Содержание к диссертации
Введение
1. Состояние вопроса и задачи исследования .. 7
1.1. Микотоксины в сырье и винодельческой продукции 7
1.2. Способы снижения содержания патулина в винодельческой продукции
1.3. Тяжелые металлы 20
1.4. Технологические приемы деметаллизации винопродукции 28
1.5. Задачи исследования 31
2. Методическая часть 32
2.1. Объекты исследования и условия проведения экспериментов 32
2.2. Материалы и методы исследований 34
3. Экспериментальная часть 40
3.1. Исследование влияния патулина на физиологию и ультраструктурный состав дрожжевых клеток при сбраживании яблочного сусла 40
3.2. Влияние патулина на биохимические процессы при получении яблочных виноматериалов 53
3.3. Исследование влияния патулина на динамику алкогольного брожения, физиологию и ультраструктурный состав дрожжевых клеток при сбраживании виноградного сусла 62
3.4. Влияние патулина на биохимические процессы при получении виноградных виноматериалов 67
3.5. Исследование влияния тяжелых металлов на клетки винных дрожжей 79
3.6. Исследование воздействия различных технологических приемов на содержание тяжелых металлов и патулина в винопродукции 97
3.6.1. Влияние обработки бентонитом на содержание патулина в сусле 98
3.6.2. Влияние обработки диоксидом серы на содержание патулина в сусле 100
3.6.3. Влияние термической обработки на содержание патулина в сусле 101
3.6.4. Разработка способа обработки виноматериала иммобилизованными дрожжами с целью удаления патулина и тяжелых металлов 103
3.7. Аппаратурно-технологическая схема производства экологически безопасных вин 109
4. Выводы и результаты исследований 112
Список использованной литературы 115
Приложения 151
- Способы снижения содержания патулина в винодельческой продукции
- Технологические приемы деметаллизации винопродукции
- Влияние патулина на биохимические процессы при получении яблочных виноматериалов
- Исследование воздействия различных технологических приемов на содержание тяжелых металлов и патулина в винопродукции
Введение к работе
В настоящее время в условиях свободного рынка, а также с учетом перспективы вступления нашей страны во Всемирную Торговую организацию (ВТО) конкурентоспособность отечественной винодельческой продукции становится важнейшим условием дальнейшего развития виноделия России. При этом экологическая безопасность вина является одним из наиболее существенных критериев оценки качества.
К элементам, значительно снижающим качество плодового сырья и винограда и экологическую безопасность готовой продукции, относятся тяжёлые металлы и микотоксины, в частности патулин.
Данных о содержании патулина в винограде и продуктах его переработки в литературе представлено относительно мало. При этом проблема влияния патулина и тяжелых металлов на физиологию и морфологию дрожжевых клеток и, как следствие, на физико-химические и биохимические процессы, протекающие при производстве плодовых и виноградных вин, до настоящего времени практически не изучена.
Ее решение возможно на основе углубленного исследования действия токсичных элементов на функциональную активность и внутриклеточную структуру дрожжей.
В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в разработке технологии повышения экологической безопасности вин на основе изучения изменения метаболизма и ультраструктуры винных дрожжей под действием различных контаминантов.
Установлены общие закономерности изменения состава и органолептической оценки виноматериалов, полученных при брожении виноградного и плодового сусла с высоким содержанием патулина. Установлено, что наличие патулина в сусле нарушает нормальный процесс спиртового брожения и способствует увеличению содержания глицерина, высших спиртов и летучих кислот.
Подробно изучено влияние патулина и тяжелых металлов на физиологическую активность и ультраструктуру клеток винных дрожжей. Установлено ингибирующее влияние указанных токсикантов на дыхательную и бродильную активность дрожжей, а также их деструктивное воздействие на форму, целостность клеток и клеточных органоидов.
Установлено, что обработка иммобилизованными дрожжами способствует значительному снижению содержания тяжелых металлов, полной сорбции патулина и повышению качества вин.
На основании проведенных исследований ультраструктуры и метаболизма винных дрожжей даны рекомендации производству по совершенствованию технологии виноградных и плодовых вин.
