Введение к работе
Актуальность темы. Одной из задач ветеринарной службы, имеющей важное социальное значение, является охрана населения от болезней, общих для человека и животных (Закон РФ «О ветеринарии», раздел V, статья 20). Значительную проблему для здоровья человека и животноводства представляют пищевые токсикоинфекции, социальную и экономическую значимость которых трудно переоценить. Так, по данным экспертов ВОЗ каждый год в мире регистрируют свыше 5 миллионов случаев заболеваний людей пищевыми токсикоинфекциями, из них более 9 тысяч с летальным исходом (WHO report, 1998). По данным ЦНИИ эпидемиологии, суммарный экономический ущерб от этих болезней в России за год выражается величиной порядка 13,1 млн. долларов США.
Учитывая повсеместное распространение пищевых токсикоинфекции, в рамках ООН была создана международная программа ФАО/ВОЗ по безопасности пищевых продуктов. Особое внимание в программе уделено медико-микробиологическим требованиям к пищевым продуктам в отношении их контаминации бактериями, которые выделяются не только от больных людей и животных, но и чрезвычайно широко распространены в объектах внешней среды (А.В.Куликовский, 1997). К числу таких бактерий относятся Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis (возбудители иерси-ниозов), которые длительное время не привлекали особого внимания исследователей, так как в начале 60-х годов XX столетия были известны лишь единичные случаи заболевания людей иерсиниозами. Начиная с 1967 года, отмечены уже несколько тысяч случаев заболеваний; впоследствии было установлено, что по тяжести течения и частоте встречаемости иер-синиозы не менее значимы, чем сальмонеллезы (Г.В.Ющенко, 1985, Г.П.Сомов, 1986, Н.Ф.Тимченко, 1991).
Следует учитывать, что род Yersinia, согласно определителю зоопа-тогенных бактерий, включает Yersinia pestis (возбудитель чумы, относится к группе особо опасных инфекций) (МА.Сидоров и др., 1995). Установлено, что уровень гомологии ДНК Y.pestis sub.pestis Р-1300 и Y.pseudotuberculosis 43 - III составлял - 87 % (±5) - 93 % (±3) (СВ.Балахонов, 1988).
Психротрофные свойства иерсиний способствовали резкой активизации циркуляции и закреплению их в антропосфере (Г.П.Сомов, В.И.Покровский, Н.Н.Беседнова, 1990, Н.Ф.Тимченко, 1991, Г.В.Ющенко, 1994). Так, в тех странах, где налажена диагностика, на долю иерсиниозов приходится 4 % всех пищевых токсикоинфекции. В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниозы (по уровню заболеваемости населения) занимают третье место после сальмонеллезов и кампилобакте-риоза (WHO report, 1980-1998).
В России, по данным Республиканского информационно-аналитического центра, иерсиниозы приобрели наибольшую эпидемиологическую значимость и находятся на втором месте после сальмонеллезов. В последние годы наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний иерсиниозами, причем нередко данные являются заниженными, из-за недостаточно полной их регистрации (В .И.Покровский, 1997). Иерсиниозы характеризуются повсеместным и значительным распространением; высокой заболеваемостью детей до 14 лет (болеют дети всех возрастных групп, в том числе и до 1 года); возможностью развития генерализованных и септических форм с летальным исходом; массовостью вспышек пищевого характера. У человека кроме диареи Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica могут вызывать энтерит, псевдоаппендицит, мезентериальный лимфаденит, артриты, менингит, поражение сетчатки; на 2-3-й неделе возможны рецидивы; септицемия, связанная с этими бактериями, характеризуется высоким уровнем смертности. (В.И.Покровский, Г.В.Ющенко, 1983, Г.П.Сомов и др., 1990, Bockemuhl, 1995).
Приведенные данные свидетельствуют о важности проблемы, которая признана Всемирной организацией здравоохранения глобальной (WHO report, 1980,1998).
