Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
-
Пищевые волокна и питание 13
-
Ресурсы растительной биомассы . 15
1.2.1. Состав и источники биомассы 15
1.3. Общая характеристика основных компонентов растительной
биомассы, формирующих пищевые волокна 17
-
Целлюлоза , 18
-
Гемицеллюлозы 21
-
Лигнин 23
Ї.3.3. Пектиновые вещества 25
1.4. Физиологические функции и свойства пищевых волокон 26
-
Водоудерживающая способность 27
-
Ионообменные свойства пищевых волокон 28
-
Пищевые волокна - радиопротекторы 29,
-
Пищевые волокна- пребиотки 30
-
Классификация пищевых волокон 32
-
Источники пищевых волокон 33
-
Методы выделения пищевых волокон 35
1.7.1. Предварительная обработка растительных субстратов 36
-
Биодеградация лигнина 38
-
Ферменты лигнинразрушающей системы 40
-
Лигниназа 41
-
Мп — зависимая пероксидаза 42
-
Лакказа 43
1.10. Применение препаратов пищевых волокон в пищевой
промышленности 45
ГЛАВА П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 53
П. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
II. 1.1. Материалы исследований 53
II.1.2. Подготовка растительных субстратов к биодеструкци 56
ПЛ .3. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза
лигнинразрушающих ферментов S. mersei С-24 56
П. 1.4. Определение влажности, зольности и экстрактивных
веществ растителыіьіх субстратов 57
11.1.5. Определение содержания редуцирующих веществ
в культуральной жидкости S. mersei С-24 58
-
Определение содержания сухих веществ 58
-
Определение выхода абсолютно сухой биомассы 58
II. 1.8. Выращивание культур микроорганизмов в условиях
глубинной ферментации 58
11.1.9. Твердофазное культивирование микроорганизмов 59
П. 1.10. Определение содержания "сырого протеина" и белка в
культуральной жидкости S. mersei С-24
и ферментном препарате 59
II.1Л 1. Определение содержания суммарных липидов в биомассе
культуры S. mersei С-24 60
II. 1.12. Определение рН растворов 61
IIЛ Л 3, Подсчет числа клеток микроорганизмов 61
II. 1.14. Проведение СВЧ-обработки растительного сырья 61
ІІЛ.15. Определение сырой клетчатки 61
П. 1.16. Определение лигнина 62
11.1.17. Определение функциональных свойств пищевых волокон 62
IIЛ Л 8. Определение сорбционной способности концентрата
пищевых волокон целлюлозы по отношению
к различным микроорганизмам 63
ИЛ .19. Определение сорбционной способности концентрата
пищевых волокон целлюлозы
по отношению к тяжелым металлам 63
П. 1.20. Методы определения активностей ферментов,
катализирующих разложение полисахаридов
растительного сырья. 64
НЛ .21. Методы определения ферментов лигниназной системы 65
IIЛ.22. Осаждение ферментов органическими растворителями 66
II. 1.23. Осаждение ферментов солям и 67
II.1.24. Мембранный метод очистки ферментных растворов-диализ 68
II. 1.25. Проведение микробиологического контроля исходного сырья и
готовой продукции 68
II. 1.26. Определение физико-механических характеристик
сосновых опилок и полученного концентрата
пищевых волокон целлюлозы 69
II.1.27. Методика изготовления хлеба 70
II.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 73
П.2.1. Анализ биохимического состава растительного сырья 73
11.2.2. Скрининг продуцентов лигнинразрушающих ферментов,
способных трансформировать растительное сырье 76
11.2.3. Оптимизация состава питательной среды для
S, mersei С-24 методом математического
планирования эксперимента . 82
11.2.4. Изучение способов и условий комплексной обработки
растительного сырья для получения концентрата пищевых волокон
целлюлозы 86
Н.2.4.1. Влияние химической предобработки целлголозосодержащсго
сырья на изменение его фракционного состава 86
П.2.5. Комплексная химико-ферментативная обработка растительного
сырья для получения концентрата пищевых
волокон целлюлозы 96
