Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота и факторы, влияющие на инфицированность животных 9
1.2. Картина крови при лейкозе и пестицидных токсикозах 16
1.3. Иммунологические показатели и естественная резистентность .19
1.4. Патоморфологические изменения при лейкозе и интоксикации пестицидами 25
1.5. Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота и отравлений животных 30
1.6. Заключение по обзору литературы 38
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
2.1. Материал и методы исследований 40
2.2. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота и экологический фон в Омской области 42
2.3. Инфицирование животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в условиях эксперимента 51
2.4. Экспериментальная интоксикация лабораторных животных синтетическим пиретроидом циткором 54
2.5. Сравнительная оценка информативности методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота и хронической интоксикации пестицидами 59
2.5.1. Гематологические изменения 59
2.5.2. Иммунологические показатели и естественная резистентность 68
2.5.3. Спектрофотометрическое исследование проб крови 70
2.5.4. Патоморфологические изменения в органах и тканях 72
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 85
4. ВЫВОДЫ 95
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 96
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97
- Лейкоз крупного рогатого скота и факторы, влияющие на инфицированность животных
- Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота и экологический фон в Омской области
- Гематологические изменения
Введение к работе
Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота занимает одно из важных мест в общей структуре инфекционной патологии сельскохозяйственных животных. Вирусная этиология заболевания является общепризнанной.
Выделение антигенных компонентов вириона позволило разработать серологические и вирусологические методы диагностики лейкоза. С помощью этих методов были подробно изучены особенности инфекционного и эпизоотического процессов, разработаны эффективные методы контроля инфекции и оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств (М.И.Гулюкин, Л.А.Иванова, Н.В.Замараева и др., 2002).
С признанием вирусной природы заболевания и накоплением новых научных данных о путях передачи ВЛКРС и патогенезе лейкоза стало возможным дать практике научно обоснованные рекомендации по борьбе с этой болезнью. С учетом местных условий реализуются территориальные программы ликвидации лейкоза (В.А. Апалькин, 1993; В.В. Храмцов, 1995; В.В. Разумовская, 1995; В.И.Околелов, Ю.С.Притужалов, 1995; А.П. Кузнецов, 1996; Г.А. Симонян, 1996; Ф.Ф. Хисамутдинов, 1996; А.Т. Татарчук, И.М. Донник, В.А. Красноперов, 1997; В.Н. Нахмансон, 1996; Ю.П.Смирнов, 1998; Т.В. Щекотурова, 1999; Н.И. Петров, 1999;; СМ. Пау, 2000; ПН Смирнов, 2000; RSagata, Т. Yasunaga, Y. Otawa, 1974; DP. Lunn, 1993).
В настоящее время проблема лейкозов сельскохозяйственных животных включена в планы научно-исследовательских работ многих научных учреждений страны. Выполнены фундаментальные исследования по изучению особенностей и закономерностей эпизоотического и инфекционного процессов энзоотического лейкоза крупного рогатого скота. Одним из приоритетных направлений этих исследований является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики лейкоза (Л.А. Иванова, 1996; В.Н. Нахмансон, 1997; В.А. Бусол, 1997; Р.В. Облап и др.,
1998; Л.Б. Прохватилова и др., 2000; О.А. Верховский и др., 2002; М.И. Гулюкин, В.А.Храмцов, А.С. Донченко и др., 2002; В.И. Околелов и др., 2003; G. Gareis, W. Witmann, S. Fischer, 1983; D.J. Deboer, 1994).
В настоящее время не вызывает сомнений, что распространение лейкоза крупного рогатого скота зависит от характера и степени неблагополучия экологической ситуации на определенных территориях (И.М.Донник, 2000; М.И.Гулюкин и др., 2002) Особую настороженность и беспокойство вызывают болезни животных, обусловленные экологической нагрузкой, в том числе лейкоз крупного рогатого скота (Л.К. Эрнст, 1999).
Кроме того, исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено влияние различных поллютантов на иммунную систему, регулирующую инфекционный процесс в организме человека и животных (В.А. Апалькин, 1993; А.С. Кашин, 2000; J.F. Bach, 1973).
В связи с массовым распространением саранчовых вредителей и увеличением объемов использования пестицидов в Омской области и ряде других регионов страны назрела необходимость комплексного изучения проблемы лейкоза, ассоциированного с хронической интоксикацией пестицидами.
