Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1 Строение целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов 11
2. Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы 30
Заключение к Главе 1 48
Глава 2. Методы исследования 50
2.1. Определение гранулометрического состава образцов растительного сырья и морфологии частиц 50
2.2. Характеристика удельной поверхности образцов целлюлозы 52
2.3. Методы определения степени кристалличности целлюлозы 57
2.4. Термический анализ 61
2.5. Определение химического состава растительного сырья 62
2.6. Предварительная химическая обработка растительного сырья 64
2.7. Механическая обработка целлюлозы и лигноцеллюлозы 65
2.8. Ферментативный гидролиз целлюлозы 68
Глава 3. Предварительная механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы 71
1 Измельчение лигноцеллюлозных материалов 72
2 Механизм влияния ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их прочность при измельчении 81
3 Влияние предварительной механической обработки на процесс гидролиза целлюлозы 88
Заключение к главе 3 92
Глава 4 Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы при воздействии на реагенты в процессе гидролиза 94
1 Активация ферментативного гидролиза сульфатной целлюлозы при воздействии на реагенты в процессе реакции гидролиза 97
2 Механизм влияния ультразвука на процесс ферментативного гидролиза целлюлозы 100
3 Дискретная и непрерывная предварительная ультразвуковая активация ферментативного гидролиза 109
Заключение к главе 4 113
Глава 5. Механическая активация ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов 116
1 Фрагментация лигноцеллюлозных растительных материалов при их механической обработке 117
2 Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы соломы пшеницы и кукурузы 130
3 Механическая активация ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных волокон масличной пальмы Elaeis guineensis 136
Заключение к главе 5 141
6. Основные результаты и выводы 145
Список цитируемой литературы 149
- Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы
- Определение химического состава растительного сырья
- Влияние предварительной механической обработки на процесс гидролиза целлюлозы
- Дискретная и непрерывная предварительная ультразвуковая активация ферментативного гидролиза
Введение к работе
Актуальность темы исследований. Данная работа посвящена изучению процессов механической активации гетерогенной реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Активация твердофазных реагентов и исследование механизма процессов активации является одной из важнейших областей исследования химии твердого тела. Система целлюлоза - водный раствор ферментов является гетерофазной системой, и потому изучение механизма гетерогенной реакции ферментативного гидролиза целлюлозы, также как и изучение механизмов активации этого процесса являются задачей химии твердого тела.
Кроме производства бумаги лигноцеллюлозные материалы используют для получения различных продуктов: эфиров целлюлозы, этанола, глюкозы, ксилозы, фурфурола, многоатомных спиртов и других органических соединений. Древесную и растительную дисперсию с мелким размером частиц используют для изготовления биопластиков, строительных смесей и топливных гранул, кормовых добавок и удобрений. Из растительного сырья также выделяют экстрактивные вещества и используют их для получения биологически-активных добавок и лекарственных препаратов. Интенсификация процессов переработки лигноцеллюлозных материалов является актуальной задачей, так как позволяет использовать возобновляемые ресурсы биомассы максимально эффективно.
Для получения различных органических веществ из биомассы используют каталитические процессы. Ферментативный гидролиз полисахаридов растительного сырья по сравнению с традиционной технологией, основанной на реакции гидролиза в разбавленных растворах минеральных кислот, обладает существенными преимуществами, например, более мягкими условиями протекания реакции и отсутствием побочных химических процессов. Технологии переработки твердых отходов растительного сырья на основе биохимических процессов являются экологически безопасными и позволяют уменьшить количество производственных отходов. Поэтому исследование механизма ферментативного гидролиза твердых целлюлозных субстратов и активация этого процесса является актуальной задачей.
Цель работы - исследование процессов механической активации ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов и изучение механизма этих процессов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- изучение процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов;
- исследование влияния предварительной ультразвуковой обработки
на процесс ферментативного гидролиза целлюлозы;
- исследование влияния периодической механической обработки лигно-
целлюлозных субстратов (соломы пшеницы и кукурузы, лигноцеллюлозы
масличной пальмы) на процесс их ферментативного гидролиза.
Научная новизна. Впервые обнаружено, что предварительная ферментативная обработка лигноцеллюлозных материалов уменьшает их прочность при измельчении. Предложен механизм данного процесса.
Впервые обнаружено, что предварительная ультразвуковая (УЗ) обработка твердого целлюлозного субстрата в растворе фермента при 0С в 1,5-2 раза увеличивает скорость последующей ферментативной реакции целлюлозы при 50С.