П.2.5.1. Выращивание культуры S. mersei С-24, обладающей
комплексом лигнинразрушающих ферментов 97
II.2.6. Определение ферментативных активностей культуры
S, mersei С-24 99
Н.2.7. Изучение влияния микроэлементов и стимуляторов на
накопление и активность лигнинразрушающих ферментов
культурой S. mersei С-24 101
11.2.7.1. Изучение влияния стимуляторов роста
биомассы микроорганизмов на накопление и
активность лигнинразрушающих ферментов
культурой S. mersei С-24 101
11.2.7.2. Влияние микроэлементов в составе питательной
среды на накопление и активность лигнинразрушающих
ферментов культурой S. mersei С-24 104
11.2.8. Изучение влияния длительности культивирования
S. mersei С-24 на биосинтез лигнинразрушающих ферментов 107
И.2.9. Осаждение ферментов из культуральной жидкости
S. mersei С-24 110
II.2.9.1. Осаждение ферментов высококонцентрированными
растворами солей (высаливание) 111
П.2.9.2. Осаждение ферментативного комплекса культуры
S. mersei С-24 органическими растворителями 113
Н.2.10. Определение температурного и рН оптимумов действия
лигнинразрушающих ферментов препарата,
полученного осаждением этанолом ] 16
11.2.П. Определение оптимальных условий ферментативной
обработки растительного сырья с целью получения
концентрата пищевых волокон целлюлозы 118
И.2.12. Определение сорбционной способности концентрата
пищевых волокон целлюлозы из нетрадиционного
растительного сырья по отношению к патогенным
и условно-патогенным микроорганизмам 121
11.2.13. Функциональные свойства препаратов пищевых волокон
из сосновых опилок 125
11.2.14. Исследование препаратов пищевых волокон
на способность к деметаллизации 126
П.2.15. Сравнительная характеристика физико-механических свойств
сосновых опилок и полученного концентрата
пищевых волокон целлюлозы 131
П.2.16. Характеристика микробиологических, органолептических,
физико-химических свойств концентрата
пищевых волокон целлюлозы и ферментного
препарата Лигнин аза 137
11.2.17. Изучение возможности применения полученного
концентрата пищевых волокон целлюлозы
в хлебопекарной отрасли 141
ВЫВОДЫ 149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 151
ПРИЛОЖЕНИЯ 175
Введение к работе
Актуальность темы. Наука о питании рассматривает пишу в качестве источника основных пищевых веществ и энергии, необходимых для поддержания метаболических процессов в организме.
Современная структура питания населения России характеризуется недостатком потребления пищевых волокон (ПВ), белка, витаминов и минеральных веществ. Поэтому свыше 60 % населения среднего возраста имеют избыточную массу тела. Неблагоприятное состояние окружающей среды способствует снижению иммунитета и нарушению обмена веществ большинства россиян, приводящих к преждевременному старению и разрушению организма. В связи с этим одной из важнейших проблем и задач современного пищевого производства является создание продуктов, сбалансированных по отдельным ингредиентам, повышающим устойчивость человека к неблагоприятным факторам окружающей среды и позволяющим сохранить здоровье до глубокой старости.
Адекватный рацион питания должен включать разнообразные пищевые и биологически активные вещества. Особенно важна роль в питании человека ПВ, то есть полимерных веществ растительного происхождения (целлюлоза, гемицеллюлозы (ГМЦ), пектиновые вещества, камеди и лигнин), не перевариваемых организмом и предназначенных для нормализации функций желудочно-кишечного тракта (Молотилин Ю. И., Колесников В. А., 2001; Воскобойников В. А., Типисева И. А., 2004; Ильина О. А., 2004 г.).
ПВ не несут в себе незаменимых пищевых веществ, однако их потребление необходимо для поддержания здоровья организма в целом. ПВ уменьшают риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, некоторых форм рака, сахарного диабета.