За годы, прошедшие с момента описания возбудителей иерсиниозов, достигнуты значительные успехи в изучении их свойств, эпидемиологии, диагностики, прежде всего, благодаря исследованиям Г.В.Ющенко, В.И.Покровского, А.П.Авцына, Г.П.Сомова, Н.Н.Беседновой, Н.Ф.Тимченко, Б.Л.Черкасского, Ю.Е.Полоцкого, В.Ю.Литвина, В.И.Пушкаревой, Б.И.Маракуши, А.А.Жаворонкова, Л.М.Исачковой, А.Б.Дайтер, Г.Я.Ценевой. Тем не менее, множественность сероваров иер-синий, сложность дифференциальной диагностики обусловливают трудности в профилактике заражения человека. Проблема усложняется тем, что иерсиниозы в ветеринарии еще мало изучены, хотя установлено, что иер-синии циркулируют в объектах ветеринарно-санитарного надзора (Г.В.Ющенко, 1983, А.Ф.Бабкин и др., 1987, Е.А.Кирьянов, И.И.Савчук, 1988, А.В.Куликовский и др., 1988, В.С.Ефремов, 1990, В.А.Гордейко, В.ИПушкарева, 1990, С.И.Куцевалов, 1991, Е.П.Каландадзе, 1991, Л.С. Каврук, 1995, К.В.Шумилов, Л.П.Мельниченко, 1996, В.Г.Скрыпник, А.В.Митрофанов, 1997, А.С.Собакин, Л.Ф.Зыкин и др., 1998).
Сельскохозяйственные животные являются основными источниками, а продукты животного происхождения - факторами передачи возбудителей иерсиниозов человеку. В этой связи научно обоснованные профилактические мероприятия в начале «пищевой цепи» (в животноводстве и перерабатывающей промышленности) являются одними из важнейших компонентов в предотвращении контаминации пищевого сырья и продук-
тов животного происхождения иерсиниями, а сама проблема является актуальной для ветеринарной медицины.
Для достижения эффективных практических результатов в данной области необходимы фундаментальные исследования, в частности по биологии и экологии иерсиний. Помимо большого социального значения, эти вопросы связаны с теоретическими проблемами общей биологии, такими как адаптация психротрофных бактерий к паразитированию в теплокровном организме.
Углубление научных исследований по раскрытию механизмов экологической пластичности иерсиний, разработка методов идентификации возбудителей, научное обоснование комплекса мероприятий, направленных на предупреждение заболеваний животных иерсиниозами и получение безопасных продуктов животноводства, с целью профилактики заболеваний человека и определило актуальность проблемы диссертационной работы.
Цель и задачи исследований.
Цель работы: изучить биологию и экологию иерсиний для теоретического обоснования и разработки мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения - человеку.
Для достижения поставленной цели были определены" следующие задачи.
-
Изучить морфологические, культурально-биохимические и серологические свойства иерсиний, определить критерии их дифференциации от таксономически близких и сходных видов бактерий и разработать методы обнаружения возбудителей иерсиниозов в сырье животного-происхождения и объектах внешней среды.
-
Изучить широту распространения и сроки выживания иерсиний в объектах ветеринарно-санитарного надзора.
-
Изучить адгезивные и вирулентные свойства культур микроорганизмов, выделенных из различных источников.
-
Провести бактериологические и электронно-микроскопические исследования при экспериментальном моделировании иерсиниоза in vivo.
-
Изучить влияние факторов внешней среды на рост и популяци-онную изменчивость иерсиний.
-
Изучить морфологию иерсиний на клеточном, субклеточном и популяционном уровнях.
-
Изучить внутривидовой и межвидовой антагонизм бактерий, исследовать межпопуляционное взаимодействие иерсиний с инфузориями.
-
Теоретически обосновать комплекс мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения - человеку.
Научная новизна. Разработан и осуществлен новый подход в изучении экологии и биологии иерсиний - использование комплекса электронно-микроскопических и морфометрических методов в сочетании с бактериологическими и гистологическими исследованиями - для выявления факторов патогенности (адгезивности, инвазивности, цитотоксично-сти), внутрипопуляционной изменчивости иерсиний in vivo и in vitro, пределов адаптации психротрофных бактерий к изменяющимся условиям среды обитания.
На основании результатов комплексного изучения биологических свойств возбудителей иерсиниозов выявлены критерии их дифференциации по фенотипическим свойствам от таксономически родственных видов бактерий.
Испытаны и подобраны наиболее оптимальные бактериологические методы индикации и идентификации иерсиний, определена частота их распространения на объектах ветеринарно-санитарного надзора.
Изучены вирулентные и адгезивные свойства культур микроорганизмов, выделенных из различных источников.
Установлены сроки выживаемости иерсиний в объектах внешней среды, в зависимости от температурного фактора, их устойчивость к анти-биоткам и дезинфицирующим средствам.