Непрерывная обработка ультразвуком системы субстрат - фермент менее эффективна, чем изодозная дискретная обработка. На основании полученных данных предложен механизм процесса ультразвуковой активации ферментативного гидролиза целлюлозы.
Практическая значимость полученных результатов.
С использованием данных, изложенных в диссертации, получено три патента.
Результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов могут быть использованы для разработки экологически безопасного способа тонкого измельчения растительного сырья. Данный способ может применяться в процессе производства кормов, извлечения биологически активных веществ из растительного сырья и получения древесной муки и позволяет в 2-4 раза увеличить эффективность измельчения лигно-целлюлозного материала при одинаковых затратах энергии.
Предварительная ультразвуковая обработка позволяет в 2-3 раза увеличить скорость последующей ферментативной реакции и может быть использована как метод активации ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных субстратов.
Периодическая механическая обработка лигноцеллюлозных субстратов позволяет увеличить степень конверсии целлюлозы в растворимые углеводы до 70% и может быть использована для разработки метода получения биоэтанола второго поколения.
На защиту выносятся:
результаты исследования влияния предварительной ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их последующее измельчение и механизм этого влияния.
результаты исследования влияния предварительной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при 0С на ее последующий гидролиз;
способ дискретной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при 0С как метод активации ферментативного гидролиза цел-
люлозы в сравнении с непрерывной обработкой при изодозном воздействии.
Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, обсуждались на научных семинарах и конференциях: XV Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Россия, Екатеринбург, 2005), Международной конференции «Механохимический синтез и спекание» (Новосибирск, 2006), 12 Всероссийской научной конференции студентов физиков и молодых ученых (Новосибирск, 2006), 4 Всероссийской конференции «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2007),
Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), Всероссийской конференции лауреатов фонда имени К.И. Замараева «Современные подходы к проблемам физико-химии и катализа» (Новосибирск, 2007),
Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3 научных статьях, в 3 патентах на изобретение и в 6 работах, опубликованных в сборниках материалов конференций.
Личный вклад соискателя заключается в проведении механической обработки образцов целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов в мельницах и в ультразвуковой установке, проведении химической обработки образцов лигноцеллюлозных материалов, определении их гранулометрического состава, определении химического состава образцов растительного сырья, сорбционной емкости образцов целлюлозы и определении продуктов реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Съемка спектров люминесценции от частиц лигноцеллюлозных материалов и фотографий частиц растительного сырья в люминесцентном свете была проведена при непосредственном участии автора. Автором была проведена подготовка обработанных образцов для их исследования методами дифференциальной сканирующей калориметрии, ИК-спектроскопии и рент-геноструктурного анализа. Обсуждение результатов исследования и написание научных статей проведено совместно с соавторами и научным руководителем. Отдельные эксперименты были проведены д.х.н. Рябчиковой Е.И. (электронная микроскопия, НПО «Вектор»), к.х.н. Королевым К.Г. (высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), д.ф.-м.н. Просано-вым И.Ю. (ИК-спектроскопия).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включаю
щего 201 наименование. Работа изложена на 164 страницах, включая
85 рисунков и 18 таблиц.
Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы
Ферменты, катализирующие гидролиз целлюлозы, относятся к классу гидролаз (классификационный номер КФ 3.2.1.п). С целлюлозным субстратом взаимодействует только часть молекулы белка — активный центр. Активный центр подразделяют на каталитический центр (каталитический домен, КД), функциональные группы которого участвуют в превращении субстрата, и зону связывания субстрата (целлюлозосвязывающий домен, ЦСД), формирующую комплекс фермент - субстрат и ответственную за выбор субстрата, его закрепление и определенную ориентацию каталитического центра относительно субстрата. Выделение в молекулах белка активного центра и разделение на зоны связывания и каталитические центры достаточно условно, так как активные центры ферментов формируются из остатков аминокислот, расположенных далеко друг от друга и сближающихся при образовании трехмерной структуры. К тому же очень часто группы каталитического центра могут быть использованы для связывания субстрата, а зоны связывания могут участвовать в каталитических процессах [28]. Зона связывания молекул целлюлозолитических бактериальных ферментов содержит 100 — 160 аминокислотных остатков, грибных ферментов - 30 - 40 аминокислотных остатков. В целлюлазе семейства I (Т. reesei) зона связывания состоит из 35-40 аминокислотных остатков, имеет структуру клиновидной формы, состоящую из трех коротких тяжей в основании и выраженными гидрофильной и гидрофобной плоскостями [29]. На одной плоскости находится четыре ароматических остатка тирозина или триптофана, которые участвуют в связывании с целлюлозой. Некоторые бактериальные целлюлозы могут иметь два ЦСД. Размер ЦСД грибных целлюлаз - 3-3-45 нм. Размеры каталитического домена, в частности, эндоглюканазы (Т. fusca) - 5.3 -3,8-3,6 нм. Размеры одной целлюлозной цепи в микрофибрилле оценивают приблизительно в 0,6 - 1 нм. Целлюлазы связываются своим ЦСД с несколькими молекулами целлюлозы, и каталитический домен располагается вблизи большого количества участков целлюлозы, поэтому гидролизу подвергается большое количество гликозидных связей [30].
