Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Роль и видовой состав кишечной микрофлоры в поддержании здоровья организма 8
1.2 Факторы, вызывающие дисбактериоз у животных и человека 22
1.3 Состояние микробиоценоза у инвазированн'ых животных 28
1.4 Действие антгельминтных препаратов на микробный и иммунный статус животных. 35
2. Собственные исследования
2.1 Материал и методы исследования. 40
2.2 Результаты исследований. 48
2.2.1 Влияние антгельминтных препаратов на микроценоз кишечника животных 48
2.2.1.1 Количественное и качественное изменение микрофлоры кишечника кроликов под действием пиаветрина. 48
2.2.1.2 Изменение количественного и качественного состава микрофлоры кишечника свиней под влиянием антгельминтика аверсект —2 51
2.2.1.3 Динамика количественного и качественного состава микрофлоры кишечника овец под влиянием антгельминтика авертин. 54
2.2.1.4. Действие сантела и клозальбена на микрофлору кишечника овец .56
2.2.2. Действие антгельминтных препаратов на представителей кишечной микрофлоры организма животных in vitro. 60
2.2.2.1 Влияние беламизола и аверсект-2 на биологическую характеристику Escherichia coli.
2.2.2.2.Влияние беламизола и аверсект-2 на биологическую характеристику Staphilococus aureus 63
2.2.2.3 Влияние ивертина на биологическую характеристику условно патогенной микрофлоры 66
2.2.3 Сравнительное изучение влияния антгельминтиков сантел и аверсект- на микробный и иммунный статус организма овец 79
2.2.3.1 Изменение состава микрофлоры кишечника овец под влиянием вакцинации и дегельминтизации 79
2.2.3.2 Влияние дегельминтизации на уровень антителообразования при вакцинации овец против лептоспироза 91
2.2.4 Коррекция микробиоценоза желудочно-кишечного тракта овец после дегельминтизации бифидосодержащим средством «Био-бифивит» 97
2.2.5 Динамика персистентных характеристик представителей кишечной микрофлоры свиньи под влиянием антгельминтика аверсект-2 102
3. Обсуждение результатов исследований 115
4. Выводы 120
5. Практические предложения 122
6. Список использованной литературы 123
Приложение 143
- Роль и видовой состав кишечной микрофлоры в поддержании здоровья организма
- Материал и методы исследования.
- Влияние ивертина на биологическую характеристику условно патогенной микрофлоры
Введение к работе
Актуальность работы. В последнее время появилась необходимость комплексно-системного подхода к ветеринарно-санитарным мероприятиям в профилактике инвазионных и инфекционных заболеваний с позиции ветеринарной экологии (Гуславский И.И. с соавт., 1998). Появились работы, которые указывают на возникновение заболеваний ассоциативного характера имеющие инвазионное и инфекционное начало (Панасюк Д.И., 1978). Этиологические причины их стоят на различных уровнях иерархической лестницы и находятся в тесной трофической и биологической связи» между собой, а вызываемые ими патологии зачастую связаны с состоянием экологической ситуации.
В* работах ряда авторов (Мамедова Ф.Х., 1984; Голубков В.Ф., Величкин П.А., 1970; Плиева A.M., Даугалиева Э.Х., 1983 и др.) указывается роль инвазионного процесса в запуске механизмов инфекции. Выявлено микробоносительство гельминтами, которое впоследствии становится фактром передачи инфекции. Применяемые сегодня в профилактической и лечебной работе антгельминтики широкого спектра действии не индифферентны для иммунного и микробного статуса животных, они вызывают иммунодефицитное состояние и супрессии микробного статуса организма (Малахова Е.И., Фролова Н.П., 1980; Третьяков A.M., 2001).
В связи с этим, изучение влияния антгельминтиков широкого спектра действия на микробный и иммунный статус организма животных представляет научный и практический интерес. В тоже время разработка й внедрение комплексного системного подхода в профилактике инвазионных и инфекционных заболеваний приобрело высокую актуальность с позиции ветеринарной экологии.