Пища, богатая ПВ, менее калорийна, содержит мало жира, много витаминов и минеральных веществ. ПВ увеличивают чувство насыщения, способствуют выведению из организма тяжелых металлов, канцерогенов, радионукли- дов, уменьшают всасывание холестерина, положительно влияют на функционирование прямой кишки, снижая риск развития ожирения (Смирнов К. В., 1990; Дудкин М. С, Щелкунов И. Ф., 1998; Лосева В. А., Шахбулатова Л. Н., 2001; Прянишников В. В., 2001; Sandrou D. К., Arvanitoyannis I. S., 2000).
Долгое время ПВ считались ненужным балластом, не представляющим никакой ценности для организма человека. С появлением теории адекватного питания, сформулированной российским физиологом Л. М. У голевым в 80-х г XX века, мнение о балластных веществах стало меняться.
Тенденции к возврату ПВ в рационы питания прослеживаются на примерах новых разнообразных пищевых продуктов, появившихся в последнее время на продовольственном рынке - от хлеба с отрубями до обогащенного растворимыми волокнами молока (Ваулина Н. В. и др., 2000; Донская Г. А., 2001; Нечаев А. П., Кочеткова А. А., Зайцев А. Н., 2001).
По данным статистики, потребление ПВ в развитых странах ниже оптимума, который колеблется в пределах 20-25 г/сут, что определяет необходимость их восполнения. Поэтому составной частью комплексного решения проблемы сбалансированного питания является разработка и реализация технологий получения ПВ и поиски путей их восполнения в пище (Нечаев А. П. и др., 2003). Среди них: введение в ежедневный рацион питания растительной биомассы, содержащей повышенное количество ПВ; производство и использование концентратов пищевых волокон (КПВ), выделяемых преимущественно из вторичных ресурсов переработки зерна и другого сырья; производство новых комплексных продуктов питания, обогащенных ПВ.
Основным источником ПВ являются зерновые продукты, овощи, фрукты, виноград, орехи. Целлюлоза, ГМЦ и лигнин также составляют основную часть клеточных стенок древесины, трав, стеблей злаков, кустарников. ПВ отсутствуют в животной пище - мясе, рыбе, молоке, яйцах (Захарова Л. М. и др., 2000;
Лосева В. А. и др., 2001; Мартинчик А. Н. и др., 2002). Реализация возможности использования нетрадиционного растительного сырья в качестве источника ПВ позволит получить экономически выгодные для промышленности ПВ, а их производство устранит имеющийся недостаток в этом виде ингредиентов пищи. Поэтому создание современных и прогрессивных технологий переработки нетрадиционного растительного сырья, отходов растительного происхождения с целью выделения пищевых и биологически активных веществ может открыть широкие перспективы для получения функциональных продуктов питания (Донская Г. А. ,2001).
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке биотехнологии получения препарата ПВ виде концентрата целлюлозы из нетрадиционного растительного сырья.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: - скрининг высокоактивных штаммов микроорганизмов - продуцентов лиг- нинразрушающих ферментов; - исследование морфологических особенностей и физиологических потребно стей выбранного в результате скрининга микроорганизмов штамма- продуцента с целью создания оптимальных условий биосинтеза лигнинраз- рушающих ферментов; - выявление основных закономерностей биосинтеза лигнинразрушающих ферментов в условиях глубинного и поверхностного культивирования мик роорганизма - продуцента; выбор доступного и дешевого растительного сырья и методов его предварительной обработки для интенсификации энзиматической конверсии лигнина и получения концентрата целлюлозы в форме, доступной для ее дальнейшего использования; разработка технологии микробного лигнинразрушающего ферментного препарата, позволяющего проводить обработку древесных отходов с целью получения концентрата пищевых волокон целлюлозы (КПВЦ); разработка способа комбинированной химической и ферментативной обработки лигноцеллюлозного сырья для получения КПВЦ; исследование сорбционной способности полученного КПВЦ к патогенной и условно-патогенной желудочно-кишечной микрофлоре и тяжелым металлам с позиции возможного его использования в качестве энтеросорбента; изучение наиболее важных функциональных свойств полученного КПВЦ с целью его использования в хлебопекарной промышленности; введение КПВЦ в рецептуру хлеба и исследование его влияния на свойства и качество хлеба.
