Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Распространение гриппа птиц в мире 11
Характеристика вируса гриппа птиц 15
Классификация вируса ГП 15
Молекулярная структура генома и организация основных белков при репликации вирусов
Химический состав и устойчивость к действию физико-химических факторов
Источники и пути передачи вируса гриппа птиц 20
Клинические признаки и патологоанатомические изменения при гриппе птиц
Лабораторная диагностика гриппа птиц 25
Специфическая профилактика гриппа птиц 27
Основные принципы конструирования и контроля эмульсионных противогриппозных вакцин
Культивирование вируса гриппа птиц 36
Инактивация вируса и принципы действия инактивантов 37
Очистка и концентрирование вируссодержащего сырья 40
Применение адъювантов в производстве инактивированных вакцин 42 Механизм действия масляных адъювантов 46
Подбор адыованта и физические свойства вакцин на основе масляных адъювантов
Механизм иммунного ответа у птиц и местные тканевые реакции при использовании эмульсионных вакцин
Заключение по обзору литературы 53
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
2.1 Материалы и методы 56
Материалы 56
Методы 59
2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 69
2.2.1 Подбор штаммов вируса ГП для изготовления экспериментальных
вакцин против гриппа птиц
Изучение некоторых биологических свойств штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипов H5N2, H7N2, H7N7, H7N3 и H9N2
Выбор метода очистки и инактивации ВГП 75
Конструирование экспериментальных моновалентных инактивированных эмульсионных вакцин против ГП из штаммов «А/утка/Приморский/01» H5N2, «А/цыпленок/Узбекский/68» H7N2, «А/индюк/Висконсин/66» H9N2
Стабильность эмульсии опытных образцов инактивированных вакцин
против ГП на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG.
Дисперсионность вакцинной эмульсии изготовленной на основе масляного
адъюванта Montanide ISA 70 VG
Антигенная активность и реактогенные свойства экспериментальных
моновалентных образцов вакцин
Кинетика гемагглютинирующей активности антигена вируса ГП при
хранении вакцин в условиях повышенных температур
2.2.4 Испытание различных масляных адъювантов для производства
экспериментальных вакцин против ГП
Физические свойства вакцин на основе различных масляных адъювантов 87
Изучение реактогенности вакцин, изготовленных на основе различных
адъювантов
Дисперсность вакцинных эмульсий, изготовленных на основе различных
масляных адъювантов
Математическое моделирование зависимости уровня антительного ответа от концентраций антигенов гриппа птиц в вакцине из штаммов «А/утка/Приморский/01» H5N2, «А/цыпленок/Узбекский/68»Н7Ш и «А/индюк/Висконсин/66» H9N2
Комиссионные испытания антигенной и протективной активности опытных образцов моновалентных и полиштаммных инактивированных 98 эмульсионных вакцин против ГП
Оценка иммуногенности инактивированной эмульсионной вакцины против
вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N2 в остром опыте
Антигенная активность полиштаммных инактивированных вакцин против
ГП на основе штаммов <<А/утка/Приморский/01», 101
«А/цыпленокУзбекский/68», «А/индюк/Висконсин/66»
Иммуногенность полиштаммных инактивированных вакцин на основе
исследуемых штаммов против высокопатогенного вируса ГП
Иммунный ответ вакцинированных цыплят после контрольного
контактного заражения
Выделение вируса гриппа от привитых цыплят после их контрольного заражения
Продолжительность иммунного ответа у птиц, привитых экспериментальными вакцинами из штаммов «А/утка/Приморский/01», 108 «А/цыпленок/Узбекский/68», «А/индюк/Висконсин/66»
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 113
ВЫВОДЫ 122
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124 ПРИЛОЖЕНИЯ 150
Введение к работе
Актуальность темы: В условиях современного интенсивного промышленного птицеводства возрастает угроза появления особоопасных инфекционных заболеваний, которые приводят к значительным экономическим потерям в результате гибели поголовья, снижения продуктивности, недополучения молодняка, и затрат на проведение противоэпизоотических мероприятий [36, 52, 74, 81].