Разработана технология и аппаратурно технологическая схема производства экологически безопасных вин. Применение новой технологии позволяет существенно повысить качество и конкурентоспособность готовой продукции.
Разработана и утверждена технологическая инструкция на производство новой марки плодового вина «Старорусское белое» ТИ 10-27999-2003, технология которого предусматривает обработку яблочных виноматериалов иммобилизованными дрожжами.
Экономический эффект от внедрения новой технологии составит 700 тыс. руб. на 100 тыс. дал готовой продукции.
На защиту выносятся:
результаты исследований по влиянию патулина и тяжелых металлов на активность процесса алкогольного брожения и формирование физико-химических, биохимических и органолептических показателей винодельческой продукции;
исследование влияния микотоксина патулина и тяжелых металлов на функциональную активность и ультраструктуру клеток винных дрожжей;
технология повышения экологической безопасности винопродукции на основе применения иммобилизованных клеток винных дрожжей.
Способы снижения содержания патулина в винодельческой продукции
При производстве винодельческой продукции наиболее серьезное внимание уделяют входному контролю качества и экологической безопасности растительного сырья [30,31,32,131,132,133]. Для предотвращения развития болезней и синтеза патулина в сырье используют различные агротехнические приемы, дефолиацию, а также обработку фунгицидами и биопрепаратами. В производстве для инактивации токсина используют тепловую обработку, сульфитацию, различные химические реагенты и другие средства [1,2,3,58,68,69,101]. Микотоксины обладают достаточно высокой стабильностью к различным физическим и химическим воздействиям [112,185,196]. Эффективность деконтаминации патулина, по мнению большинства ученых, в значительной степени зависит от величины рН среды и температуры. С увеличением температуры и значения рН инактивация патулина усиливается [185,196]. В кислой среде патулин полностью разрушается только при длительной стерилизации (в течение 1 часа при температуре 100С), а в щелочной - довольно быстро теряет свои токсические свойства даже при непродолжительном тепловом воздействии при невысоких температурах [152,226]. Введение раствора солянокислого цистеина в сок за сутки перед термической обработкой позволяет существенно увеличить ее эффективность [64].
В соках, не прошедших надёжной пастеризации, возможно вторичное заражение сока патулином, связанное с сохранением в соке термостойких спор плесени, которые начинают развиваться при хранении [149]. Биосинтез токсина активно протекает в присутствии кислорода. В связи с этим необходимо тщательно предохранять соки от любого контакта с кислородом воздуха [170]. Вторичное инфицирование соков также может быть связано и с хорошей растворимостью токсина в воде, что обусловливает его распространение по всему объёму резервуара [170]. Однако по мнению других авторов в процессе хранения плодовых соков даже при комнатной температуре патулин постепенно инактивируется и полностью исчезает через 1-3 месяца в зависимости от вида сока [196]. По другим данным концентрация патулина в яблочном пюре и повидле при хранении в течение 6 месяцев снижается всего на 20 - 30 % [57,184,185]. Устойчивость патулина в яблочном соке в процессе хранения, особенно при температуре 20С, отмечают и другие авторы [183]. Эффективным способом снижения содержания патулина в соке является его обработка диоксидом серы [147,148,163,182]. Разрушение патулина происходит и при добавлении аскорбиновой кислоты [152,223]. Имеются данные о разрушении патулина в плодовых соках с помощью микроволновой обработки [156]. Обработка соков активированным углем также является одним из способов снижения в них концентрации патулина [64,195]. Ощутимые количества патулина удаляются из виноградного сусла и яблочного сока при их совместной обработке активированным бентонитом (70-80 %), хлористым титаном и диоксидом серы [25,36,38]. Ряд авторов отмечают существенное уменьшение содержания токсина в процессе спиртового брожения, вплоть до его полного разрушения [163,183,184]. При этом патулин не влияет на скорость брожения даже в концентрации 2 мг/дм [147]. Б.С. Гаина с сотрудниками предложил для инактивации патулина при сбраживании сусла использовать ступенчатое сульфитирование с промежуточной задачей активной биомассы дрожжей, обработку виноматериалов бентонитом, поливинилпиролидоном, холодом, а также пастеризацию при температуре 70С в течение 15 минут [23]. Однако эффективность такой сложной и многоступенчатой схемы, позволяющей снизить содержание патулина по данным авторов на 30 - 50 %, не может быть признана высокой. Анализ доступной литературы по данной теме показал, что ряд вопросов, касающихся, в частности, изучения влияния патулина на процесс брожения, метаболизм и функциональную активность дрожжей, состав виноматериалов, до настоящего времени изучен недостаточно.