Хорошо известно, что удаление ЦСД незначительно влияет на активность целлюлаз по отношению к растворимым субстратам, тогда как связывание и активность ферментов по отношению к нерастворимым в воде целлюлозным субстратам явно уменьшается. Предполагается, что ЦСД увеличивает активность целлюлаз благодаря тому, что увеличивает концентрацию фермента у поверхности субстрата [29]. Каталитический центр и зону связыванию соединяют линкерные последовательности с высоким содержанием пролина, серина и треонина, глицина и аланина. Их длина колеблется в диапазоне 20 — 50 аминокислотных остатков. Функция этих последовательностей - пространственное разделение доменов, которое обеспечивает их автономное функционирование на поверхности субстрата. Целлюлозолитические ферменты можно классифицировать по различным признакам: по типу расщепляемой связи, по молекулярному механизму реакции, по аминокислотной последовательности, по гомологии гидрофобных кластеров. По типу расщепляемой связи целлюлозолитические ферменты можно разделить на три группы: 1) 1,4-р-глюкан-глюканогидролаза (КФ 3.2.1.4); тип расщепляемой связи (Gln)n- р-1,4-(Gln)n, тривиальное название - целлюлаза, эндоглюканаза, 2) 1,4- р - глюкан-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.74); тип расщепляемой связи Gin- р-l,4-(Gln)n, тривиальное название - экзоглюкозидазы; 3)1,4- р - глюкан - целлобиогидролаза, КФ 3.2.1.91; тип расщепляемой связи (Gln)n- P-l,4-(Gln)2, тривиальное название экзоцеллобиогидролазы. Другой способ классификации ферментов - по гомологии в аминокислотной последовательности. Все белки, имеющие схожие последовательности аминокислот имеют похожую пространственную структуру. Классификация белков по структуре включает отдельные классификации по КД и по ЦСД. Белки с похожей аминокислотной последовательностью в доменах объединяют в семейства. По строению КД вьщеляют около ПО семейств ферментов, которые обозначают арабскими цифрами или латинскими буквами от А до L. В семействах КД вьщеляют подсемейства, которые обозначают римскими цифрами при основной цифре или букве. По строению ЦСД вьщеляют не менее 13 семейств, которые обозначают римскими цифрами и подсемейства, обозначаемые строчными латинскими буквами (ШЬ означает семейство III, подсемейство Ь). КД ферментов, имеющих отношение к деградации целлюлозы, сгруппированы в 15 семействах: 5/А, 6/В, 7/С, 8/D, 9/Е, 10/F, 11/G, 12/Н, 26/1, 44/J, 45/К, 48/L, 51, 60, 61 [31]. Третий способ классификации ферментов - классификация по гомологии четвертичной структуры белков. Молекулы белка состоят из определенной последовательности аминокислот, которые уложены в Р-складки (изображают стрелками или плоскими лентами) или а -спирали (изображены в виде цилиндров или спиралей), рис. 1.23. Очень часто белки имеют уникальную пространственную укладку характерную только для одного семейства белков. Но существуют типы укладки белковых глобул, которые встречаются у белков из разных семейств [33]. Принцип структурной классификации - одинаковое расположение в пространстве а - спиралей и Р - складок. Домены белков можно отнести к четырем основным типам: allot, all-p, а+р и a/p. Белки группы all-a состоят только из a - спиралей, Белки all—Р состоят из р - складок, группы а+Р и а/р содежат и а - спирали и Р - складки, но отличаются тем, что в а/р структурах спирали и складки чередуются, а структуры а+Р содержат или преимущественно спирали или преимущественно складки [34].