Цель и задачи; исследований. Целью настоящего исследования является изучение влияния антгельминтиков на микробный и иммунный
5 статус организма животных,, на биологические свойства микроорганизмов микробного ценоза желудочно-кишечного тракта, проведение коррекции микрофлоры бифидосодержащими препаратами после дегельминтизации и разработка методов одновременной дегельминтизации и микробной санации антгельминтиками и антибиотикам.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить микроэкологические нарушения в кишечнике под влиянием антгельминтиков на микробный статус желудочно — кишечного тракта.
Оценить влияние антгельминтиков на биологические свойства микробов.
3. Изучить влияние лечебной дегельминтизации на формирование
поствакцинального противолептоспирозного иммунитета.
4. Провести коррекцию микрофлоры кишечника^ овец бифидосодержащим
средством после дегельминтизации авертином.
5. Усовершенствовать методы санации микробоносительства
антгельминтиками и антибиотиками.
Научная новизна работы. Впервые в регионе озера Байкал было изучено влияние антгельминтиков на микроценоз кишечника и иммунный статус организма животных, и выявлено их негативное воздействие. Проведен микробиологический мониторинг представителей кишечной микрофлоры, изучены биологические свойства бактерий, их персистентные характеристики и изменчивость после воздействия антгельминтика. Разработан методический подход в санации; микробоносительства патогенных микробов с помощью антгельминтиков.
Практическая значимость. Результаты исследований расширяют представление о степени влияния антгельминтиков на микробный и иммунный статус организма овец, свиней и кроликов. Полученные данные показывают, что у животных наблюдаются нарушения в микро ценозе кишечника под действием этих препаратов, что свидетельствует о возможности возникновения вторичных инфекций и иммунодефицитного
состояния. Применение препарата «Био-бифивит» животным после дегельминтизации способствует восстановлению индигенной микрофлоры в короткие сроки. Полученные данные о действии антгельминтиков на стимуляцию роста некоторых патогенных микробов in vitro позволяют проводить подбор антгельминтиков с учетом; возможного формирования инфекционного начала при дегельминтизации и эпизоотической обстановки. На защиту выносятся следующие положения:
1. Микробиологические изменения в кишечнике овец, свиней и кроликов
в результате дегельминтизации;
2. Изменение биологических свойств и антибиотикочувствительности
микроорганизмов под действием антгельминтиков в условиях in vitro.
3. Применение бифидосодержащего средства «Био-бифивит» овцам после
дегельминтизации авертином.
4. Влияние антгельминтиков аверсект—2 и сантел на формирование
поствакцинального противолептоспирозного иммунитета у овец.
5. Влияние аверсекта-2 на изменение видового состава, персистентных и
гемолитических свойств кишечной микрофлоры свиньи.
6. Усовершенствование методов санации; микробоносительства
антгельминтиками.
Апробация:работы. Основные положения диссертации доложены; и* обсуждены на международной научно-практической конференции «Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных», посвященной 90-летию профессора В.Р.Филиппова (Улан-Удэ, 2003); в материалах научно—практической конференции молодых ученых и аспирантов «Проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса Байкальского региона» (Улан-Удэ, 2003); на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной: 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (Ульяновск,
7 2003); в материалах ежегодной научно-практической конференции «Состояние и перспективы развития агропромышленного комплекса Забайкалья» (Улан-Удэ, 2003); в материалах Сибирской международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004).
Публикации результатов исследований. Основные результаты научных исследований отражены в 8 работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 194 источника, из них 55 иностранных.
Номер государственной регистрации темы: 01.9.70005.375
Роль и видовой состав кишечной микрофлоры в поддержании здоровья организма
Более 200 лет изучается значение микрофлоры, постоянно обитающей в организме человека и животных. Установлено, что масса микрофлоры толстого отдела! кишечника не уступает массе самого крупного органа и составляет 2,5-3 кг, а по функциональной способности микрофлора кишечника сравнима с печенью (Simon G.L., Gorbach S.b., 1982). Кишечник животного включает до 450-500 видов бактерий. Совокупность видов микробной флоры обитающих в желудочно-кишечном тракте человека и животного, рассматривается как микробная экологическая система, обеспечивающая защиту и развитие организма.
