс-связанных гормонов, оставалось под вопросом.
Гонадотропная роль ЮГ и 20Э у насекомых давно не подвергается сомнению (обз.: Simonet et al., 2004), однако до сих пор не выработано единой точки зрения на вклад каждого из гормонов в контроль оогенеза. Известно, что ЮГ регулирует метаболизм 20Э у самок насекомых (обзоры: Bownes, 1989; Raikhel et al 2004). Показано также влияние 20Э на синтез ЮГ in vitro (Watson et al., 1986; Granger et al., 1987). Однако влияет ли 20Э на метаболизм ЮГ in vivo и каков механизм взаимодействия этих гормонов в контроле размножения насекомых в нормальных и стрессирующих условиях не было исследовано.
В экспериментах in vitro показано, что экзогенные биогенные амины (ОА и ДА) влияют на метаболизм гонадотропинов (ЮГ и 20Э) (Thompson et al., 1990; Woodring, Hoffmann, 1994; Granger et al., 1996; Hirashima et al., 1999a), но существует ли такое взаимодействие in vivo и как оно влияет на репродуктивную функцию в нормальных и стрессирующих условиях не установлено.
Поскольку биогенные амины, ОА и ДА, контролируют энергетический метаболизм насекомых, предполагали, что они должны играть роль в адаптации индивидуумов к неблагопрятным условиям (обз.: Раушенбах, Шумная, 1993). Однако данные, подтверждающие это предположение, отсутствовали.
Установлено, что стресс-реакция личинок насекомых носит адаптивный характер, помогая им осуществить метаморфоз в стрессирующих условиях (Rauschenbach et al, 1987). Логично предположить, что стресс-реакция, имаго дрозофилы, включающая в себя изменения в метаболизме биогенных аминов и гонадотропинов (Rauschenbach et al, 1993, 1995а; Hirashima et al., 2000a,b), также способствует адаптации. Это предположение нуждается в проверке.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является выяснение механизмов взаимодействия стресс-связанных гормонов имаго дрозофилы
(гонадотропинов - 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона, и биогенных аминов - октопамина и дофамина) в контроле приспособленности (жизнеспособности в стрессирующих условиях среды и плодовитости).
Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Исследовать взаимодействие стресс-связанных гормонов дрозофилы в нормальных и стрессирующих условиях среды.
-
Выяснить, является ли один из стресс-связанных гормонов дрозофилы пусковым звеном для всех остальных.
-
Охарактеризовать течение оогенеза и гормональный статус самок дрозофилы при стрессовых воздействиях различной этимологии и при мутационном или фармакологическом изменении уровня стресс-связанных гормонов.
-
Проанализировать влияние стрессовых воздействий и измененных (в результате мутации или фармакологически) уровней каждого из стресс-связанных гормонов на плодовитость D. virilis и D. melanogaster.
-
Установить влияет ли взаиморегуляция стресс-связанных гормонов на приспособленность дрозофилы.
-
Выяснить роль стресс-связанных гормонов в обеспечении адаптации дрозофилы на индивидуальном и популяционном уровннях.
Научная новизна. В работе впервые показано, что биогенные амины регулируют in vivo метаболизм ЮГ у самок дрозофилы: (1) мутации, изменяющие содержание ОА и ДА у D. melanogaster, вызывают изменения в уровне деградации ЮГ у самок, но не у самцов; (2) экспериментальное изменение уровня ДА и ОА также вызывает у самок, но не у самцов D. virilis и D. melanogaster изменения в уровне деградации ЮГ. Причем ДА ингибирует деградацию гормона у молодых самок и стимулирует ее у половозрелых; ОА ингибирует деградацию ЮГ у тех и других.
Впервые обнаружено, что в регуляции титра ЮГ дофамином существует обратная связь: (1) экспериментальное повышение титра ЮГ вызывает резкое снижение уровня ДА у молодых самок дрозофилы (D. virilis и D. melanogaster) и его повышение у половозрелых; (2) снижение титра ЮГ в результате мутации повышает уровень ДА у молодых самок D. melanogaster.
Впервые in vivo продемонстрировано, что биогенные амины регулируют титр
20Э у самок дрозофилы: мутация, лишающая D. melanogaster ОА (Tfih ), резко снижает уровень 20Э, а экспериментальное повышение содержания ОА повышает уровень гормона у молодых самок D. virilis; повышение содержания ДА также вызывает возрастание уровня 20Э у молодых самок D. virilis.
Впервые установлено, что 20Э регулирует in vivo метаболизм ЮГ и осуществляет это опосредованно через систему метаболизма ДА: (1) экспериментальное повышение титра 20Э увеличивает уровень ДА у молодых самок D. virilis и D. melanogaster и снижает его у половозрелых, вызывая тем самым сниженние деградации ЮГ у тех и других; (2) резкое падение титра 20Э, вызываемое у D. melanogaster мутацией ecdysonless1 при рестриктивной температуре, напротив, снижает уровень ДА у молодых самок и повышает у половозрелых, приводя к резкому повышению деградации ЮГ у тех и других.
Впервые получены данные, свидетельствующие, что синтез и деградацция ЮГ у дрозофилы находятся в противофазе и под общим контролем: (1) мутация apterous5^ D. melanogaster, вызывающая драматическое снижение синтеза ЮГ резко повышает деградацию гормона; (2) экспериментальное повышение титра ЮГ у самок D. virilis вызывает резкое снижение его деградации.