Анализ эпизоотической ситуации свидетельствует о реальной угрозе широкого распространения гриппа птиц (ГП) на территориях разных государств. По информации Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ) и других организаций, данное заболевание регистрируют во многих странах мира, включая Российскую Федерацию. Поэтому предотвращение распространения возбудителя этой опасной болезни на территории нашей страны является одной из приоритетных задач [4, 6, 13, 40].
Используются различные меры предотвращения, контроля и ликвидации гриппа птиц, которые варьируют в широких пределах от полной ликвидации всего восприимчивого к гриппу поголовья до организаций мероприятий по специфической профилактике. Каждая страна выбрала свои способы борьбы с гриппом и контроля инфекции. Однако, согласно требованиям Санитарного Кодекса наземных животных МЭБ для выполнения торговых международных соглашений и стандартов меры, используемые для предупреждения, контроля и ликвидации гриппа, должны быть дифференцированы в зависимости от патогенности вируса ГП, особенностей местных и международных рынков, путей распространения инфицированных птиц, экономического статуса государства и др. [4, 93, 292].
Распространение в течение последних лет во многих странах мира высокопатогенного вируса гриппа птиц (ВПВГП) H5N1 азиатской линии, высокопатогенного вируса гриппа H7N3 (Канада), а также низкопатогенных вирусов подтипов Н5 (США, Португалия) и Н7 (США, Италия, Англия, Пакистан) требует не только укрепления системы раннего обнаружения возбудителя среди домашней и дикой птицы, но и проведение комплексной вакцинопрофилактики поголовья [24, 82].
В настоящее время единственный способ контроля и предотвращения распространения гриппа птиц на территории РФ - это строгое выполнение ветеринарно-санитарных мероприятий на территории птицеводческих хозяйств закрытого типа, целевая вакцинация домашней птицы в зонах риска и тотальное уничтожение восприимчивого поголовья птицы в местах вспышки.
В мире существует множество вакцин против гриппа птиц из аутологичных или гетерологичных штаммов. К примеру, использование вакцины из аутологичного штамма (H5N1) в РФ в период 2006-2007 гг. для предотвращения распространения ВПГП было успешным. Однако не во всех случаях результат применения такой вакцины был положительным. Так, в Пакистане и в Мексике инактивированные аутологичные вакцины не купировали инфекцию.
Данный тип вакцины, как правило, готовят на основе эпизоотических штаммов, выделенных в момент вспышки. При этом сохраняется потенциальная эпизоотическая опасность в случае не полной инактивации вируса. Использование низкопатогенных штаммов вируса ГП может устранить эту проблему. Кроме того, использование гетерологичных штаммов позволяет проводить мониторинг распространения болезни. На использовании гетерологичной вакцины для профилактики ГП основана «DIVA» стратегия (Differentiating Infected from Vaccinated Animals - Дифференциация инфицированных животных от вакцинированных животных), которая была разработана и применялась в Италии.
Вакцины из гетерологичных штаммов по отношению к циркулирующему штамму отличаются тем, что производственный штамм, используемый в вакцине, представляет собой штамм с гемагглютинином (Н) того же типа, что и у полевого вируса, но имеет гетерологичную нейраминидазу (N). Гомологичный подтип Н, входящий в состав вакцины, обеспечивает защиту птиц от циркулирующего вируса, а анализ антител к N в серологическом тесте позволяет различить вакцинированную птицу от инфицированной [24, 33,82].
В настоящее время ряд компаний предпочитают изготавливать вакцины из гетерологичных подтипов возбудителя ГП. Так, фирма «Merial» представляет инактивированную эмульсионную вакцину Gallimune Flu подтипа H5N9. В Китае фирма Weike Biotechnology успешно выпускает инактивированные эмульсионные вакцины различных подтипов Н5 и Н9. Компания «Intervet» представляет широкий
спектр моновалентных вакцин подтипов H5N2, H7N7 и H9N2 которые прошли успешную апробацию в Юго-Восточной Азии [24].
