Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Характеристика ротавируса крупного рогатого скота
2.1.1. Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса 10
2.1.2. Клинические признаки и патоморфологические изменения при ротавирусном энтерите телят 11
2.1.3. Иммунитет при ротавирусной инфекции КРС 14
Характеристика коронавируса крупного рогатого скота
2.2.1. Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса 15
2.2.2. Клинические признаки и патоморфологические изменения при коронавирусном энтерите телят 17
2.2.3. Иммунитет при коронавирусной инфекции КРС 19
Характеристика вируса диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
2.3.1. Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса 20
2.3.2. Клинические признаки и патоморфологические изменения при вирусной диарее КРС ...22
2.3.3. Иммунитет при ВД-БС КРС Специфическая профилактика при рота-коронавирусных энтеритах телят и вирусной диарее - болезни слизистых оболочек КРС 27
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы 40
3.1.1. вирусные штаммы 40
3.1.2. культуры клеток и питательные среды 40
ЗЛ.З. подопытные животные 41
3.1.4. серологические и вирусологические методы исследований 41
3 Л .5. статистическая обработка результатов 43
3.2. Результаты исследований
3.2.1. Изготовление и контроль вакцины инактивированнои противрота-коронавирусных энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота 44
3.2.1.1. накопление вирусного материала 44
3.2.1.2. проверка вирусного материала на специфичновть 44
3.2Л.З. приготовление ассоциированной вакцины 45
3.2.1.4. проверка вакцины на полноту инактивации вируса 46
3.2.1.5. испытание вакцины на стерильность 47
3.2.1.6. изучение безвредности и антигенной активности вакцины на лабораторных животных 47
3.2.2. изучение антигенной активности вакцины в опытых на стельных коровах 49
3.2.2.1. изучение эпизоотической ситуации в хозяйствах 50
3.2.2.2. уровень антител у вакцинированных коров к ротавирусу в сыворотке крови и молозиве 53
3.2.2.3. уровень антител у вакцинированных коров коронавирусу в сыворотке крови и молозиве 57
3.2.2.4. уровень антител у вакцинированных коров к ВД-БС в сыворотке крови и молозиве 62
3.2.3. Иммунный ответ у телят, полученных от вакцинированных коров 66
3.2.3.1. динами ка гуморальных антител у телят к ротавирусу 66
3.2.3.2. динамика гуморальных антител у телят к коронавирусу 70
3.2.3.3. динамика гуморальных антител у телят кВД-БСКРС 73
3.2.4. Уровень заболеваемости и падежа телят в опытных и контрольных группах животных 77
4. Обсуждение результатов исследований 79
5. Выводы 85
6. Практические предложения 86
7. Список литературы 87
8. Приложения 106
- Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса
- Изготовление и контроль вакцины инактивированнои противрота-коронавирусных энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота
- уровень антител у вакцинированных коров к ВД-БС в сыворотке крови и молозиве
Введение к работе
На протяжении многих лет животноводство всех стран мира, в том числе и России, несет значительные экономические потери от желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. В основе сложившейся неблагоприятной ситуации лежит целый ряд неспецифических предрасполагающих факторов, среди которых наиболее важными являются содержание большого поголовья скота на ограниченном пространстве, механизация методов содержания и кормления, что ведёт за собой ограничение двигательной активности у животных, возникновение стрессов, усложнение микробного и вирусного пейзажа в хозяйствах и комплексах, снижение иммунитета. В этих условиях, особенно при нарушении санитарно-гигиенических норм, несвоевременной выпойки молозива телятам, а также при отсутствии на станциях искусственного осеменения должного контроля на возможную контаминацию спермы вирусами, нередко возникают и очень быстро распространяются инфекционные заболевания, в том числе, вирусные энтериты телят.