Технологические приемы деметаллизации винопродукции
Для снижения содержания катионов тяжелых металлов в вине в практике виноделия используют различные препараты. К ним, в частности, относятся фитин, НТФ (двунатриевая и тринатриевая соль нитрилотриметилфосфоновой кислоты), желтую кровяную соль ЖКС (калий жилезистосинеродистый). Однако в применении каждого из этих химических препаратов существуют свои правила и ограничения. Для повышения экологической безопасности винодельческой продукции за рубежом и в нашей стране в последнее время все шире стали использовать биохимические методы [72,138].
Положительные результаты получены при использовании в качестве биосорбентов препарата плант на основе морских водорослей [74], а также дубовых опилок, предварительно очищенных от водо- и спирторастворимых веществ [130].
К биохимическим методам можно отнести использование ферментных систем осадочных дрожжей [138], применение препаратов живых, автолизированных и мертвых дрожжевых клеток, а также клеточных оболочек дрожжей для удаления снижающих качество вина тяжелых металлов и пестицидов [4,53,140,141].
Для деконтаминации продуктов переработки винограда был предложен способ приготовления биосорбента из дрожжевых осадков для удаления пестицидов и тяжелых металлов. Однако по мнению автора применение разработанного биосорбента эффективно только при использовании комбинированных способов воздействия: биосорбент и электрофлотация, биосорбент и ультрафиолетовое облучение, биосорбент и бентонит. Необходимо также отметить, что сорбционными свойствами по отношению к пестицидам обладали, только дрожжи сахаромицеты, находящиеся в ингибированном состоянии. Дикие культуры дрожжей не обладали высокой сорбционной способностью. [34]. В последние годы с большим успехом для интенсификации технологических приемов и повышения экологической безопасности продукции в различных областях промышленности используются иммобилизованные микроорганизмы [171,190,199,202]. Повышенный интерес к иммобилизованным микроорганизмам связан с тем, что их биологическая активность сохраняется гораздо дольше, чем у свободных дрожжевых клеток [204,225].
Эффективность использования иммобили зованных микроорганизмов в существенной степени зависит от метода иммобилизации. Существует значительное количество методов иммобилизации: адсорбция (закрепление) микроорганизмов на поверхности носителя, которым может быть древесная стружка, керамика, кольца Рашига, растительные волокна, силикатные материалы, соединения титана, стекловолокно и др.; включение в гели (альгинат Са, карраген, агароза, хитозан, пектин, желатин, полиакриламид и ДР-)ї ковалентное связывание; мембранное удержание микроорганизмов на клетчатке, диатомите [97,108].
Наибольший практический интерес для пищевой промышленности представляет относительно дешевый метод иммобилизации клеток - адсорбция, при которой происходит физическое взаимодействие микроорганизмов и носителя (сорбента). В пищевой и, в частности, в винодельческой промышленности, нашли применение сорбенты из полиэтилена, керамики и древесины [105]
Сравнительные исследования по сорбции металлов из модельных растворов, содержащих отдельные металлы — медь, железо, цинк, свинец - и комплекс перечисленных металлов, свободными клетками дрожжей и иммобилизованными на насадке позволили установить более высокую степень сорбции металлов из среды иммобилизованными клетками дрожжей по сравнению со свободными. Дрожжевые клетки при этом более интенсивно сорбировали медь и железо, нежели цинк и свинец. Аналогичные результаты были получены и при сорбции металлов из виноматериалов [114].
В связи с тем, что вино - это многофазная система, содержащая в своем составе около 800 различных соединений, на сорбцию металлов влияет целый ряд факторов: биохимический и физико-химический состав вина, физиологическое состояние дрожжей, природа сорбента, концентрация металлов и другие. Эти вопросы требуют дальнейшего всестороннего изучения.