По типу укладки и локализации функциональных групп ферменты разных семейств объединяются в надсемейства или кланы. Среди КД ферментов, участвующих в деградации целлюлозы встречаются следующие виды укладки [32]: 1) Укладка похожая на известную структуру фермента триозофосфатизомеразы, так называемая ТИМ-бочка или (р/а)8-бочка, рис. 1.24. В этой структуре внутренняя часть «бочонка» состоит из 8 параллельных р - складок, внешняя оболочка состоит из 8 а спиралей, ориентированных под углом к оси «бочонка». Данная структура встречается в семействах 5/А, 6/В, 10/F, 26/1, 51. 2) Топология (а, а)6-бочки встречается у семейств 8/D, 9/Е, 48/L. 3) Ферменты семейств 11/G и 12/Н имеют топологию укладки КД по типу «грудной клетки». 4) Укладка ферментов семейств 7/С характеризуется как В-сэндвич типа конканавалина А. 5) Укладка семейства 45/К - 6-Р-бочка. В табл. 1.2 приведена классификация ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса, выделяемого из микроскопических грибов Trichoderma reesei [32]. Название гликозилгидролаз, общепринятое в настоящее время, включает трехбуквенное обозначение основного субстрата (Cel - целлюлаза, Хул - ксиланаза, Man -манназа и т. д.), и номер семейства к которому относится каталитический домен, позволяющий определить характер действия фермента при гидролизе гликозидной связи.
Определение химического состава растительного сырья
Определение содержания экстрактивных веществ, растворимых в органических растворителях проводили по методике, представленной в монографии [177]. При определении веществ, растворимых в органических растворителях можно использовать один растворитель или смесь растворителей или ряд растворителей последовательно. В зависимости от применяемых растворителей и условий экстракции состав и количество извлеченных веществ будет отличаться. Полностью извлечь эти вещества не удается. Смеси растворителей более эффективны, чем индивидуальные растворители. Наилучшим растворителем считается смесь этанол: толуол 1: 1 или 1: 2. Методика эксперимента. В качестве органического растворителя была выбрана смесь этонол - толуол (1:1). Поскольку толуол хорошо растворяет жиры, но плохо смачивает сырье, поэтому обычно толуол применяют в смеси с этанолом. Экстракцию проводили в течение 4 часов на водяной бане в аппарате Сокслета с обратным холодильником. Навеску воздушно-сухого растительного сырья 2 — 5 г помещали в насадку для экстрагирования. В колбу наливали 150 мл растворителя. Температуру бани регулировали таким образом, чтобы слив через сифонную трубку аппарата происходил через каждые 10 мин. После экстракции навеску растительного сырья сушили сначала на воздухе, затем в сушильном шкафу при температуре ПО С в течение 1-2 часов до постоянной массы. Массовую долю экстрактивных веществ в навеске растительного сырья рассчитывали по убыли массы навески. Определение содержания целлюлозы в растительном сырье Определение содержания целлюлозы в растительном сырье проводили по методике из монографии А. И. Ермакова [178]. Для количественного определения целлюлозы навеску воздушно-сухого растительного сырья кипятили в смеси азотной и уксусной кислот.
В процессе выделения целлюлозы из сырья, происходит кислотный гидролиз гемицеллюлоз, окисление и нитрование лигнинов, и растворение их в спиртовой щелочи. В процессе выделения целлюлозы, возможно протекание реакций гидролиза целлюлозы в аморфных участках, что занижает полученные результаты. Обработка азотной кислотой приводит к частичному нитрованию целлюлозы, что завышает полученные результаты. Методика эксперимента Навеску растительного сырья (1 г) помещали в круглодонную колбу в смесь концентрированной азотной кислоты и 80 % уксусной кислоты (1:10) и кипятили с обратным холодильником на песчаной бане, в течение 1 часа. После кипячения раствор кислот отделяли от твердого остатка на центрифуге (8500 об/мин, в течение 15 мин). Твердый остаток отмьшали от кислоты и продуктов гидролиза горячей дистиллированной водой. Остаток промывают 0,2 М раствором спиртовой щелочи для растворения и удаления лигнинов, и снова горячей дистиллированной водой. После промывания, целлюлозу высушивали сначала на воздухе, затем в сушильном шкафу при температуре 110 С до постоянной массы. Определение содержания гемицеллюлоз в растительном сырье Определение легкогидролизуемых полисахаридов (гемицеллюлоз) проводили по методике, изложенной в монографии Оболенской [176]. Для этого навеску воздушно — сухого растительного сырья 5 г помещали в круглодонную колбу вместимостью 