In vitro и in vivo, с использованием микробиологических, светоопти-ческих, электронно-микроскопических, цитохимических, гистологических, морфометрических методов проведено сравнительное изучение морфологии Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni на клеточном, субклеточном и популяционном уровнях, без нарушения архитектоники колоний, что позволило выявить закономерности существования различных видов иерсиний в колониях, представляющих собой ограниченную часть популяции.
Установлено, что колония иерсиний является многоклеточным сообществом с упорядоченным строением и дифференциацией отдельных клеток в зависимости от среды обитания.
Выявлено, что изученные виды иерсиний в процессе роста в колониях формируют покровы однотипного строения, являющиеся внеклеточным образованием.
Исследованием ультратонких срезов единичных колоний иерсиний в межклеточном пространстве выявлены фибриллярные структуры полиса-харидиой природы, являющиеся элементами покрова.
Показано, что покровы на поверхности колоний и микроколоний выполняют полифункциональную роль: осуществляют межпопуляцион-ное взаимодействие, процессы адгезии и колонизации, выполняют защитную функцию при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды на микробную популяцию.
В сканирующем электронном микроскопе выявлены длинные нитевидные структуры, располагающиеся по краю бактериальных колоний иерсиний. На поверхности и внутри таких структур обнаружены клетки шаровидной формы, участвующие в формировании микроколоний.
Показано, что при воздействии физических и химических факторов наблюдается внутрипопуляционная изменчивость иерсиний, выражающаяся диссоциацией на S-R-формы: в S-формах клетки имеют типичную для вида палочковидную форму; в R-формах, наряду с типичными для данного вида клетками, с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии обнаружен гетероморфизм популяции иерсиний, по морфологии свойственный L-трансформации бактерий.
Изучены межпопуляционные взаимодействия иерсиний с микроорганизмами-продуцентами биологически активных веществ, флокулирую-щими бактериями Z.ramigera (обитателями активного ила) и простейшими. Показано, что при этих взаимодействиях популяция иерсиний переходит в стадию гетероморфизма, характерного для L-трансформации.
Выявленный гетероморфизм клеток свидетельствует о пластичности и изменчивости иерсиний, присущей циклу развития бактериальной популяции, объясняет широкое распространение их в природе, обусловливает необходимость использования сред обогащения при выделении чистой культуры иерсиний.
С использованием гистологических, цитохимических, морфометри-ческих и электронно-микроскопических методов, описана топография слизистой оболочки кишечника лабораторных мышей и кур, в норме и при взаимодействии с иерсиниями.
Практическая значимость. На основании результатов изучения биологии и экологии иерсиний теоретически обоснован и предложен комплекс мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов животных, а также через продукты животного происхождения - человеку. Эти мероприятия включают: выявление иерсиний из патологического материала животных, объектов внешней среды и пищевых продуктов животного происхождения; проведение дезинфекционных мероприятий, направленных на уничтожение возбудителей иерсиниозов во внешней среде; осуществление ветеринарно-санитарной экспертизы туш и продуктов убоя при иерсиниозах; соблюдение мер личной профилактики.
По итогам результатов собственных исследований разработаны «Методические указания по выявлению Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 26.01.1998), включающие правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации иерсиний.
Модифицирован метод ускоренного способа количественного учета микроорганизмов, позволяющий изучать не только количественные изменения в бактериальной популяции, но и межклеточные взаимодействия, а также внутрипопуляционную изменчивость в световом, сканирующем и просвечивающем электронном микроскопе. Результаты данного этапа исследований легли в основу «Методических указаний по определению общего микробного числа в пищевых продуктах и объектах внешней среды» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 16.01.1999).
На основании экспериментальных данных по изучению межпопуля-ционных взаимодействий иерсиний с флокулирующими бактериями, грибами, микроводорослями, простейшими и другими представителями микробиоценоза активного ила аэротенков разработаны «Методические рекомендации по определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 07.05.1999).
Разработаны «Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 16.01.1999 г.), позволяющие осуществлять объективную оценку адгезивной способности иерсиний и других бактерий с рецепторами животных клеток (эритроцитов, гепатоцитов, энтероцитов и др.).
Разработаны методы подготовки препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, дающие возможность изучать морфологию иерсиний in vivo и in vitro, как при естественном развитии, так и при воздействии различных физических, химических, биологических факторов.
Установлено, что иерсиний чувствительны к гентамицину, канами-цину, левомицетину, мономицину, неомицину, полимиксину, тетрациклину, эритромицину, отварам лекарственных растений (толокнянки обыкновенной, аронии, листьев брусники, крапивы). Микроорганизмы-продуценты биологически активных веществ L.fermentum, L.plantarum, L.helveticum, L.acidofillum, B.polimixa вызывают угнетение роста иерсиний.
