Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы 6
1.1. Каппа-казеин как фракция молочного белка 6
1.2. Полиморфизм гена каппа-казеина у крупного рогатого скота ... 12
1.3. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина 20
1.4. Влияние сезонности на молочную продуктивность и технологические свойства молока 27
Раздел 2. Экспериментальная часть 32
2.1. Материалы и методы исследований 32
2.2. Результаты исследований 43
2.2.1. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина у коров черно-пестрой породы 43
2.2.2. Молочная продуктивность коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела 46
2.2.3. Технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела 59
2.2.4. Взаимосвязь генотипа каппа-казеина с молочной продуктивностью и технологическими свойствами молока
при различных сезонах отела животных 76
Выводы 81
Предложения производству 83
Список использованной литературы 84
- Каппа-казеин как фракция молочного белка
- Полиморфизм гена каппа-казеина у крупного рогатого скота
- Анализ полиморфизма гена каппа-казеина у коров черно-пестрой породы
- Технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела
Введение к работе
Актуальность. Одной из основных задач в области молочного скотоводства является получение высокопродуктивных животных, молоко которых обладает оптимальными технологическими качествами. Однако селекционная работа, базирующаяся только на классических подходах, в настоящее время не обеспечивает высокого селекционного эффекта и не удовлетворяет потребностям сегодняшнего дня.
Опыт многих стран свидетельствует о важности селекции коров по белковомолочности, так как это во многом определяет пищевую ценность молока и его технологические свойства. В связи с возрастающими требованиями рынка к качеству молочной продукции, в частности к количеству и составу молочного белка, а также к сыродельным характеристикам молока, возникает насущная необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, связанных с качественными признаками молочной продуктивности. Одним из таких маркеров считается тестирование животных по локусу гена каппа-казеина.
Многие исследователи, изучавшие влияние аллелей гена каппа-казеина на качество молока, обнаружили устойчивую связь аллеля В каппа-казеина с технологическими свойствами молока. Так, В-аллельный вариант каппа-казеина связан с наиболее коротким временем коагуляции и затвердения, соответствует лучшей консистенции и композиции сгустка при изготовлении твердых сыров.
Известно, что в сыроделии происходят значительные перебои в выработке сыра, связанные с низким качеством молока в весенний переходный период, что сказывается на эффективности производства. Для снижения негативного воздействия сезонности целесообразно изучение взаимосвязи генотипа каппа-казеина с молочной продуктивностью и технологическими свойствами молока при различных сезонах отела животных.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молочной продуктивности и технологических свойств молока коров черно-пестрой породы Московской области с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов каппа-казеина у скота черно-пестрой породы Московской области с использованием ДНК-диагностики.
Изучить показатели молочной продуктивности коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела.
Изучить технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела.
Изучить взаимосвязь генотипа каппа-казеина с молочной продуктивностью и технологическими свойствами молока при различных сезонах отела коров.
Научная новизна. Впервые изучена взаимосвязь генотипа каппа-казеина с молочной продуктивностью и технологическими свойствами молока при различных сезонах отела коров. Получены также новые данные по частоте встречаемости аллельных вариантов и генотипов каппа-казеина у скота черно-пестрой породы Московской области. Установлено влияние генотипа животных по локусу гена каппа-казеина на показатели молочной продуктивности и технологические свойства молока при приготовлении сычужного сыра (брынзы).
Практическая значимость. Полученные данные о наличии взаимосвязи генотипа животных по локусу гена каппа-казеина с составом молока и его технологическими свойствами при различных сезонах отела коров открывают возможность для совершенствования черно-пестрого скота по качеству молока. Увеличение численности животных, несущих в геноме желательные аллельные варианты гена каппа-казеина, приведет к увеличению производства белковомо-лочной продукции с оптимальными технологическими свойствами.
5 Апробация работы. Результаты исследований доложены на Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2006г.), на конференции молодых ученых РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева (2007 г.).
Каппа-казеин как фракция молочного белка
Молоко - биологическая жидкость, образующаяся в молочной железе млекопитающих и предназначенная для вскармливания детеныша и предохранения его от инфекций в начальный период жизни. Это чувствительная многокомпонентная сбалансированная система, обладающая высокими питательными, иммунологическими и бактерицидными свойствами и изменяющая свое состояние при воздействии различных факторов.
С древних времен люди используют молоко некоторых животных в пищу. Установлено, что на долю молока приходится 25% потребляемого человеком белка (P.Martin, F.Grosclaude, 1993). Структура потребления молока и молочных продуктов определяется социальными, экономическими, географическими и другими условиями (А.Тепел, 1979, Дж. Р.Кэмпбелл, Р.Т.Маршалл, 1980, С.А.Данкверт,2002).