500 мл, добавляли 200 мл 2 % раствора соляной кислоты и кипятили на песчаной бане с обратным холодильником, при слабом кипении. Для регулирования кипения колбу приподнимали над баней. В растворе соляной кислоты гемицеллюлозы, содержащиеся в растительном сырье, подвергаются кислотному гидролизу и при последующем промывании осадка удаляются из растительного сырья. Также гидролизу могут подвергаться молекулы целлюлозы в аморфных участках. При кипячении в кислой среде возможны реакции окисления и конденсации лигнинов, а также частичное их растворение. Кипячение в соляной кислоте проводят в течение 3 часов. Затем твердый остаток отделяли от раствора кислоты на центрифуге (8500 об/мин, в течение 15 мин), промывали горячей дистиллированной водой от кислоты и продуктов гидролиза. Фильтрат использовали для определения содержания растворимых углеводов в растворе кислоты методом ВЭЖХ и расчета содержания пентозанов и гексозанов в растительном сырье. Содержание легкогидролизуемых углеводов определяли также по убыли массы навески растительного сырья. Ферментативную обработку образцов древесной и растительной дисперсии проводили следующим образом: воздушно-сухой субстрат смешивали с раствором целлюлозолитических ферментов Целлюлюкс — А или Целловиридин (рН 4,7, ацетатный буфер) и выдерживали в сушильном шкафу, при температуре 50 С в течение 20 - 24 часов. Содержание ферментов в растворе составляло 0,1 % по массе. Гидромодуль смеси составлял от 2 до 5. После этого субстрат высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем в сушильном шкафу при температуре 110 С в течение двух часов. Обработка 2 % раствором соляной кислоты Обработку сырья 2 % раствором соляной кислоты проводили также как и при определении содержания легкогидролизуемых полисахаридов в растительном сырье, по методике, изложенной выше. Обработка раствором карбоната натрия 10 — 15 г лигноцеллюлозного материала смешивали с 2 % раствором карбоната натрия, при соотношении массы вещества к массе раствора 1:5. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 24 часов в закрытой емкости, затем промывали дистиллированной водой и сушили сначала на воздухе, затем в сушильном шкафу при температуре 110 С в течение 2 часов. Образцы растительного сырья измельчали в мельницах: 8255 Nossen, (VEB Maschinen Anlagenbau Nossen, Германия), с двигателем, мощностью 2,2 кВт; Fritsch Pulverisette 5 (Fritsch, Германия), с агатовыми барабанами и шарами, с двигателем, мощностью 1,5 кВт; АПФ - 4 (ИХТТМ СО РАН г. Новосибирск), с металлическими шарами и барабанами, 7,5 кВт; вихревая мельница ВИТ (Институт теплофизики СО РАН, г. Новосибирск) с производительностью на растительном сырье до 50 кг/ч; дезинтегратор IA 28 (СКТБ «Дезинтегратор», г. Таллинн), 2,35 кВт. Ультразвуковая обработка целлюлозы Ультразвуковую обработку целлюлозы проводили в ультразвуковой установке Sonorex RK 100 Н 35(«Bandelin», Германия), с частотой колебаний 35 кГц, в стеклянном реакторе.
Обработку целлюлозы проводили в трех режимах. 1) Непрерывный режим обработки, в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы, при 50 С. 25 мл раствора целлюлазных ферментов (Целловиридин Г20 X) 0,5 г/л в ацетатном буфере рН 4.7, помещали в термостатируемую ультразвуковую ванну с температурой воды 50 С и выдерживали в течение 10 минут. После того как раствор нагреется, в него помещали навеску сульфатной целлюлозы в виде спрессованной отливки массой 0,5 г. После этого включали ультразвуковую установку. Через 1, 2, 3, 4 часа проводили определение степени превращения целлюлозы в растворимые углеводы. Температуру воды в ультразвуковой установке поддерживали около 50 ± 5 С. 2) Предварительная обработка ультразвуком системы фермент - субстрат при 0 С. Предварительную ультразвуковую обработку целлюлозы проводили в ультразвуковой ванне со льдом, в течение 5, 15, 30 и 60 минут. Навеску сульфатной целлюлозы помещали в 25 мл ферментного раствора в ацетатном буфере (с концентрацией фермента 0,5 г/л, рН 4,7). После обработки ультразвуком в растворе определяли концентрацию восстанавливающих углеводов, добавляли еще 25 мл раствора фермента той же концентрации и проводили реакцию гидролиза при 50 С в термостатируемом реакторе. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке. 3) Ступенчатая обработка ультразвуком системы фермент - субстрат при 0 С. Ступенчатая ультразвуковая обработка заключалась в чередовании стадий обработки целлюлозного субстрата в ультразвуковой ванне при 0 С и стадии