В процессе эволюционного развития сформировался определенный микроэкологический статус кишечника, обусловленный постоянной нормальной или резидентной микрофлорой (Панин А.И., Малик Н.И;, Степаненко И.П., 2000).
Нормальная микрофлора организма-совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих ту или иную экологическую нишу (биотоп) в организме животного. Иногда вместо понятия, «нормальная» микрофлора употребляют синонимы: индигенная микрофлора (Rosemary Т., 1962), аутофлора, эубиоз (Haehel Н., Bending J., 1975), аутохтонные микробы (Уолкер П.Д;, 1975; Alexander М., 1971) или резидентная микрофлора (Нейчев С, 1977; Веселов А.Я., 1997).
Кислая среда желудка является начальным фактором, контролирующим размножение микроорганизмов, поступающих в него с пищей. После прохождения желудочного барьера микробы попадают в более благоприятные условия и размножаются в кишечнике при достаточном количестве питательных веществ, как будто в термостате. Удержание микроорганизмов на слизистой оболочке обеспечивается адгезивностью (прилипанием). Оно может быть обусловлено специфическими антигенами бактерий (К- антигены, капсульные антигены белковой или полисахаридной природы), пилями под контролем плазмид (Kallenius G., Svenson S.B., Hultberg Н: etal; 1981; Smith H.W., Huggins M.B., 1978).
Прикрепившись, микроорганизмы продуцируют экзополисахаридный кликокаликс, обволакивающий микробную клетку и образующий биопленку, внутри которой происходит деление бактерий и осуществляется: межклеточное взаимодействие. Микробы могут находиться как на поверхности, будучи интимно связанными со слизистой оболочкой органа (мукозная, или М-микрофлора), так и в просвете органа (полостная, или П— микрофлора) (Душкин В.А., 1986). М— микрофлора- пристеночная флора; представители; которой или фиксированы на рецепторах слизистой кишечника (бифидум флора) или опосредованно черезі взаимодействие с другими микроорганизмами прикрепляются к бифидум (Drasar B.S., Hill М.Т., 1974; RosenaryT., 1962; Пилуй А.Ф., Дворкин Г.Л., 1986).
Таким образом, на поверхности слизистой кишечника образуется биопленка, которая состоит из экзополисахаридного микробного происхождения муцина и миллиардов микроколоний. Толщина биопленки колеблется от долей, до десятков микрометров, при: этом: количество микроколоний может достигать нескольких сотен и даже тысяч по высоте слоя; (Но Chester S., 1986). В составе биопленки микроорганизмы в десятки-сотни раз более устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с тем, когда они находятся в свободно плавающем состоянии, т.еі М-флора более стабильна. Главным образом, это бифидо— и лактобактерии, образующие слой так называемого «бактериального дерна»; препятствующего пенетрации слизистой патогенными и условно патогенными микроорганизмами. Конкурируя за взаимодействие с рецепторами эпителиальных клеток, М-флора обусловливает колонизационную резистентность толстой кишки. П-флора, наряду с бифидо- и лактобактериями, включает и других постоянных обитателей; кишечника (Alexander М., 1971).
В организме животного и человека содержится 1014—1016 клеток бактерий, что в сотни раз превышает общее число клеток всех органов и тканей макроорганизма. Они составляют своеобразный «экстракорпоральный орган». Этот «орган» как и любой другой: орган животного, имеет свои функции, критерии и показатели функционального состояния, т.е. нормы и отклонения от нормы (Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., 1996; Дорофейчук В.Г., 1977; КуваеваИ.Б., 1979).