Белки молока - наиболее биологически ценные компоненты, высокомолекулярные комплексные органические соединения, которые содержат углерод, водород, кислород, азот, серу, иногда фосфор. Эти элементы образуют структурные частицы белка - аминокислоты, последние связаны между собой характерной для белков пептидной связью. Белковые молекулы содержат от 100 до нескольких тысяч аминокислот в пептидных цепях.
Белки содержатся в молоке в виде мицелл, значительно больших по размерам, чем их макромолекулы. Это относится прежде всего к казеину, который находится в молоке в виде полидисперсного казеин-кальций-фосфатного комплекса.
Для разделения белков учитывают их растворимость в различных растворителях (вода, растворы солей, спирт), присутствие в них дополнительных элементов (фосфор, железо и т.д.) или веществ небелковой природы (сложные бел ки). Исходя из указанных особенностей белки молока подразделяют следующим образом (рис. 1).
Из белков, приведенных в схеме, наибольшую ценность представляет казеин. На использовании его свойств и особенностей основаны целые отрасли молочной промышленности (сыроделие, кисломолочные продукты).
Количество казеина в коровьем молоке колеблется от 2,1 до 2,8%. Элементарный состав нефракционированного казеина (в %) следующий: углерод -53,1; водород - 7,1; кислород - 22,8; азот - 15,4; сера - 0,82; фосфор - 0,8. На долю казеина приходится около 80% всех белков молока.
На практике под казеином понимают смесь фосфопротеидов, осаждаемых из обезжиренного молока при подкислении до рН 4,6...4,7. По определению Кинселлы (К.К.Горбатова, 2004), казеин - это группа гетерогенных фосфопротеидов, самоассоциирующихся в мицеллы в присутствии кальция, цитратов и фосфатов. Действительно, основная часть казеина (около 95%) в молоке содержится в виде казеиновых мицелл и лишь незначительная часть (около 5%) - в виде мономеров, полимеров фракций казеина и субмицелл, имеющих размер менее 20...40нм. Последнюю форму казеина называют растворимым казеином, его количество зависит от температуры и продолжительности хранения молока.
Очищенный казеин, выделенный из молока с помощью уксусной кислоты, представляет собой белый, аморфный порошок без вкуса и запаха. Он не растворим в спирте, эфире, слабо растворяется в воде и хорошо в солях. Под действием слабых кислот и сычужного фермента казеин свертывается.
В растворе казеин имеет ряд свободных функциональных групп, которые обуславливают его заряд, характер взаимодействия с водой (гидрофильные свойства) и способность вступать в химические реакции.
При рН свежего молока 6,6...6,7 казеин имеет отрицательный заряд. Равенство положительных и отрицательных зарядов (изоэлектричесткое состояние белка) наступает в кислой среде при рН 4,6.. .4,7.
Казеин принадлежит к фосфопротеидам - в своем составе содержит фосфорную кислоту (органический фосфор), присоединенную моноэфирной связью к остаткам серина:
Своими полярными группами и пептидными группировками главных цепей казеин связывает значительное количество воды - около 3,7 г на 1 г белка. Способность казеина связывать воду имеет большое практическое значение. Гидрофильные свойства казеина определяют устойчивость мицелл белка в сыром, пастеризованном и стерилизованном молоке, водосвязывающую и влаго-удерживающую способность сырной массы при созревании сыра, то есть консистенцию готового продукта (К.К.Горбатова, 2004).
В молоке казеин имеет явно выраженные кислые свойства. Его свободные карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот и гидроксильные группы фосфорной кислоты легко взаимодействуют с ионами солей щелочных и щелочноземельных металлов (Na+, К+, Са2+, Mg2+), образуя казеинаты.
Полиморфизм гена каппа-казеина у крупного рогатого скота
Открытие генетических полиморфных систем белков молока и их строгого наследования по законам Менделя, независимого от условий жизни, возраста и физиологического состояния животных, привлекло внимание большого круга биологов. Интерес к этой проблеме не случаен. Он связан, с одной стороны, с возможностью углубления теоретических знаний в области генетики животных, а с другой стороны, полученные результаты имеют большое практическое значение (R.Aschaffenburg, J.Drewry, 1955).
Состав молока определяется многими генами и наследуется по типу полимерии (Л.С.Жебровский, 1977). Полимерия (от греческого polymereia - многосложность) - один из типов взаимодействия генов, при котором степень развития одного и того же признака обусловлена влиянием ряда так называемых полимерных генов (проявляющихся сходным образом).