Рота-, коронавирусы и вирус диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота широко распространены во всём мире, в том числе и в нашей стране (Жидков С.А., 1994; Н. Frerking, 1998; Lecce J.G., King M.W., 1982; Meyling A., 1979; Doll K., P. Weirather, H.-M. Kuchle, 1995; von G. Schlerka, S. Gutter und W. Baumgartner, 2002; Hochsteiner W.s K. Mostl, S. Franz, F. Schilcher und W. Baumgartner, 2002; von O.-R. Kaaden, 2002; Sato K., Inaba Y., Shinozaki Т., 1981; Гаффаров X.3., 2000; Петрова О.Г. и др., 2002). Эти вирусы занимают одно из ведущих мест в патологии желудочно-кишечного тракта новорожденных телят. Так, зачастую, в 60 — 100% случаев при заболевании телят диареей, выделяют ротавирус, коронавирус, ВД-БС или их ассоциацию (Асташенко Н.Ж., 1985; Acres S.D., Babiuk L.A., 1978; Петрова ОТ. и др., 2002).
Величина экономического ущерба при этих заболеваниях, складывающаяся из падежа телят, снижения мясной и молочной продуктивности, уменьшения привесов, выбраковки животных, убытка от абортов, бесплодия ил\д., огромна, а терапевтические меры борьбы с уже возникшим заболеванием малоэффективны. Поэтому в комплексе противоэпизоотических мер борьбы с ротавирусным, коронавирусным энтеритами, вирусной диареей КРС, специфическая профилактика является ведущей.
В арсенале биологической промышленности во всём мире имеется большое количество препаратов, предназначенных для специфической профилактики вирусных и смешанных энтеритов телят (Мищенко В.А. и др., 2002; Романов Е.А. и др., 2000; Зеленое А.Е и др., 2004; von S. Jahnecke und and., 2002; Crouch et al., 2001), которые широко употребляются на практике ветеринарными специалистами. Поэтому массовое применение иммунобиологических средств защиты животных требует особого контроля на всех этапах их изготовления, производства и использования. Особенно это касается ассоциированных препаратов, поскольку их конструирование из различных антигенов довольно сложная задача и подразумевает получение вакцины, обладающей высокими иммуногенными свойствами по каждому из компонентов.
В связи с этим изучение противоэпизоотической эффективности и иммуногенных свойств, включающее количественное определение уровня антител у животных, их динамику а также влияние иммунизации на заболеваемость и сохранность поголовья является главным практическим критерием оценки вакцин против вирусных энтеритов телят, и, в конечном итоге, подтверждает или опровергает целесообразность их применения.
Таким образом, задача испытания в полевых условиях антигенной активности и противоэпизоотической эффективности вакцин, как и любого биологического препарата, является весьма актуальной, поскольку даёт реальное представление о том, какого результата можно ожидать от применения препарата на фоне естественной циркуляции различных возбудителей вирусных диарей КРС.
Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса
Первый изученный вирус этой группы — возбудитель диареи телят — был назван реовирусоподобным агентом, так как по ряду свойств он оказался сходным с реовирусами. Семейство реовирусов (Reoviridae) объединяло сначала два рода — Reovirus и Orbivirus, обладающих многими общими свойствами. Впервые обнаружившие при гастроэнтерите человека реовирусоподобный агент Bishop R., Davidson G. и соавт. (1973) отнесли его к орбивирусам в соответствии с размерами и морфологией частиц. Их дальнейшие исследования показали отличия нового вируса от типичных представителей как рода Reovirus так и рода Orbivirus. Поэтому в 1975 году Davidson G., Bishop R. и соавт. предложили отнести сходные вирусы — возбудители гастроэнтеритов человека и животных к самостоятельному роду Duovirus в семействе Reoviridae. Название «дуовирус» по замыслу авторов указывал на отличительную особенность вириона - двойной капсид, а также на кишечный характер инфекции — размножение вируса в клетках дуоденального эпителия. Flewett Т., Bryden А. и соавт. (1974) несколько раньше предложили для этой группы вирусов родовое название Rotavirus (от латинского rota - колесо, которое вирусная частица напоминает под электронным микроскопом). Оно было принято в 1975 г. Международным комитетом по таксономии вирусов как название отдельной группы в семействе Reoviridae (Дроздов С.Г., Покровский В.И., Шекоян Л.А. , Машилов В.П., 1982). В 1978 году ротавирусы различных видов животных и человека были выделены в самостоятельный род Rotavirus семейства Reoviridae (Wattews R.E., 1979).