Научная новизна работы. Впервые экспериментально обоснована возможность использования комбинированной химико-ферментативной обработки непищевого растительного сырья для получения КПВЦ, обладающего высокой сорбционной способностью по отношению к патогенной, условно-патогенной микрофлоре и тяжелым металлам, что обусловило возможность его использования в хлебопечении в рецептурах хлеба для придания ему функциональных свойств.
С этой целью было произведено следующее: разработаны условия и осуществлен скрининг микроорганизмов, способных разрушать биополимеры растительного сырья, на основании которого впервые в качестве продуцента лигнинразрушающих ферментов предложен штамм актиномицета Streptomyces mersei С-24; в результате изучения физиолого-биохимических особенностей продуцента определен оптимальный состав питательной среды для биосинтеза лигниназ; на основании выявленных зависимостей в биосинтезе лигнинразрушающих ферментов S. mersei С-24 впервые разработан способ его интенсификации с введением в питательную среду МпСІ2*4Н20; оптимизированы условия культивирования продуцента S. mersei С-24, выделения и очистки синтезируемых им ферментов, что позволило впервые раз- работать технологию очищенного ферментного препарата лигнинразру-шающего действия на основе культивирования стрептомицета; впервые экспериментально обоснована возможность использования комбинированной химической (щелочной) и микробиологической делигнификации для решения проблемы комплексной переработки растительного сырья с целью получения КПВЦ; исследованы физико-механические свойства КПВЦ, в том числе сорбцион-ная способность КПВЦ из растительного сырья по отношению к патогенной, условно-патогенной микрофлоре кишечника и тяжелым металлам, позволившая обосновать его лечебно-профилактические свойства; впервые установленные зависимости функциональных свойств КПВЦ из растительного сырья от физико-химических факторов пищевой системы позволили дать научное обоснование и рекомендации по его использованию в хлебопекарной промышленности для получения продуктов, обладающих лечебно-профилактическими свойствами; - на основании выявленных зависимостей качественных показателей хлеба от введения в его рецептуру пищевой добавки - КПВЦ определены ее опти мальные дозировки.
Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные исследования явились основой для разработки новой биотехнологии КПВЦ из нетрадиционного растительного сырья.
В результате скрининга микроорганизмов выбран новый продуцент лиг-нинразрушающих ферментов S. mersei С-24. Разработана новая технология получения микробного лигнинразрушающего ферментного препарата и проведена ее апробация в опытно-промышленных условиях ЗАО "МАСТЕРЛЕК".
Разработаны и оптимизированы условия комплексной химической и микробиологической обработки растительного субстрата - сосновых опилок с использованием микроорганизмов и ферментных препаратов микробного происхождения для получения КПВЦ.
Экспериментально обоснована и апробирована в лабораторных условиях технология получения из нетрадиционного растительного сырья порошкообразного КПВЦ. Показана его высокая сорбционная способность по отношению к тяжелым металлам, патогенной и условно-патогенной желудочно-кишечной микрофлоре человека. На основании изучения его функциональных свойств, - водоудерживающей и жиросвязывающей способности, — дано обоснование целесообразности его введения в рецептуры хлеба. В производственных условиях секции хлебных технологий МГУПП проведена апробация способа приготовления хлеба с добавлением КПВЦ, оказывающего нормализующее действие на состав микрофлоры пищеварительного тракта. Изготовлены опытные образцы пшеничного хлеба с 5 и 10 % КПВЦ и проведено их сравнительное исследование и дегустация.
Разработаны ТУ на лигнинразрушающий ферментный препарат Лигни-наза и КПВЦ из сосновых опилок, полученные с использованием методов биотехнологии и ТИ по получению КПВЦ. Получен патент РФ на изобретение № 2251308 "Способ получения пищевых волокон из древесного сырья".
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и Международных конференциях: Всероссийской научно-технической конференции-выставки с международным участием "Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов литания" (Москва, 2002 г.); Международной конференции "Технологии и продукты здорового питания" (Москва, 2003 г.); Международной конференции "Технологии и продукты здорового питания" (Москва, 2004 г.); на 3-м Международном конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2005 г).