Полиморфизм (от греческого polymorphos - многообразный) - это одновременное существование в популяциях двух или нескольких вариаций признака, причем пропорции этих вариаций таковы, что частота самой редкой из них не может обуславливаться только интенсивностью мутационного процесса в данном локусе, а является результатом гетерозиготного состояния уже существующих аллелей. Поэтому термин генетический «биохимический» полиморфизм применяется в тех случаях, когда локус хромосомы в популяции имеет два или более аллеля с частотой больше 0,01. Термин «полиморфизм» введен Е. Фордом в 1945 году. А. Тепел (1979) определяет генетический полиморфизм как существование наследственно обусловленных различных форм генетических вариантов определенного белка.
В практике селекции большое значение имеет обнаружение полиморфизма генов, которые либо сами являются предметом селекции, либо используются в косвенной селекции в качестве признаков, на совершенствование которых должна быть направлена селекция.
Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина, как и других белков молока, первоначально изучался на уровне белков. У крупного рогатого скота было выявлено четыре аллеля каппа-казеина - А, В, С (в некоторых работах описанный как D) и Е (F.Grosclaude, 1972, L.Di Stasio,1979, В. Seibert, 1987, G.Erhardt, 1989). Следует отметить, что при описании новых аллелей на основании их электрофоретической подвижности возникают проблемы с идентификацией аллеля при использовании разных методов фракционирования белков. Так, аллель С был выделен в самостоятельный аллель на основании его электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (L.Di Stasio,1979), а аллель D -при разделении белков молока методом изоэлектрофокусирования (В. Seibert, 1987). Впоследствии выяснилось, что аллели С и D идентичны.
Появление методов анализа полиморфизма генов на уровне ДНК открыло новые возможности для изучения аллельного разнообразия, в том числе и гена каппа-казеина. Первоначально генотипирование по локусу каппа-казеина проводили методом анализа длин рестрикционных фрагментов с использованием блот-гибридизации (H.Levesiel, 1988), а открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило разработать более быстрые и совершенные методы. Общее для этих методов - амплификация экзона IV, где расположены аллельные замены, которые затем тестируются с помощью рестрикции продуктов ампли фикации различными эндонуклеазами (F.J.Medrano,1990, D. Denicourt,1990, А. Barrosso, 1998). Рестриктирующие эднонуклеазы (рестриктазы) узнают особые положения в ДНК (сайты узнавания) и совершают разрезы в двухцепочной ДНК на определенное количество фрагментов фиксированного размера. В геле под действием электрического поля эти фрагменты разделяются в зависимости от молекулярной массы (мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее крупных). Молекулярная масса фрагмента пропорциональна его длине, выраженной в количестве пар нуклеотидов (пн) (Л.А.Калашникова, И.М.Дунин, 1999).
Анализ полиморфизма гена каппа-казеина на уровне ДНК имеет целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами. Во-первых, он позволяет тестировать аллели каппа-казеина не только у лактирующих коров, но и у быков и молодняка. Во-вторых, использование ПЦР позволяет получать продукты амплификации в количествах, достаточных для подробного исследования. В третьих, стало возможным исследование полиморфизма гена каппа-казеина в популяциях диких сородичей крупного рогатого скота, например у различных представителей подсемейства Bovinae, с использованием ПЦР-анализа (табл. 1).
Количество и тип каппа-казеина в молоке зависит от индивидуальных особенностей животного и изменяется с возрастом: отмечено постепенное увеличение содержания каппа-казеина до шестой лактации и снижение у коров седьмой лактации до исходной величины (К.С.Аманжолова, 1994).
Анализ полиморфизма гена каппа-казеина у коров черно-пестрой породы
Исследования выполнялись в лаборатории ДНК-технологий ВНИИ племенного дела, в лаборатории по оценке качества молока, на молочном заводе РГАУ - МСХА имени КА.Тимирязева и в ЗАО Племхоз «Наро-Осановский» Одинцовского района Московской области в 2004 - 2006 гг. согласно схеме (рис. 2).
По природно-климатическим условиям хозяйство находится в первой агроклиматической зоне умеренно-континентального климата. Среднегодовая температура составляет +3,9С, средняя температура зимой -10,2С, летом + 17,3С. Среднегодовой уровень осадков 652мм.
Ведущей отраслью производства ЗАО Племхоз «Наро-Осановский» является животноводство (молочное скотоводство). Общее поголовье скота составляет 5240 голов, надой на фуражную корову 6600кг молока (по данным за 2006г). Характеристика технологии молочного скотоводства хозяйства представлена в табл.2.