В естественных условиях ротавирус вызывает заболевание телят в возрасте от 2 дней до 6 - 8 недель (Bridger J.C., Woode G.N., 1975; Sibelin М., Szekely Н., Burki F., 1980), реже, до 6 месяцев (Durham P.J.K., 1979; Truszczynski М., Lis Н., 1981), чаще же всего болеют телята первых двух недель жизни (Хараламбиев Х.Е., Георгиев Г.К., Мигов Б., Ешкенази М., 1983; Acres S.D., BabiukL.A., 1978; Ellens D.J., Leeuw P.W, 1980; Mebus C.A., White R.G., Baas E.P., Twiehaus M.J., 1973; Theil K.W., Bohe E.H., Cross R.F., 1978; Lecuw P.W., Ellens D J., Straver P.J., 1980; Nulty M.S., Ferran J.S., Bryson D.G., 1976; Wood G.N., 1978.).
Инкубационный период, по наблюдениям многих авторов, длится от 12 часов до трёх суток (Bridger J.G., Woode G.N., 1975; Fernelius A.L., Ritchie A.E., Classick L.G., 1972; Mebus C.A., 1977; Nultu M.S., 1978; Theil K.W., Bohe E.H., Cross R.F., 1978), что зависит от возраста и иммунологического состояния телят. Симптомы заболевания при ротавирусной инфекции телят неотличимы от диарей других этиологии.
Считается, что инфекция, вызываемая E.coli, возникает у телят в первые 3 — 5 дней жизни, выражена клинически и сохраняется в стаде длительное время, а ротавирусная инфекция проявляется у молодняка в возрасте 3 — 14 дней и в более умеренной форме. Коронавирусы поражают животных более старшего возраста (Ellens D.J., Leeuw P.W, 1980; J. Stepenek et.al., 1984)
По наблюдениям X. Хараламбиева, Д. Белчева (1980), коли-энтериты возникают чаще у телят 3-5 дневного возраста как внезапные вспышки, сопровождающиеся острым течением и высокой смертностью. Ротавирусный энтерит возникает между 4 и 12 днями жизни и сопровождается менее тяжёлым течением, часто заканчивающимся благополучно. Коронавирусный энтерит чаще всего поражает 5-15 дневных телят и имеет большую продолжительность (3 — 5 дней) с двумя клиническими пиками.
Заболевание при ротавирусной инфекции может протекать субклинически или с различной по тяжести клиникой, которая в общих чертах характеризуется диареей с выделением водянистых фекалий, иногда с примесью крови и слизи, отсутствием аппетита, угнетением и дегидратацией. Температура незначительно повышается или остаётся на нормальном уровне. (Nultu M.S., 1978; Mebus С.А., 1977; Leeuw P.W., Ellens D.J., Straver P.J., 1980).
P.W. Leeuw et.al (Leeuw P.W., Ellens D.J., Balken J.A.M., Straver P.L 1978; Heinrich H.W., Schirrmeier H., Lange E., Gransow H., 1983) отмечают два синдрома в течении диареи у телят: лёгкое и короткое переболевание -«ранняя диарея», проявляющаяся в первые три дня жизни и, обычно более тяжёлая, «поздняя диарея» - с 4 по 14 дни жизни.
Экскреция ротавируса при этом установлена исследователями в 5% при «ранней» диарее и в 77% - при «поздней». Выделение вируса отмечено также среди 22% здоровых и выздоравливающих телят.
После выздоровления телята плохо растут, в течение нескольких месяцев может периодически возникать диарея (Durham P.J.K., 1979).
Многим исследователям (Mebus С.А., 1977; Middleton P., 1978; Middleton P.J., Holdaway M.D., Petric M. et al., 1977; Heinrich H.-W., Leibermami H., Schirrmeier H., 1980) удавалось экспериментальным путём заражать телят, лишённых молозива, безбактериальным фильтратом изолятов ротавируса с развитием той же клиники. При этом авторы отмечали положительную корреляцию между началом заболевания и появлением большого количества вируса в фекалиях.