Влияние патулина на биохимические процессы при получении яблочных виноматериалов
Обнаруженные морфологические и цитологические изменения в дрожжевых клетках в результате токсического воздействия патулина оказывают, как показали проведенные исследования (гл. 3.1. данной работы), существенное влияние на их физиологическую активность, а также динамику спиртового брожения и, как следствие, метаболизм. Отмеченные изменения не могли не сказаться на трансформации целого ряда показателей состава яблочных материалов. Представляло интерес исследовать влияние микотоксина патулина на биохимические превращения в процессе получения яблочных материалов. В лабораторных условиях готовили опытные образцы яблочного сусла, содержащего в начале брожения соответственно 200 (4 ПДК) и 800 (16 ПДК) мкг/кг патулина. В качестве контроля использовали яблочный сок, не содержащий токсина, и полученный из него виноматериал. Известно, что в неблагоприятных условиях (высокие значения рН, грибковое поражение) возможно прохождение более интенсивного, чем в нормальных условиях, глицеропировиноградного брожения, характеризующегося накоплением высоких концентраций образующегося из Сахаров глицерина. В связи с этим, в исследуемых образцах яблочных материалов определяли содержание глицерина. Проведенные исследования показали, что концентрация глицерина в контрольном образце яблочного сока была невелика и составила 9 мг/дм3, а в полученном из него виноматериале - 590 мг/дм3.
В то же время содержание глицерина в опытных образцах яблочных виноматериалов, содержащих в начале брожения 200 и 800 мкг/кг патулина, было в 1,3 раза выше, чем в контроле и составило соответственно 740 и 780 мг/ дм3.
Значительное накопление глицерина в образцах с высоким содержанием токсина, таким образом, было связано, по-видимому, с более интенсивным прохождением брожения по формуле Нейберга. Исследовали влияние патулина на изменение качественного и количественного состава органических кислот. Результаты исследований представлены в таблице 3.2. Как видно из данных, представленных в таблице 3.2, в процессе брожения происходило некоторое увеличение общей суммы органических кислот во всех образцах яблочных виноматериалов, в основном за счет уксусной кислоты. Более заметное накопление этого вторичного продукта спиртового брожения наблюдалось в опытных образцах, в которых концентрация уксусной кислоты составила соответственно 0,6 и 0,75 г/дм против 0,52 г/дм3 в контроле, что отрицательно сказалось на качестве полученных виноматериалов. Таблица 3.2 - Влияние патулина на изменение органических кислот при брожении Содержание органических кислот, г/дм3 Яблочные материалы Свежий сок Яблочныйвиноматериал(контроль) Яблочныйвиноматериалс 4 ПДКпатулина(опьіті) Яблочныйвиноматериалс 16 ПДКпатулина(опыт 2) Яблочная 5,50 5,25 5,37 5,28 Хинная 0,83 0,99 1,12 1,04 Лимонная 0,10 не обнаружена не обнаружена не обнаружена Молочная не обнаружена 0,20 0,06 0,10 Шикимовая 0,02 0,03 0,03 0,03 Уксусная 0,14 0,52 0,60 0,75 Фумаровая 0,01 0,10 0,06 0,08 Сумма 6,60 7,09 7,24 7,28 При брожении исследуемых образцов яблочных материалов также были зафиксированы синтез молочной и накопление хинной кислот. Последняя согласно литературным данным [61] образуется при гликолитическом распаде Сахаров из фосфоенолпировиноградной кислоты. В связи с этим обе указанные кислоты можно рассматривать как вторичные продукты спиртового брожения, образуемые из Сахаров. Некоторое снижение яблочной кислоты во всех анализируемых образцах виноматериалов, по всей видимости, было связано с превращением последней в процессе брожения по циклу ди - и трикарбоновых кислот. Увеличение суммарного содержания органических кислот выше оптимальных пределов (5,5 - 6,5 мг/дм3) отрицательно сказывалось на общей органолептической оценке полученных виноматериалов. Исследовали качественный и количественный состав аминокислот опытных и контрольных яблочных материалов. Результаты исследований представлены в таблице 3.3. Как видно из данных, представленных в таблице 3.3, в исходном яблочном соке было идентифицировано 8 аминокислот. В наибольшем количестве в этом контрольном образце содержалась глютаминовая кислота (44,3 % общей суммы аминокислот), в наименьшем - аланин (1,2 %), а также тирозин, фенилаланин и лизин, обнаруженные в следах. В процессе алкогольного брожения качественный и количественный состав аминокислот во всех образцах яблочных виноматериалов изменялся по сравнению с составом в исходном яблочном соке.