Для проведения исследований у 117 коров черно-пестрой породы были взяты пробы крови, а именно: у 63 коров, отелившихся в осенний сезон года и 54 коров, отелившихся в весенний сезон года. Все опытные животные были старше второго отела и содержались в одинаковых условиях на молочной ферме «Саввинка» в ЗАО Племхоз «Наро-Осановский». Образцы крови консервировались цитратом натрия (2мл на пробу) и транспортировались в течение суток в лабораторию ДНК-технологий ВНИИ племенного дела.
Ядерную ДНК из крови крупного рогатого скота выделяли фенол-детергентным методом (Blin N., Stafford D.W., 1976) с некоторыми модификациями:
1. К 5 мл консервированной крови добавляли по капле, непрерывно помешивая, 60 мл охлажденного 0,1 мМ ЭДТА. Центрифугировали 15-20 мин при 3000 об/мин с охлаждением, осаждая ядра лейкоцитов.
2. Супернатант удаляли, а осадок, состоящий из ядер лейкоцитов, отмывали с помощью ряда следующих друг за другом ресуспендирований и центрифугирований в 1х ТЕ. Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин с охлаждением.
3. Отмытый осадок ядер лейкоцитов подвергали лизису. К осадку добавляли 10 % SDS до конечной концентрации 1 % - 75 мкл, протеиназу К до конечной концентрации 200 мкг/мл - 7,5 мкл и доводили объем до 0,75 мл буфером lxSTE. Лизис ядер лейкоцитов проводили при комнатной температуре в течение ночи. Затем лизат обрабатывали РНКазой А (10мг/мл) в течение часа при 37 С, добавляя фермент до конечной концентрации 100 мкг/мл.
4. Далее проводили экстракцию ядерной ДНК из лизата:
1) К полученному лизату добавляли равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола. Тщательно перемешивали, пока не образовывалась белая эмульсия. Центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Отбирали водную фазу. Промежуточную и нижнюю фазы отбросили.
2) К водной фазе добавили равный объем Extract буфера (смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1). Далее повторили операции 1-й стадии экстракции.
5. ДНК осаждали этанолом, добавив 2 объема охлажденного 95 % этанола к раствору. Осторожно перемешивали. Выделенную ДНК в виде «медузы» пере носили в 70% спирт и прополаскивали. Затем переносили ДНК на стенку чис той микроцентрифужной пробирки. Высушивали ДНК на воздухе и растворяли в 1 хТЕ буфере или в дистиллированной воде.
Концентрацию, нативность выделенной ДНК определяли в 1 % агароз-ном геле электрофоретическим методом. Аликвоты проб ДНК смешивали с буфером нанесения, содержащим 0,25 % ксиленцианола и 0,25 % бромфенолового синего в соотношении (5:1) по объёму, наносили в лунки геля и подвергали электрофорезу в трис-боратном буфере (18 мМ Трис (НС1, рН 8,5; 18 мМ борной кислоты, 0,4 мМ ЭДТА) при 40 В (не более 5 В/см) в течение 2 часов.
Визуализировали ДНК после окраски бромистым этидием (0,05%) на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с помощью компьютерной видеосистемы. Концентрацию оценивали по яркости свечения ДНК в геле по сравнению с известной концентрацией маркерной ДНК. О нативности (отсутствии деградации) ДНК свидетельствовало отсутствие шлейфа.
Технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела
Технологические свойства молока определяют пищевую ценность молочных продуктов, их выход и способность сохранять свои качества при хранении. К технологическим свойствам молока относится химический состав молока и его компонентов, качество молока по органолептическим, санитарно-гигиеническим показателям, сыропригодность, термоустойчивость, сычужная свертываемость, отсутствие посторонних веществ.
На технологические свойства молока существенное влияние оказывают содержание, химический состав, структура, свойства жира и белка. С увеличением содержания этих веществ в молоке повышается выход сливочного масла, творога, сыра, сметаны и др., интенсивнее проходят технологические операции их выработки, улучшается вкус и консистенция продуктов.
Однако наибольшее воздействие на технологические свойства молока оказывают сезонные изменения его химического состава, которые имеют примерно одинаковые закономерности для различных районов. Сезонные изменения в основном обусловлены периодом лактации, а также изменяющимися в течение года рационами кормления, условиями содержания животных.