Целенаправленных исследований по изучению взаимосвязи данного фактора с уровнем заболеваемости крупного рогатого скота лейкозом и другими хроническими инфекционными болезнями на конкретно взятых территориях до настоящего времени не проводилось.
В связи с этим изучение особенностей проявления эпизоотического процесса и диагностики лейкоза крупного рогатого скота на фоне интенсивного использования пестицидов является актуальной проблемой.
Целью настоящих исследований явилась разработка дифференцированного комплексного подхода к диагностике лейкоза крупного рогатого скота с учетом значимости токсикологической ситуации.
6 Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Определить эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого
скота в Омской области.
Установить уровень накопления пестицидов в объектах окружающей
среды и организме животных.
На экспериментальных моделях инфицирования и интоксикации
изучить характер гематологических изменений, вызываемых инфекционным
и токсическим агентами.
Провести сравнительную оценку информативности методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота и хронической интоксикации пестицидами.
Разработать рекомендации по дифференциальной диагностике лейкоза и хронической интоксикации пестицидами крупного рогатого скота.
Научная новизна. Экспериментально обоснованы гематологические и патоморфологические изменения при лейкозе крупного рогатого скота и хронической интоксикации пестицидами в сравнительном аспекте.
Выявлена неспецифичность реакций системы иммунитета при лейкозе, характеризующихся повышенной активностью фагоцитарных клеток и накоплением циркулирующих иммунокомплексов при снижении уровня JgG и повышенном ответе лимфоцитов на ФГА - стимул.
Доказана необходимость включения гистохимических исследований клеток крови в комплекс диагностических исследований при лейкозе крупного рогатого скота с целью дифференциации бластных клеток миелоидного и лимфоидного ряда.
Практическая ценность. Выявлены объективные трудности
дифференциальной диагностики лейкемоидных реакций при интоксикации и
лейкоза вирусной этиологии. Доказана необходимость совершенствования
используемых методов диагностики. Изданы рекомендации
«Дифференциальная диагностика лейкоза крупного рогатого скота и хронической интоксикации пестицидами» (Омск, 2004).
Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе по курсам эпизоотологии и ветеринарной токсикологии. На защиту выносятся следующие положения:
При накоплении остатков пестицидов в объектах окружающей среды и организме животных возрастает степень риска неблагополучия эпизоотической ситуации.
Хроническая интоксикация пестицидами и лейкоз сопровождаются однотипными изменениями лейкограммы, появлением в периферической крови бластных клеток, сосудистыми расстройствами, дистрофическими и септическими процессами, лимфоидной инфильтрацией лимфоузлов и паренхиматозных органов. Степень выраженности указанных изменений определяется интенсивностью и длительностью воздействия этиологического фактора.
Диагностика лейкоза крупного рогатого скота является обоснованной при исключении неспецифической реакции иммунного ответа на антигенную стимуляцию и гистохимической идентификации клеток крови.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на VI научно-практической конференции «Перспективные направления научных исследований молодых ученых и специалистов Урала и Сибири» (Троицк, 2002); научно-практической конференции, посвященной 85-летию ИВМ ОмГАУ (Омск, 2003); II международной межвузовской научно-практической конференции аспирантов и соискателей «Предпосылки и эксперимент в науке» (Санкт-Петербург, 2004); Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (Омск, 2004).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 229 источников, из них 47 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками.
Лейкоз крупного рогатого скота и факторы, влияющие на инфицированность животных
Согласно современной классификации, вирус лейкоза крупного рогатого скота относится к семейству Retroviridae, подсемейству Onkoviridae. Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота - это онкогенный РНК-содержащий вирус, он обладает тропизмом к лимфоидным клеткам и размножается в них. Основным биохимическим признаком для всех представителей семейства Retroviridae является наличие в вирионе обратной транскриптазы. В состав подсемейства Onkoviridae входит три рода: вирусы С, В и Д (М.И. Гулюкин и др., 2002).
Первый случай лейкемии у животных описан патологоанатомом Дрезденского ветеринарного института Leisering в 1858 году.
О. Siedamgrotzki в 1871 г. сделал сообщение о лейкозе у свиней и собак, а в 1878 г. он же впервые описал лейкоз у крупного рогатого скота. И. Добберштейн в 1958 г. отметил, что лейкозом болеют 29 видов животных и 15 видов домашних и диких птиц. В процессе изучения эту болезнь называли - белокровием, лейкемией, раком крови, лейкозом, гемобластозом.