Выделение вируса больными телятами продолжается в течение 14-20 дней (Bridger J.G., Woode G.N., 1975; Pastoret Р.-Р., Schoenaers F., 1977). Некоторые авторы (Durham P.J.K., 1979) считают, что диарея длится дольше, чем выделяется вирус.
Приводится много данных (Bachmann Р.А., Mayr А., 1979; Durham P.J.K., 1979; Holmes G.H., 1979; Middleton P., 1978; Theodoridis A., Prozesky L., Els H.J., 1979) о том, что репликация ротавируса ограничивается энтероцитами тонкого отдела кишечника. Другие исследователи (Berg L.A., 1981; Schirrmeier Н., Heinrich H.-W., 1981) указывают и на поражение толстого кишечника.
Патоморфологические изменения, наблюдаемые при спонтанной и экспериментальной ротавирусной инфекции, характеризуются вакуолизацией энтероцитов с последующей их десквамацией и замещением цилиндрических эпителиальных клеток на кубические или плоские а также прогрессирующей атрофией ворсинок (Bachmann Р.А., Mayr А. 1979; Durham P.J.K., 1979; Johannsen U., 1983; Landsverk Т., 1981; Nultu M.S., 1978; Theil K.W., Bohe E.H., Cross R.F., 1978; Truszczynski M., Lis H., 1981).
На ранних стадиях инфекции в энтероцитах выявляли неполные и полные частицы ротавируса (Landsverk Т., 1981). Размножение вируса в энтероцитах заканчивается в пределах 18 часов, и вскоре после начала диареи он не обнаруживается в клетках (Dubourguier Н.С., Mandard О., Contrepois М., Gouct Р., 1982).
Повреждая эпителий кишечника, ротавирусы тем самым создают благоприятные условия для размножения в нём E.coli, сальмонелл, стрептококков, которые задерживают регенерацию эпителия и могут проникать в кровь, усугубляя тяжесть течения болезни (Nultu M.S., 1978; Mebus С.А., 1977; Theil K.W., Bohe E.H., Cross R.F., 1978; Jahnecke S., Strauss H., Lindner A., Ropke M., Banholzer E., Bekendorf Т., 2002). Эти изменения в кишечнике обусловливают нарушение пищеварения, всасывания питательных веществ, нарушение баланса электролитов, обезвоживание и ацидотическое состояние организма, часто приводящее к гибели телят (Bachmann P.A., Mayr A. 1979; Nultu M.S., 1978; Middleton P., 1978; Theil K.W., Bohe E.R, Cross R.F., 1978).
Изготовление и контроль вакцины инактивированнои противрота-коронавирусных энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота
Пробы сывороток крови, молозива и молока от контрольных и опытных животных исследовали на наличие антител к вирусу ВД-БС в реакции нейтрализации (РН), к ротавирусу - в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и к коронавирусу - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Перед исследованием сыворотки крови, молозива и молока для освобождения от термолабильных ингибиторов прогревали в водяной бане при температуре 56С в течение 30 минут.
Реакция нейтрализации Реакцию ставили методом двукратного разведения сывороток и постоянной дозой вируса ВД-БС (400 ТЦД 50/мл). Для этого к двукратно возрастающим разведениям сыворотки добавляли равные объёмы вирусной суспензии и полученные смеси выдерживали в термостате 1 час при температуре 37С, после чего их вносили в пробирки с культурой клеток. На каждое разведение сыворотки использовали 4 пробирки с клеточной культурой. Учёт реакции проводили на 3 — 4 день после появления ЦПД вируса в контрольной пробирке, содержащей рабочую дозу вируса. За титр антител принимали предельное разведение сывороток, которое нейтрализовало действие вируса.
Реакция торможения гемагглютинации. Реакцию ставили в лунках с U-образным дном пластиковой панели методом двукратного разведения сывороток на ФБСР (фосфатно-буферном солевом растворе). После этого во все лунки панели вносили равные объёмы рабочего разведения (4 АЕ) коронавирусного антигена. После часового контакта сыворотки с антигеном во все лунки панели добавляли 0,5% суспензию эритроцитов белых мышей.реакцию учитывали через 60 минут. За титр сыворотки принимали ниабольшее её разведение, которое тормозило агглютинацию эритроцитов коронавирусным антигеном не менее, чем на ++.