С целью изучения технологических свойств и сыропригодности молока коров с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела проведены опыты по изготовлению сычужного сыра (брынзы) в различные периоды лактации коров. Молоко от животных опытных групп с генотипами каппа-казеина АА, АВ и ВВ исследовалось на 2-3, 5-6 и 8-9 месяцах лактации. Результаты исследования технологических свойств молока коров осеннего и весеннего сезонов отела приведены в таблицах 17 и 18.
В наших исследованиях установлено, что содержание жира в молоке коров осеннего отела с генотипом каппа-казеина АА во все периоды лактации было ниже (4,34 - 5,11 - 4,16%), чем в молоке коров с генотипом АВ (5,22 -5,43 - 5,02%) и коров с генотипом ВВ (5,44 - 5,45 - 5,41%).
Содержание белка в молоке коров с генотипом АА на 2-3 и 5-6 мес. лактации (3,12 - 3,09%) оказалось выше, чем в молоке коров с генотипом АВ (2,88 - 2,86%), но ниже, чем в молоке коров с генотипом ВВ (3,12 - 3,53%). На 8-9 мес. лактации содержание белка в молоке коров с генотипом АА стало наименьшим (АА - 2,83, АВ - 2,92, ВВ - 2,88%).
Плотность молока коров с генотипом каппа-казеина АА во все периоды лактации (29 - 29,1 - 28,5 А) превосходила плотность молока животных с генотипом АВ (28,2 -28,4 - 28,3 А), но была ниже плотности молока коров с генотипом ВВ (29 - 29,5 - 29,2 А).
Молоко коров с генотипом каппа-казеина ВВ имело наивысшую термоустойчивость во все периоды лактации (80%), тогда как у молока коров с генотипами АВ и АА самый высокий показатель термоустойчивости наблюдался лишь на 2-3 и 5-6 мес. лактации соответственно. В остальные периоды термоустойчивость молока коров с генотипами АА и АВ составила 75%.
В сыроделии большую роль играет способность молока к сычужной свертываемости, т.е. к быстрому образованию плотного белкового сгустка, чем определяется сыропригодность молока. Молока, пригодного для сыроделия по сычужной свертываемости, поступает на молочные предприятия по отдельным районам от 10 до 48%, в среднем 30%. Сычужно-вялое молоко при недостатке кальция образует дряблый непрочный сгусток, дающий при обработке высокий отход белка в сыворотку и низкое качество сыра.
Согласно результатам проведения сычужной пробы, только молоко коров с генотипом ВВ во все периоды лактации имело время свертывания 25-27мин, соответствовало желательному II типу (по А.М.Николаеву) и являлось оптимальным для сыроделия (рис.5). Нормальной свертываемостью характеризовалось молоко коров с генотипом АВ на 5-6 и 8-9 мес. лактации (31 - 38 мин).
Содержание жира в молоке коров весеннего отела с генотипом каппа-казеина АВ (3,21%) было ниже, чем в молоке коров с генотипом АА (4,26%) на 2-Змес. лактации, а на 5-6 и 8-9мес. выше (на 0,16 - 1,74%).
Содержание белка в молоке коров весеннего отела с генотипом каппа-казеина АВ (2,78-3,57-3,68%) во все периоды лактации превосходило содержание белка в молоке коров с генотипом каппа-казеина АА (2,58-3,11-3,36). Различия между жирномолочностью коров с генотипом каппа-казеина АВ и генотипом АА составили 0,20-0,46%.
Плотность молока коров весеннего отела с генотипом каппа-казеина АВ во все периоды лактации (28,5-28,8-29,6 А) превосходила плотность молока животных с генотипом АА (27,8-28,2-28,8 А). Различия по плотности молока коров с генотипами АВ и АА составляли по периодам лактации 0,7-0,6-0,8 А. Термоустойчивость молока коров весеннего отела с генотипом каппа-казеина АВ (75-80-75%) также была выше во все периоды лактации, чем термоустойчивость молока коров с генотипом АА (72-72-70% этилового спирта).
В результате анализа времени загустения молока коров опытных групп можно заключить, что выявленная связь сычужной свертываемости молока в процессе приготовления сыра и генотипа каппа-казеина сохранила свою направленность независимо от сезона отела животных (рис.6). Молоко коров весеннего отела с генотипом каппа-казеина АВ имело оптимальное время загустения под действием сьиужного фермента (25-32мин.) и являлось пригодным для сыроделия во все периоды лактации. Молоко коров с генотипом каппа-казеина АА характеризовалось нормальной свертываемостью только на 2-3 мес. лактации (29мин.), тогда как в середине и, особенно, в конце лактации оказалось непригодным для сыроделия (42-60мин.).