Впервые выяснено, что ни один из стресс-связанных гормонов дрозофилы не является пусковым звеном в развитии стресс-реакции.
Впервые установлено, что тепловой стресс и голодание вызывают у самок D. virilis однотипные изменения в процессе оогенеза: задержку созревания вителлогенических ооцитов и деградацию части из них вследствие повышения титра 20Э, и накопление зрелых ооцитов, вызываемое повышением уровня ЮГ.
Впервые показано, что экспериментальное повышение титра ЮГ у самок D. virilis вызывает остановку откладки яиц, но не снижает их плодовитость, тогда как экспериментальное повышение титра 20Э не приводит к остановке откладки яиц, но вызывает длительное снижение плодовитости.
Впервые обнаружено, что отклонения (повышение/снижение) в уровне биогенных аминов вызывают резко негативные изменения в репродуктивной функции самок, но не самцов, дрозофилы в нормальных условиях. Вместе с тем мутации, изменяющие содержание аминов, обеспечивают мутантным самкам преимущество в стрессирующих условиях, ускоряя выход репродуктивной системы из состояния стресса.
Впервые продемонстрировано, что нарушение баланса гонадотропинов, ЮГ и 20Э, приводит к снижению термоустойчивости самок и самцов дрозофилы.
Впервые получены свидетельства того, что мутации, вызывающие повышение базального уровня ДА, снижают жизнеспособность дрозофилы при тепловом стрессировании, однако повышают ее при голодании.
Впервые установлено, что длительная селекция D. melanogaster по половой активности самцов в плюс и минус направлениях приводит к изменениям в системах метаболизма ЮГ и ОА у самок, а мутации, нарушающие ответ системы ЮГ на стрессор, приводя к снижению плодовитости в нормальных условиях, дают преимущество в оставлении потомства в стрессирующих условиях.
Впервые показано, что в природных популяциях D. melanogaster с высокой частотой встречаются мутантные самки с нарушенным ответом системы метаболизма ЮГ на действие стрессора.
Положения, выносимые на защиту.
-
У самок дрозофилы существует механизм взаиморегуляции стресс-связанных гормонов - биогенных аминов (ДА и О А) и гонадотропинов (ЮГ и 20Э). Наличие такого механизма позволяет сохранять баланс гонадотропинов в условиях, вызывающих изменения в уровне одного из них, и способствует адаптации на индивидуальном и популяционном уровнях.
-
Механизм ответа репродуктивной системы самок дрозофилы на различные стрессорные факторы универсален. Стрессирующие воздействия различной этимологии вызывают: замедление созревания вителлогенических ооцитов, деградацию части из них, накопление зрелых ооцитов, ингибирование экспрессии yolk protein генов, прекращение откладки яиц и снижение плодовитости в течение некоторого времени после ее возобновления. Для нормального течения оогенеза необходимо сохранение баланса гонадотропинов, ЮГ и 20Э.
-
Роль ЮГ и 20Э в регуляции оогенеза дрозофилы различна: завершающие стадии созревания ооцитов и процесс откладки яиц в норме и при стрессе регулируются ЮГ, а 20Э ответственен за развитие ооцитов на ранних вителлогенических стадиях и их деградацию при стрессе. Биогенные амины (ДА и ОА) регулируют процесс оогенеза и плодовитость самок, но не самцов, дрозофилы, изменяя, как нейрогормоны, титр гонадотропинов.
4. Взаиморегуляция стресс-связанных гормонов дрозофилы в условиях стресса генетически детерминирована: мутация в системе метаболизма одного из этих гормонов (ДА, ОА, ЮГ и 20Э) изменяет стресс-реактивность всех остальных, хотя ни один из них не является пусковым звеном стресс-реакции.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные развивают представления о механизмах взаимодействия стресс-связанных гормонов насекомых в контроле приспособленности и позволяют сделать выводы об адаптивности как самой стресс-реакции, так и полиморфизма по ней для популяций насекомых, что может быть использовано при разработке новых мер защиты от насекомых-вредителей и способов успешного разведения полезных насекомых.
Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены на 1, 2 и 3 съездах ВОГИС (Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 2000; Москва 2004), на международных конференциях «Агробиология и биотехнология растений и животных» (Киев, 1997), «Современные концепции эволюционной генетики» (Новосибирск, 1997), «Адаптация организма к природным и экосоциальным условиям среды» (Бишкек, 1998), «Генетическая и онтогенетическая психонейро-эндокринология» (Новосибирск, 1999), «Молекулярно-генетические маркеры животных» (Киев, 1999), «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии (Новосибирск, 2000), «Генетика и Селекция в Украине на Стыке тысячилетий» (Киев, 2001), «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2002) и «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на VII, VIII и IX Международных конференциях по ювенильным гормонам (Иерусалим, 1999; Кингз Бич, 2004; Йорк, 2007), на XXX Всероссийском совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), на VI Восточноевропейской конференции межународного общества нейробиологии беспозвоночных (Москва-Пущино, 2000), VI Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на XVII, XVIII Европейских конференциях по исследованиям на Drosophila (Эдинбург, 2001; Геттинген, 2003), на XV и XVI Международных симпозиумах по экдизону (Крит, 2002; Гент 2006), на III Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии»
(Алматы, 2003), на XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006) и на 2 Международном конгрессе по исследованию стресса (Будапешт, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 научных работы, из них статей - 41, в том числе в зарубежной печати - 15.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (733 источника). Работа изложена на 361 странице машинописного текста, включая 105 рисунков и схем и 13 таблиц.