Контролем реакции служил результат взаимодействия специфической и контрольной сывороток с коронавирусным антигеном, для чего сыворотки титровали как полевые. Сыворотку считали положительной, если её титр был 1:32 и выше.
Иммуноферментный анализ. Реакцию ставили на полистироловом планшете с плоским дном методом последовательных двукратных разведений сыворотки. Во все лунки планшета предварительно (за сутки до постановки реакции) вносили ротавирусный антиген. Пробы нативных сывороток разводили ФБСР в соотношении 1 : 50. Затем после промывания буфером во все лунки планшета вносили по ОД мл ФБСР с твином. Далее в первые лунки каждого длинного ряда вносили по 0,1 мл испытуемых сывороток и в тех же объёмах - сыворотку отрицательную и иммуноглобулин специфический, которые служили отрицательным и положительным контролями. Титровали, получая последовательные, двукратные разведения. Оттитрованные сыворотки помещали на 1,5 часа в термостат, потом отмывали четырежды буфером с твином и вносили в каждую лунку по 0,1 мл антивидового коньюгата в рабочем разведении и опять помещали в термостат на 1,5 часа. Затем планшет отмывали твин-буфером 4-5 раз и в каждую лунку вносили по ОД мл предварительно подготовленной субстратной смеси 5-аминосалициловой кислоты с перекисью водорода. Реакцию учитывали визуально через 40 - 60 мин. по окраске реакционного продукта от тёмно-коричневого до светло-коричневого цвета. В отрицательном контроле раствор оставался прозрачным.
При вирусологических исследованиях для обнаружения вышеуказанных антигенов в патматериале использовали метод ИФА и вирусовьгделение в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией выделенного цитопатогенного агента в перекрёстной РН или в ИФА.
Титрование вирусов проводили по общепринятому методу (В.Н. Сюрин, 1966).
уровень антител у вакцинированных коров к ВД-БС в сыворотке крови и молозиве
В СПК «Свобода» в опытной группе средный титр антител на ВД- БС у коров перед отёлом составил 5,6± 0,15 logz (р 0, 001). Этот показатель превысил предвакцинальные титры антител на 0,5 log2 (р 0, 01), а контрольные перед отёлом на 0,8 1о& (р 0, 025). Титры секреторных антител молозива в опыте и контроле практически не различались (разность составила лишь 0,5 log2 (р 0,2).
У опытной группы из СПК «Пролетарий» прирост поствакцинальных гуморальных антител у коров к ВД-БС был ещё ниже - 0,4 1о& (р 0,1), и составил к моменту отёла 5,8±0Д log2 (р 0, 001). Этот показатель был выше контрольного на 1,8 log2 (р 0, 001). Молозивные титры антител у иммунизированных коров в том же хозяйстве равнялись б,8± 0,1 log2 (р 0, 001). Это значение было выше аналогичного контрольного на 1,4 log2 (р 0, 001).
В следующей опытной группе (СПК «Авангард») титры гуморальных антител после иммунизации стельных коров возросли на 1,1 Iog2 (р 0,2) в сравнении с исходными и составили ко времени родов 5,2± 0,01 log2 (р 0, 001).. У контрольных животных тот же показатель перед отёлом равнялся 4,7±0Д log2 (р 0, 001). Таким образом, разность в титрах гуморальных антител между опытными и контрольными животными в СПК «Авангард» составила 0,5 log2 (р 0,1), а в титрах секреторных (молозивных) антител - 0,4 log2 (р 0,2), то есть, была в обоих случаях совершенно незначительной (см. табл. 7 и диаграммы 5 и 6).
В среднем, по трём опытным группам подъём титров AT к ВД-БС был равен 0,7 log2 (р 0, 01). Разность в титрах антител перед отёлом между контрольными и опытными группами коров составила 1 log2 (р 0, 005). Приблизительно та же разность между молозивными титрами равнялась 0,8 log2 (р 0, 025).