Основу нормальной микрофлоры полости рта, желудка,. кишечника; гениталий, глубоких слоев кожи составляют неспорообразующие.облигатно-анаэробные микроорганизмы. Соотношение анаэробов ш аэробов в этих биоценозах составляет от 10:1 (в слюне) до 1000:1 (тонкий и толстый кишечник) (Маннапова Р.Г.,1998; Петровская B.F., 1979);
Облигатная микрофлора (резидентная, индигенная, аутохтонная) имеется у всех здоровых животных (постоянно). Это микроорганизмы; максимально приспособленные к существованию в кишечнике и закономерно встречающиеся. До 95% приходится на анаэробную флору (бактероиды, бифидобактерии, лактобактерии) - это основная, главная флора (109-1012мт/г).
Материал и методы исследования
Работу проводили с 2001 по 2004 год на кафедрах микробиологии, вирусологии и ветеринарно - санитарной экспертизы, паразитологии и фармакологии БГСХА имени В.Р.Филиппова ив бактериологическом и 1 серологическом отделах Бурятской республиканской научно го производственной ветеринарной лаборатории. Материал для исследований брали в хозяйствах Мухоршибирского и Тарбагатайского районах. Для бактериологического исследования . копрограммы отбирали пробы1 содержимого кишечника; свиней, овец и кроликов. В экспериментах использовали следующие среды: МПА, МПБ, МПЖ, кровяной МПА, среды Эндо, Левина, Плоскирева, Сабуро. висмут сульфитный агар, молоко, желточно - солевой агар, агар Бл аурокка, среда Вильсона-Блера. Материалом для исследования служили свежевыделенные фекалии отдельных животных. Все микробиологические манипуляции проводились с соблюдением правил стерильности. Фекалии, взятые до утреннего кормления в пробирки с 1 мл физиологического раствора, разводили им же до конечного соотношения к весу фекалий 1:9, после гомогенизации, полученную взвесь yt подвергали последовательным десятикратным разведениям со сменой пипеток в физиологическом растворе от 10і до 101 . Затем из каждого разведения материал засевали по 0,1 мл на чашки с твердыми питательными средами с последующим растиранием шпателем, по 1 мл в пробирки с полужидкой, питательной средой. Учет результатов проводили для аэробных бактерий через 24-48 ч и для анаэробных через 48-96 ч культивирования при 37 в условиях микроанаэростата. Схема посева материала на питательные среды представлена в таблице 1. количество выросших колоний на чашке или в пробирке; п — степень разведения материала.
С целью установления видовой принадлежности и изучения биохимических свойств, выделенных микроорганизмов, их изолировали в чистой культуре, отбирая, колонии лежащие отдельно друг от друга. Выделение и родовую идентификацию осуществляли в соответствии с методиками, изложенными в методической рекомендации 1986 г., и в методике К.К Раевского., В.М; Добрынина, В.И. Кочеровец (1997).
Для подсчета бифидобактерии разведения фекалий вводили в свежередуцированную среду Блаурокка в модификации F.H. Гончаровой (1968), разлитую в пробирки высоким столбиком (не меньше 10 мл), колонии бифидобактерии вырастали в виде характерных образований в нижней части посевной среды. При необходимости пастеровской пипеткой отбирали отдельные колонии, которые подвергали микроскопированию. Окраску препаратов проводили по Граму. Грамположительные клетки с характерными образованиями на концах, рассматривались как принадлежащие к роду Bifidobacterium. Для подсчета клостридиальных форм бактерий 0,1 мл каждого разведения добавляли в расплавленную и охлажденную до 56 среду Вильсон-Блера. После перемешивания среда с посевами в высоком столбике оставалась при комнатной температуре до застывания. Учет результатов осуществляли по количеству черных колоний в толще питательной, среды. Микробы семейства Enterobacteriaceae выделяли на средах Эндо, Плоскирева и Левина. На основании морфологии колоний и данных микроскопирования посчитывали количество кишечных палочек, сальмонелл и протея. Изоляцию стафилококков проводили на желточно-солевом агаре, содержащем 7,5% NaCl, и последующим микроскопированием выросших колоний. Бактерии округлой формы с; характерным гроздевидным расположением были отнесены к роду Staphylococcus. Для выделения грибов использовали среду Сабуро с тетрациклином (45мг/л). Выросшие грамположительные крупные круглой или: овальной формы клетки с диаметром 2,5 — 6 мкм, дающие на среде Сабуро бесцветные или слабоокрашенные колонии круглой формы в аэробных условиях при 37, были отнесены к грибам рода Candida. Для определения количества гемолизирующей энтеропатогенной микрофлоры применяли 5%-ный кровяной МПА. Подсчету подвергались те колонии микроорганизмов, которые образовывали зону гемолиза.