В. Эллерман в 1921 г. предложил заменить название заболевания "лейкемия" термином "лейкоз", который более полно характеризовал патологический процесс, развивающийся в кроветворной ткани, независимо от изменений, наблюдаемых в периферической крови.
В 1953 г. Х.Х. Владос, Н.А. Краевский и другие исследователи предложили новое название болезни "гемобластозы", так как при лейкозе наблюдали гиперплазию клеток кроветворной и лимфоидной тканей с развитием злокачественных опухолей.
Веские доказательства в пользу вирусной этиологии лейкоза были получены в 1969 г. Дженисом Миллером с сотрудниками, которые обнаружили в культурах лимфоцитов периферической крови больных лейкозом коров большое количество зрелых вирусных частиц типа С и описали его морфологию. Поддержали мнение о вирусной этиологии данной болезни В.П. Шишков, (1975); Р.А. Кукайн и др.(1982); L.D. Miller, С. Olson, (1972) и др.
В 2000г. Международный комитет по таксономии вирусов представил современную классификацию и номенклатуру вирусов позвоночных, согласно которой вирус лейкоза крупного рогатого скота относится к РНК-содержащим вирусам семейства Retroviridae, которое объединяет 7 родов.
Значительный вклад в изучение этиологии лейкоза крупного рогатого скота внесли Р.А. Кукайн, Л.И. Нагаев, СВ. Чапенко (1973); В.М. Жданов, М.И. Парфанович (1974); В.М. Жданов, М.И. Парфанович, Э.М. Ныым (1978); Р.А. Кукайн, Л.И. Нагаев, СВ. Чапенко (1979) ; R. Rademacher., A.Tesar, J. Hafman (1971); M. Mammerickx (1972) ; D. A. Abt, R.R. Marshak, J. F. Ferrer etal. (1978).
Вирусы типа С, выделенные от млекопитающих, составляют две самостоятельные группы: вирусы мышей, крыс, хомяков, кошек, норок, свиней, обезьян и вирус лейкоза крупного рогатого скота (М.К. Тамаускас, 1971; В. М. Жданов, М. И. Парфанович, 1974; Л. А. Зильбер, И. С Ирлин, Ф.Л. Киселев, 1975; Л.Г. Бурба, 1979; R.J. Huebner, GJ. Todaro, 1969; L.D. Miller, J.M. Miller, С Olson, 1972; H.E. Hoss, С Olson, 1974), овец (B.K. Пракин, Л.Ф. Силкин, H.H. Котляров, 1981; H.E. Hoss, С. Olson, 1974; J.M. Diashop, 1982) и коз (С.А. Мурватулоев, 1998; M. Mammerickx, D. Portetelle, A. Burny, 1981).
Устойчивость вируса во внешней среде невысокая. Нагревание до 74С убивает его через 20 секунд. В клеточных культурах при нагревании до 60С вирус погибает через минуту. При низкой температуре и глубоком замораживании жизнеспособность вируса сохраняется. Он чувствителен к дезосредствам, быстро обезвреживается 2-3% растворами едкого натра, формальдегида и другими дезинфицирующими веществами в общепринятых концентрациях (В.М. Жданов, М.И. Парфанович, Э.М. Ныым, 1978; В.М. Нахмансон, 1986).
После проникновения вируса в здоровый организм, он внедряется в субпопуляцию В-лимфоцитов. Геном возбудителя интегрируется с геном лимфоцита, вирус не является патогенным для клетки. Происходит репродукция вируса и выделение вирионов из клетки путем почкования от клеточной мембраны и отделением от лимфоидной клетки в межклеточное пространство. Лимфоидные клетки могут передавать геном вируса дочерним клеткам во время деления лимфоцита. Передача вируса из клетки в клетку может происходить и без продуцирования вирионов. Через 3-8 недель после заражения животных в сыворотке крови появляются антитела против ВЛКРС (В.М. Жданов, М.И. Парфанович 1974; Л.Г. Бурба 1979; А.Ф. Валихов, 1977; А.П. Мазуренко, 1981; В.П. Шишков 1985; R. Doolittle, М. Hunkapilir, L. Heod et al., 1983; L.D. Miller, J. M. Miller, C. Olson, 1972).
Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота и экологический фон в Омской области
За последние годы (1999-2003 гг.) показатель заболеваемости несколько снизился и составил в среднем по области 2,5 %. Это мы связываем с тем, что в последние 5 лет значительно расширены объемы диагностических исследований скота на лейкоз, в том числе и в экологически неблагополучных хозяйствах. Именно в них обнаружены наиболее высокие показатели инфицированности и заболеваемости. Примером могут служить СПК «Лесное» Исилькульского района, ЗАО «Ермак» Нововаршавского района и СПК «Цветочное» Русско-Полянского района. Показатели по вирусоносительству и заболеваемости в этих сельхозпредприятиях составили в среднем 22,25% и 3,65% соответственно, хотя районы, где расположены эти хозяйства, одними из первых начали заниматься оздоровлением стад от лейкоза. По данным гематологических исследований, в крови у больных лейкозом коров было увеличено количество лейкоцитов, выявлено достоверное снижение количества эритроцитов. При анализе лейкограмм отмечено, что около 90% клеток составляют лимфоциты, выражена моноцитопения; превалируют малые лимфоциты, чаще всего они представлены в виде узкоплазменных форм, имеются почти голые ядра. При просмотре мазков крови отмечено наличие атипичных лимфоцитов (более 4%): клетки Ридера, двуядерные клетки, лимфоциты с инвагинированным ядром, лизированные лимфоциты, тени Гумпрехта, большие лимфоциты с гранулами з цитоплазме. Недифференцированные бластные клетки составляли более 3-5%.
В периферической крови условно здоровых животных количество лимфоцитов составляло 50-67%, из них малых лимфоцитов - 32-35%, средних - 10-14%, больших - 8-10%.
Структура ядер лимфоцитов характеризуется компактностью и плотностью хроматина. Глыбки хроматина окрашены в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма лимфоцитов окружает ядро узкой или широкой полоской, окрашена в светло-голубой цвет. Также отмечено наличие атипичных лимфоцитов (0,5-1,5%). Часть лимфоцитов содержит в цитоплазме азурофильную зернистость. Эритроциты - круглые розово-желтые клетки, патологические формы не обнаружены.
Наибольшее количество утилизированных туш по причине лейкозных изменений приходилось на 1999 год (рис. 3).
Проведенными исследованиями в хозяйствах области была подтверждена сложная эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота. Это мы связываем с тем, что распространение лейкоза крупного рогатого скота в определенной мере зависит от степени и характера неблагополучия экологической ситуации на определенных территориях.
Гематологические изменения
Для проведения исследований нами была взята кровь от коров черно-пестрой породы, 4-5-летнего возраста, принадлежащих хозяйствам Омской области. Было исследовано по 30 проб крови от гематологически больных, гематологически подозреваемых и условно здоровых животных (табл. 1).
По данным лейкограмм, у условно здоровых животных количество лимфоцитов минимально, причем преобладают малые лимфоциты.
Структура их ядер характеризуется компактностью и плотностью хроматина, глыбки которого окрашены в темно-фиолетовый цвет. Цитоплазма лимфоцитов окружает ядро узкой полоской, окрашенной в светло-голубой цвет (рис.12). Атипичные лимфоциты составляют не более 0,5-1,5%. Патологические формы эритроцитов не обнаружены.
В крови больных лейкозом коров увеличено количество лейкоцитов, выявлено достоверное снижение количества эритроцитов. При микроскопировании мазков крови выявлены гипохромные эритроциты, анизоцитоз. Окраска мазков по методу Грэхема-Кнолля подтверждают преобладание клеток лимфоидного ряда..
По данным лейкограмм, у гематологически больных животных до 90% клеток составляют лимфоциты, резко уменьшено содержание гранулоцитов и моноцитов.
Превалируют малые лимфоциты, чаще всего они представлены в виде узкоплазменных форм, встречаются почти голые ядра.
Среди атипичных лимфоцитов встречаются клетки Ридера (лимфоциты с резко бухтообразно втянутыми ядрами или с более сложным неправильным полиморфизмом ядер, рис. 13); двуядерные клетки (морфологически зрелые лимфоциты с наличием в цитоплазме двух ядер, ядра иногда соединены между собой тонкой перемычкой, рис. 14,15); лизированные лимфоциты (клетки с нарушением морфологической структуры и целостности цитоплазмы без нарушения ядерной структуры, рис. 16); «тени» Боткина-Гумпрехта (остатки полураз-рушенных лимфоцитов с остатками нуклеол) и большие гранулированные лимфоциты (клетки с широкой цитоплазмой и азурофильными гранулами, рис. 17).
Недифференцируемые бластные клетки составляют более 3-5% (рис. 18). Однако в отдельных случаях они дают положительную реакцию на миелопероксидазу, что позволяет отнести их к миелоидному ряду.