Результаты изучения динамики колостральных антител у телят представлены в таблице 8 и в графике 1.
В СПК «Свобода» у всех телят до приёма молозива антитела на ротавирус в сыворотке крови отсутствовали. Через сутки после первого приёма молозива уровень антител у телят в опытной группе составил 7,2±0,2 log2 (р 0, 001), что на 2,9 log2 превышало аналогичные показатели в контрольной группе телят (р 0, 001). Максимальных значений сывороточные титры антител после выпойки молозива от вакцинированных коров достигли к концу первой недели жизни телят и составили 9,14±0,32 1о& (р 0, 001), превышая аналогичные показатели в контрольной группе на 3,91 log2 (р 0, 001). Начиная с 14 дня жизни, у подопытых телят наблюдалось постепенное снижение титров сывороточных антител, и в трёхнедельном возрасте этот показатель составил 7,1 ±0,4 log2 (р 0, 001), оставаясь приблизительно на том же уровне до конца срока наблюдения (см. график). Аналогичную динамику колострального иммунитета наблюдали и в контрольной группе телят. Таким образом, из приведённых данных следует, что в СПК «Свобода» титры антител у телят изменялись почти синхронно, а их опытные значения достоверно отличались от контрольных, стабильно превышая последние в течение всего опыта, в среднем, на 2,9 log2(p 0, 001).
В СПК «Пролетарий» у телят от вакцинированных коров титры антител к ротавирусу через сутки после первого приёма молозива составили 7,9±0,33 log2 (р 0, 001), что на 1,1 logi (р 0,025) больше, чем в контрольной группе. К концу первой недели жизни (на 7 день) титры антител у телят достигли максимальных отметок (см. график) и были равны 8,6 ±0,3 log2 (р 0, 001), что на 0,7 logs (р 0,1) превышало таковые показатели в контрольной группе животных, В 2-недельном возрасте титры антител у телят в опытной группе равнялись 7,83 ±0,26 loga (р 0, 001), - разность с контрольными телятами составила 3,03 log2 (р 0, 005). К 21 дню жизни титры антител немного уменьшились и стали равны в опыте 7,6±0,21 log2 (р 0, 001), различаясь с контрольными на 1 log2 (р 0, 001). К возрасту 1 мес. опытные показатели оказались ниже контрольных, на 3,24 log2 (р 0, 025) и составили 3, 14±0,98 log2 (р 0, 01), а к 2 мес. практически выравнялись - 7,82±0,16 loga (р 0, 001) и 7,9±0,1б log2 (р 0, 001) соответственно (см. таблицу 8).
В третьей опытной группе телят (СПК «Авангард») на первый день жизни животных титры антител к ротавирусу составили 8,1 ±0,16 log2 (р 0, 001), превышая контрольные на 3,44 log2 (р 0, 001). На 7-ой день она были равны уже 9,3±0,24 log2 (р 0, 001) в опыте и 6,4±0,22 1о& (р 0, 001) в контроле. В возрасте 2, 3 недель, а также в 1 мес. разность в титрах антител была незначительной и нигде не превысила 1 log2 (р 0, 2). К 2 мес. гуморальные титры у телят составили 5,2±0,85 log2 в опыте QxO, 001) и 2,4±0,67 log2 в контроле (р 0, 01). Разность - 2,8 1о& (р 0,025).
Анализируя данные, полученные по всем трём хозяйствам, можно отметить, что у всех телят опытных и контрольных групп до приёма молозива антитела к ротавирусам в крови отсутствовали. К концу первой недели жизни животных они достигали максимальных значений, а через 1 мес. наблюдалось незначительное снижение титров антител в обеих группах телят. Затем, к 2 мес. возрасту титр гуморальных антител повышался в опытной и понижался в контролльной группах животных (см. график 1). Закономерным было и то, что во всех случаях (за исключением титра антител в возр.1 мес.) значения опытных показателей титров антител против ротавируса достоверно превышали контрольные (р 0,001- 0,01).