Установлено, что флокулирующие бактерии Zoogloea ramigera способны снижать количество бактериальных клеток иерсиний, включая их в полисахаридный. матрикс формирующихся флокул. Это позволяет рекомендовать использование флокулирующих бактерий, для повышения эффективности биологической очистки сточных вод.
По отношению к Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni установлена бактерицидная активность 1%-го едкого натра, 0,1%-го хлорамина, 0,1%-го формальдегида, 1,0%-го рас-
твора перекиси водорода. На тест-объектах (метлахской, глазурованной, металлической плитках) гибель иерсиний при воздействии дезинфицирующих средств наблюдалась через 10 мин. При воздействии на бактерии температуры 59С гибель иерсиний наступала через 10 мин; при 60-80С -через 5 мин. Это позволило отнести иерсиний к малоустойчивой группе (первая группа) в инструкции «Проведение ветеринарной дезинфекции объектов животноводства». М., 1989.
Собственные исследования по биологии, экологии и диагностике возбудителей иерсиниозов легли в основу монографии «Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики» (1998), предназначенной для ветеринарных специалистов.
Материалы диссертации были использованы в цикле лекций для слушателей факультета повышения квалификации (МГУПБ) по темам: «Патофизиология органов пищеварения при диареях»; «Продукты животного происхождения - факторы передачи возбудителей пищевых токсико-инфекций»; «Лабораторная диагностика и профилактика иерсиниоза» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 17.03.1999 г).
Изданы и внедрены в учебный процесс МГУПБ: (кафедра инфекционных и паразитарных болезней; кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы) методические указания к практическим занятиям для студентов ветеринарно-санитарного факультета по темам: "Лабораторная диагностика иерсиниоза" (М., МГУПБ, 1997); «Средства и меры личной профилактики при зооантропонозах» (М., МГУПБ, 1997); «Ветеринарно-санитарная оценка и экспертиза продуктов убоя при иерсиниозе» (М., МГУПБ, 1998), учебное пособие «Функциональная морфология органов пищеварения» (М., МГУПБ, 2000).
Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательской работы 4-8-97В «Разработать ве-теринарно-санитарные нормативы и критерии безопасности сырья и продуктов животного происхождения» (номер Государственной регистрации 01990001018).
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы изложены в отчетах НИР, доложены и одобрены на заседаниях кафедры инфекционных и паразитарных болезней и ученого Совета ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ (Москва, 1994-1999 гг.); III Всесоюзной конференции по-эпизоотологии (Новосибирск, 1991); Международном симпозиуме: «Пищевые зоонозы - сальмонеллезы, кам-пилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1995); Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов:
«Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования» (Воронеж, 1995); Международной конференции: «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 1995); VIII-ом Международном симпозиуме: «Ветеринарная лабораторная диагностика (Jerusalem, Israel, 1996); Международном симпозиуме: «Биомедицинская оптика» (San Jose, California USA, 1997); Международной научно-практической конференции: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1997); Юбилейных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения И.В.Орлова (М., 1999); Международной конференции: «Пища, экология, человек» (М., 1996, 1997, 1999); Юбилейных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения Д.М.Тетерника (М., 1999).
На защиту выносятся следующие положення:
результаты комплексного изучения биологических свойств возбудителей иерсиниозов, критерии их дифференциации по фенотипическим свойствам от таксономически родственных видов бактерий;
методы выявления Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения;
материалы по распространению и выживаемости иерсиний на объектах ветеринарно-санитарного надзора;
методы подготовки препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, позволяющие изучать морфологию иерсиний in vivo и in vitro как при естественном развитии, так и при воздействии факторов внешней среды.
материалы по изучению морфологии иерсиний на субклеточном, клеточном и популяционном уровнях in vivo и in vitro;
материалы по изучению влияния физических и химических факторов на рост, размножение и популяционную изменчивость иерсиний;
материалы по изучению внутривидового и межвидового антагонизма бактерий и межпопуляционного взаимодействия иерсиний с беспозвоночными животными;
теоретическое и экспериментальное обоснование мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения человеку.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 34 печатных работах, в том числе, монографии «Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики» (М., 1998)..
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 374 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 6 схем, 15 диаграмм, 25 электроннограмм, 50 сканограмм, 24 фотографии и микрофотографии. Библиографический список включает 427 источников, из них 202 иностранных авторов.