Влияние предварительной механической обработки на процесс гидролиза целлюлозы
Проведению ферментативного гидролиза целлюлозы до глубоких степеней превращения субстрата препятствует его фибриллярная структура и кристалличность. Степень превращения целлюлозы в растворимые углеводы (фильтровальная бумага) в процессе ферментативного гидролиза не превышает 15 — 20 %, рис. 3.9. Уменьшение скорости ферментативной конверсии целлюлозы при небольших значениях степени гидролиза целлюлозы может быть обусловлено несколькими причинами. Одна из причин - уменьшение активности ферментов в процессе гидролиза. Ферменты это катализаторы белковой природы, которые могут денатурировать при нагревании и при перемешивании раствора. Хотя температура, при которой проводили реакцию гидролиза, 50 С, это оптимальная температура для действия данных ферментов, при нагревании может осуществляться постепенная денатурация белка и уменьшение активности ферментов. Чтобы уменьшить влияние этого фактора, в реакционную среду периодически добавляли ферменты в процессе гидролиза. Ферментативный гидролиз целлюлозы — это сложный многостадийный процесс. Для образования глюкозы, необходимо синергетическое действие нескольких ферментов с разной субстратной специфичностью: эндо-ферментов (эндо-глюканаза), которые катализируют гидролиз связей, удаленных от конца цепи, экзо-ферментов (целлобиогидролазы), катализирующих отщепление глюкозы и целлобиозы и ферментов, расщепляющих небольшие фрагменты молекул ф-глюкозидаза). Известно, что молекулы целлобиозы могут ингибировать действие экзо-ферментов. Поэтому накопление в реакционной среде целлобиозы при недостаточном количестве Р-глюканазы в ферментном комплексе может являться причиной уменьшения скорости процесса.
Для уменьшения ингибирования действия ферментов целлобиозой в реакционную среду добавляют Р-глюкозидазу. Добавление этого фермента увеличивал выход глюкозы в 2 - 3 раза [189]. Для того чтобы уменьшить ингибирование ферментов продуктами реакции в реакционную среду добавляли ферментный комплекс Глюколюкс, в состав которого входит р-глюкозидаза. На рис. 3.10 показано, что после остановки процесса гидролиза через 10 часов протекания реакции, дополнительное введение ферментов в реакционную среду приводит к образованию продуктов реакции. Однако после этого процесс снова останавливается, несмотря на дополнительное введение ферментов. Большая часть молекул в фибриллах целлюлозы образует упорядоченные участки (кристаллиты). Поэтому площадь поверхности целлюлозы, которая может участвовать в химической реакции небольшая. В работе [190] показана количественная взаимосвязь между величиной удельной поверхности целлюлозных субстратов и выходом глюкозы. Величина удельной поверхности была определена по адсорбции фермента пероксидазы, размеры которого близки к размерам целлюлазных ферментов. Величина удельной поверхности субстрата, доступной для молекул белка и выход глюкозы увеличивается при его измельчении. Также показана количественная взаимосвязь между значением степени кристалличности и начальной скоростью гидролиза целлюлозы. Поскольку для осуществления химической реакции необходимо образование фермент-субстратного комплекса, большая часть целлюлозного субстрата внутри фибрилл не подвергается гидролизу. Для разупорядочения структуры целлюлозы, ее подвергают механической обработке. На рис. 3.11 показано, что механическая обработка целлюлозы, которую проводили в мельнице Fritsch pulverizette 5 (режим № 10, 15 мин, с добавкой СаСЬ, 5 % по массе) приводит к увеличению степени гидролиза целлюлозы. При механической обработке целлюлозы активация гидролиза осуществляется благодаря разупорядочению кристаллической структуры целлюлозы и увеличению площади поверхности целлюлозного субстрата доступного для молекул белка. Но уже через несколько часов протекания химической реакции, процесс снова замедляется. Уменьшение скорости гидролиза предварительно активированного субстрата связано с расходованием или «выгоранием» разупорядоченных участков в процессе гидролиза, большая часть оставшейся целлюлозы практически не подвергается гидролизу. Кроме того, известно, что при смачивании предварительно размолотой целлюлозы водой снова происходит упорядочение структуры целлюлозы. Уменьшению скорости процесса способствует также накопление в зоне реакции полупродуктов гидролиза, глюкозы и малорастворимых олигосахаридов, при недостаточном перемешивании реакционной среды. Продукты реакции покрывают субстрат и препятствуют доступу воды и молекул ферментов к поверхности субстрата.