Изучение морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических, гемолитических свойств, выделенных микроорганизмов из кишечника свиней производили с применением методов общей микробиологии (Биргер М.О., 1983; ГерхардФ., 1983; Антонов Б.И., 1986). Для изучения тинкториальных свойств микроорганизмов мазки окрашивали по Граму, Трухильо, Романовскому-Гимза. Культуральные свойства изучали на следующих средах: МПА, МПБ, кровяном МПА, Эндо, Левина; Плоскирева, висмут-сульфитном агаре. Протеолитические свойства микроорганизмов определяли на МПЖ и молоке.
Влияние ивертина на биологическую характеристику условно патогенной микрофлоры
Известно, что отдельные патогенные микробы обладают чувствительностью к антибиотикам. Возможно, под влиянием различных химических веществ данная способность может находиться; в состоянии изменчивости: в одном случае - приобретение устойчивости; в другом случае , - восстановление чувствительности к антибиотикам. В данном разделе работы рассматривается динамика, изменчивости чувствительности и устойчивости под влиянием антгельминтика ивертин. В таблице 9 представлена чувствительность микробов к антибиотикам. Микробная культура St. aureus в контроле проявляла устойчивость к антибиотику цефалоридину, через 6-24 часа культивирования с антгельминтиком ивертин устойчивость к нему сохранялась, а к концу культивирования через, 48 часов культура становилась чувствительной к антибиотику, зона задержки; роста составляла 14 мм. К рифампицину изменчивость носила цикличный характер. К 6 часам культивирования4 чувствительность культуры к антибиотику рифампицин уменьшалась (15 мм) по сравнению с контролем (20 мм), а к 12 часам снова повышалась (25 мм) и к 18—24 часам культивирования отмечали снижение чувствительности с зоной задержки роста - 13 мм, к 48 часам культура вновь проявляла высокую чувствительность к данному антибиотику (25 мм). К цефазолидину данная культура в исходном показателе имела высокую чувствительность (26 мм). Но при культивировании с антгельминтиком в начале наблюдали устойчивость культуры к антибиотику,, и зона подавления роста с 12. — 24 часа культивирования повышалась от 15 мм до 20 мм, а к 48 часам зона задержки роста составляла 17 мм. К полимиксину в контроле зона задержки роста равнялась- 14 мм, через 6и 12 часов? приобретала устойчивость к этому антибиотику, а: через 18 -48 часов отмечали постепенное повышение чувствительности. St. aureus под влиянием антгельминтика на 6 - 12 часы культивирования приобретал высокую чувствительность к левомицетину, затем: в дальнейшие часы культивирования чувствительность снижалась, и достигала контроля (22 мм), а к 48 часам левомицетин становился не способным сдерживать рост данной культуры. У исследуемого штамма к фурагину зона задержки; роста в контроле равнялась 16 мм, через 6 часов культура в присутствии антгельминтика приобретала? стабильную устойчивость, которая сохранялась вплоть до 48 часов. St. aureus был устойчив к стрептомицину в контроле и через 6 часов культивирования с антгельминтиком. Через 12 часов культура приобретала чувствительность к антибиотику, которая нарастала до 24 часов, а к 48 часам показатели становились, сравнимы с контрольными данными. К пенициллину St. aureus имел цикличный характер. Чувствительность культуры к антибиотику отмечалась через 6, 12 и. 24 часа культивирования, а через 12 и 48 часов отмечалась устойчивость к антибиотику. Чувствительность к оксациллину в контроле равнялась 18 мм, через 6-24 часа культивирования St .aureus был устойчив к действию антибиотика, а к 48 часам наблюдали ее слабую чувствительность.