Исследование воздействия различных технологических приемов на содержание тяжелых металлов и патулина в винопродукции
В процессе исследований, проведенных в рамках данной работы, было установлено, что присутствие патулина и катионов тяжелых металлов в винодельческом сырье снижает физиологическую активность дрожжей, качество и экологическую безопасность готовой продукции. Известны различные способы снижения содержания микотоксинов в растительном сырье. Однако они касаются в основном зерна и продуктов его переработки. Данных о методах комплексного снижения содержания микотоксинов и тяжелых металлов в винодельческой продукции в доступной литературе практически не содержится. В связи с этим проводили исследования, направленные на разработку технологии экологически безопасной винодельческой продукции. В винодельческой промышленности широко применяют обработку соков и вин различными неорганическими веществами. В частности, известно применение бентонита при переработке винограда, пораженного гнилью, для удаления окислительных ферментов. Однако данных по изменению содержания микотоксина патулина при использовании этой технологической операции в доступной литературе практически не содержится. В связи с этим в лабораторных условиях исследовали влияние обработки суспензией бентонита на степень удаления данного микотоксина из яблочного сусла.
При этом степень адсорбции патулина в значительной степени зависела от исходной концентрации патулина в среде и от дозы вносимого в сусло бентонита. Более эффективно снижалось содержание патулина при использовании бентонита в дозах не менее 2,0 г/дм , особенно при высокой исходной концентрации токсина в среде. Диоксид серы широко применяется в виноделии в концентрации 50-75 мг/дм3 при отстое сусла, приготовленного из здорового винограда, и 120-150 мг/дм3 из винограда, пораженного гнилью, с целью ингибирования активных центров окислительных ферментов плесневых грибов. Однако данных о влиянии сульфитирования на содержание патулина в винодельческом сырье в литературе практически не содержится. В связи с этим в лабораторных условиях исследовали влияние обработки диоксидом серы на степень удаления патулина из виноградного сусла. Для исследований использовали виноградное сусло с исходным содержанием патулина 0,4 мг/дм3. Сусло сульфитировали из расчета 75 и 150 мг/дм3 и через сутки определяли концентрацию токсина в нем. Результаты исследований представлены в таблице 3.15. Исследовали влияние термической обработки на разрушение патулина. С этой целью свежеотжатый яблочный сок с содержанием патулина 0,4 мг/дм3 нагревали до температуры 80 С и выдерживали при этой температуре в течение 5, 10 и 15 минут. Как видно из данных, представленных в таблице 3.16, пастеризация в течение указанного времени не оказывала заметного влияния на трансформацию патулина. Содержание его в соке до и после тепловой обработки практически не изменялось. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что широко используемые в виноделии технологические приемы (обработка бентонитом, сульфитация, тепловая обработка) способствовали снижению содержания патулина, но не обеспечивали его полного удаления из сусла.
Для повышения качества и экологической безопасности виноматериалов в виноделии в последнее время все чаще используют различные специальные технологические приемы: обработку виноматериалов различными биосорбентами, ферментными концентратами, приготовленными из осадочных дрожжей и их автолизатов [4,53,141], а также иммобилизованными на насадке клетками дрожжей [48,106,107,114].
Целью настоящей работы явилась разработка новой технологии повышения экологической безопасности виноградных и плодовых вин, предусматривающей использование для снижения содержания микотоксина патулина и тяжелых металлов обработки виноматериалов иммобилизованными дрожжами.
Для проведения указанных исследований использовали лабораторную установку, состоящую из трех стационарных резервуаров емкостью 1дм3 каждый, снабженных мерниками и системой охлаждения для поддержания оптимальной температуры обработки 14-16С. Резервуары заполняли насадкой из полиэтилена высокого давления, выполненной в виде колец диаметром 5-7 мм и высотой 7-10 мм.