На рис. 3.12 показано, что повторная механическая обработка целлюлозного субстрата в процессе гидролиза позволяет увеличить степень превращения целлюлозы в растворимые сахара. При уменьшении скорости ферментативной реакции целлюлозный субстрат извлекали из реакционной среды, промывали от продуктов реакции, высушивали, измельчали, и добавляли раствор фермента. Поскольку лимитирующей стадией процесса ферментативного гидролиза является диффузия макромолекул фермента к поверхности субстрата, чтобы ускорить процесс гидролиза необходимо обеспечить контакт между реагентами. Предварительной механической активации целлюлозного субстрата для этого недостаточно, так как кроме разупорядочения целлюлозного субстрата необходимо осуществить удаление продуктов реакции с поверхности целлюлозы и ускорить перенос молекул ферментов к поверхности субстрата. Заключение к главе 3 В результате проделанных экспериментов было показано, что предварительный ферментативный гидролиз целлюлозы в растительных материалах увеличивает эффективность их последующего измельчения. Этот эффект наблюдали на растительных материалах разного строения и состава и при измельчении на измельчающих аппаратах разного типа. Эффективность измельчения лигноцеллюлозы зависит от типа измельчающего аппарата. Измельчение необработанной соломы пшеницы и кукурузы было более эффективно на дезинтеграторе и струйной мельнице, а после предварительной ферментативной обработки - на шаровых мельницах. Показано, что степень гидролиза целлюлозы в растительных материалах в процессе предварительной обработки незначительная, не превышает 5 %.
Провести ферментативную реакцию гидролиза целлюлозы до глубоких степеней превращения субстрата довольно сложно, так как целлюлоза, содержащаяся в лигноцеллюлозных материалах, практически не подвергается гидролизу без предварительной механической обработки субстрата и без перемешивания реакционной среды. Предварительная обработка лигноцеллюлозных материалов разбавленными растворами кислоты или щелочи также приводит к уменьшению прочности лигноцеллюлозных материалов при измельчении. При обработке растительного сырья раствором кислоты происходит гидролиз гемицеллюлозы и части аморфной целлюлозы, удаление лигнинов, растворимых в кислотах. Обработка раствором щелочи приводит к гидролизу гемицеллюлоз и удалению фракции лигнинов, растворимых в щелочной среде. Методом дифракции рентгеновских лучей показано, что химическая обработка лигноцеллюлозных материалов приводит к увеличению степени кристалличности целлюлозы, что связано с преимущественным гидролизом целлюлозы в аморфных участках. На основании полученных результатов, а также на основании модели структуры лигно-углеводной матрицы был предложен механизм влияния предварительной химической обработки на прочность лигноцеллюлозных материалов при измельчении. Микрофибриллы целлюлозы в растительном сырье покрыты слоем гемицеллюлозы и погружены в аморфный матрикс лигнина. Такое строение обеспечивает устойчивость растительных материалов к большим механическим нагрузкам. Модификация
Дискретная и непрерывная предварительная ультразвуковая активация ферментативного гидролиза
Был исследован процесс дискретной ультразвуковой активации ферментативного гидролиза целлюлозы. Дискретная ультразвуковая активация - чередование стадий предварительной ультразвуковой обработки системы фермент-субстрат при 0 С и стадии ферментативного гидролиза при 50 С более эффективна, чем непрерывная обработка при таком же времени воздействия, рис. 4.12. Этот эффект может быть вызван несколькими причинами. Во-первых, гидролиз гликозидных связей, который проводили между стадиями УЗ-обработки, уменьшает устойчивость структуры целлюлозы к механическому воздействию. Это приводит к большему разупорядочению структуры целлюлозы при дискретной активации, чем при непрерывном воздействии. Во-вторых, как показано, на рис. 4.4 увеличение продолжительности предварительной обработки с 15 минут до 30 не приводит к увеличению скорости реакции гидролиза. Это может быть связано, например тем, что через 10-15 минут обработки вся поверхность целлюлозы покрыта ферментами. Тогда проведение ультразвуковой активации в дискретном режиме более эффективно потому, что во время стадии гидролиза между 15 минутными обработками в результате гидролиза гликозидных связей происходит образование новой поверхности субстрата. Другой механизм ступенчатой активации связан с конформационной активностью ферментов. Влияние ультразвука на химические процессы связано с кавитацией. Этот процесс сопровождается интенсивными ударными волнами, локальным повышением давления до сотен атмосфер и возникновением потоков жидкости с большим градиентом скоростей.