Отечественная биопромышленность выпускает вакцину из штамма вируса ГП H5N1, гомологичного циркулирующему на территории РФ. Вакцина широко и успешно используется ветеринарной практикой с целью профилактики ГП. Однако, осуществление дифференциации поствакцинальной и постинфекционной реакции на привитом поголовье практически не возможно.
В связи с этим проблема разработки вакцин из гетерологичных подтипов Bill, подбор и изучение соответствующих штаммов как производственных в нашей стране чрезвычайно актуальна. Решение этих вопросов позволит выполнить ряд рекомендаций описанных в "Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам МЭБ" (Глава 2.1.14).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка инактивированных эмульсионных вакцин против ГП из ВГП разных подтипов (Н5, Н7 и Н9), обладающих высокой антигенной активностью при низкой реактогенности, а также изучение их иммунобиологических свойств.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
отработать параметры культивирования различных штаммов вируса гриппа птиц подтипов Н5, Н7 и Н9 в куриных эмбрионах;
оценить возможность использования различных штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 для наработки вирусного сырья;
сконструировать экспериментальные инактивированные эмульсионные вакцины против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 и изучить их иммунобиологические свойства;
испытать различные масляные адъюванты для конструирования вакцин против гриппа птиц из гетерологичных штаммов;
изучить иммуногенную активность и протективную эффективность моно- и полиштаммных инактивированных вакцин против ГП;
определить продолжительность иммунитета у птиц, привитых экспериментальными вакцинами;
Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:
получены данные о биологических свойствах штаммов вируса гриппа птиц типа А с антигенной формулой H5N2, H7N2, H7N7, H7N3 и H9N2 - потенциальных продуцентов инактивированных вакцин;
подобран и обоснован компонентный состав моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных вакцин из изученных штаммов вируса гриппа птиц;
доказана высокая антигенная активность и протективная эффективность инактивированных эмульсионных вакцин против высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.
Практическая значимость. Разработана технология производства и предложены для внедрения в ветеринарную практику препараты для специфической профилактики гриппа птиц, вызываемого высокопатогенными вирусами подтипов Н5, Н7 и Н9.
Результаты научных исследований были использованы при составлении проектов нормативной документации (НД), регламентирующей изготовление, контроль и применение вакцин:
СТО на полиштаммную инактивированную эмульсионную вакцину против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 (СТО 70952707-0052-2009);
Инструкция по применению полипггаммной инактивированной эмульсионной вакцины против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9;
Разработаны и утверждены Генеральным директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» методические рекомендации по поддержанию и хранению посевных и рабочих расплодок производственных штаммов вируса ГП типа А подтипов HI-HI 6.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
биологические свойства исследуемых штаммов вируса гриппа птиц;
результаты изучения антигенной и иммуногенной активности экспериментальных моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных образцов вакцин против высокопатогенного гриппа птиц;
зависимость уровня антительного ответа от концентраций антигенов гриппа птиц в вакцине из штаммов «А/утка/Приморский/01» (H5N2), «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2).
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц» (Санкт — Петербург, 2008) ВНИВИП, «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008) 48 Центральный НИИ Минобороны РФ.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 4 работы из числа включенных в ведущие рецензируемые научные журналы и издания, определенные ВАК РФ.
Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВГНКИ» и ОАО «Покровский завод биопрепаратов» кандидаты ветеринарных наукЮ.В. Зуев, Т.В. Руденко, Д.А. Лозовой, Д.С. Сурнев, В.В. Ельников, Г.В. Батченко, за что автор выражает им искреннюю благодарность за оказанную помощь.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 293 источников, в том числе 95 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 21 рисунками и дополнена приложением документов.