Эти явления увеличивают скорость ферментативных процессов, так как способствуют изменению конфигурации белковых глобул, а, следовательно, ускоряют процессы специфической сорбции ферментов на целлюлозном субстрате. Однако, изменение конформации макромолекул под действием ультразвука приводит также и к постепенному уменьшению активности ферментов. Разрыв связей, стабилизирующих конформацию нативной молекулы, может привести к разрушению адсорбционного или каталитического центра фермента, что повлияет, на сорбционную и каталитическую способность ферментов. Если ультразвуковую обработку проводить дискретно, с определенной скважностью, то в промежутках между обработкой ультразвуком молекула фермента благодаря релаксации может снова принять нативную конформацию. Следовательно, дискретная ультразвуковая обработка будет более эффективна для активации ферментативных процессов, чем непрерывная обработка. Целлюлозолитические ферменты — это глобулярные белки, состоящие из нескольких доменов, включая целлюлозо-связывающий и каталитический домены. Целлюлозосвязывающий домен имеет определенную пространственную структуру. Благодаря определенной конформации адсорбционного центра, молекула белка способна «распознавать» субстрат и образовать фермент-субстратный комплекс, затем осуществляется химическая реакция. В случае изменения третичной структуры белка, при воздействии температуры, давления, изменения рН среды, а также сдвига, фермент теряет свою каталитическую активность. Для определения влияния механического перемешивания раствора фермента на его активность раствор ферментов целлюлазного комплекса Целловиридин в натрий-ацетатном буфере перемешивали со скоростью 400 оборотов в минуту, затем определяли активность ферментов целлюлазного комплекса на фильтровальной бумаге «Ватман № 1», по стандартной методике, изложенной в Главе 2.
Через два часа активность целлюлазпых ферментов уменьшается вдвое, рис. 4.13. Этот процесс обратим, как показано на рис.4.14. Если выдерживать раствор после перемешивания в течение нескольких часов, то активность ферментов восстанавливается практически до исходного значения. Явление деактивации и реактивации ферментов при перемешивании можно объяснить с точки зрения конформационной активности белков: изменение конформации белка при сдвиге приводит к уменьшению его ферментативной активности. Но при снятии нагрузки, происходит релаксация и активность ферментов снова увеличивается. В работе [195] было исследована деактивация экзоглюканазы, эндоглюканазы и 0-глюкозидазы при перемешивании. Целлюлазные ферменты подвергаются деактивации под воздействием сдвига, и степень деактивации увеличивается с увеличением скорости перемешивания. Присутствие субстрата не влияет на деактивацию целлюлаз. Среди трех исследованных ферментом быстрее всех деактивации подвергается экзо-глюконаза. При растяжении полиамидной нити, на которой были иммобилизованы ферменты, ферментативная активность иммобилизованного трипсина уменьшалась в несколько раз. После прекращения растяжения и последующей релаксации активность ферментов восстанавливается [196]. Разрушение слабых межмолекулярных взаимодействий при механическом воздействии на полимер приводит к измененшо конформации ферментов и микроокружения активного центра. Белок может при этом полностью или частично утратить активность. При механическом диспергировании коллагена напряжения вызывают разрыв ковалентных связей и разрушение взаимодействий между молекулами. Это приводит к изменению структуры коллагена и частичной денатурации [197].
Механическое диспергирование субтилизина и трипсина в лабораторной мельнице со стеклянными шарами (интенсивность воздействия 4—10 Вт/г по калориметрическим данным, обработка в течение 1-80 мин) приводило к уменьшению активности ферментов, уменьшения числа активных центров, и уменьшения константы скорости ферментативной реакции [198]. Причиной механической инактивации является не только разрыв ковалентных связей, но и конформационные изменения и необратимая денатурация. Механическое диспергирование вызьшает перемещение отдельных фрагментов полипептида с образованием новых нековалентных взаимодействий и изменения микроокружения активных центров [199]. Влияние ультразвука на химические процессы связано с кавитацией, которая порождает ряд физических и химических явлений в реакционной среде. Захлопывание кавитационных полостей и появление скоростных потоков жидкости приводит к тому, что отдельные сегменты молекулы белка перемещаются относительно центра массы молекулы и таким образом осуществляется перенос молекул ферментов в поле ультразвуковых волн. Это перемещение молекул увеличивает скорость процесса гидролиза, так как молекула белка быстрее оказывается у поверхности субстрата и быстрее образует фермент-субстратный комплекс. Но перемещение сегментов.молекул может привести к агрегации белковых глобул и денатурации белка и уменьшению активности ферментов. При ультразвуковом воздействии на растворы молекул белка, вероятно, происходят подобные процессы изменения конформационной активности белков, следовательно, при дискретной обработке ультразвуком инактивация молекул ферментов будет меньше, чем при непрерывной обработке.
Похожие диссертации на Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов
