Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований
1.1 Роль стартовых культур в формировании качества сырокопченых колбас 7
1.2 Биотехнологические свойства пропионовокислых и бифидобактерий 21
1.3 Антимутагенные свойства пробиотических микроорганизмов 33
1.4 Заключение по литературному обзору и задачи исследований 45
Глава 2. Организация проведения экспериментов. материалы и методы исследований
2.1 Объекты исследований и постановка эксперимента 48
2.2 Методы исследований 50
2.3 Статистическая обработка результатов 56
Глава 3. Теоретические и экспериментальные предпосылки применения пробиотических микроорганизмов при производстве сырокопченых колбас
3.1 Изучение биотехнологического потенциала пробиотических микроорганизмов 58
3.2 Исследование антимутагенных свойств пропионовокислых и бифидобактерий 61
3.3 Исследование устойчивости пробиотических микроорганизмов к поваренной соли 64
3.4 Влияние нитрита натрия на устойчивость и антимутагенную активность пробиотических микроорганизмов 67
Глава 4. Обоснование технологических параметров производства сырокопченых колбас с использованием стартовых культур
4.1 Выбор дозы вносимого бакконцентрата в фарш для сырокопченых колбас 71
4.2 Исследование процесса сушки сырокопченых колбас 76
4.3 Исследование санитарно-гигиенических показателей при
производстве сырокопченых колбас 78
ГЛАВА 5. Влияние пробиотических микроорганизмов на формирование качества сырокопченых колбас
5.1 Сенсорная оценка сырокопченых колбас с пробиотическими свойствами 80
5.2 Исследование физико-химических показателей сырокопченых колбас 85
5.3 Изучение вкусо-ароматических свойств сырокопченых колбас 86
5.4 Влияние технологических факторов на антимутагенные свойства
пробиотических микроорганизмов 93
5.5 Исследование качества сырокопченых колбас при хранении 95
Глава 6. Разработка технологии сырокопченых колбас с использованием пробиотических микроорганизмов
6.1 Особенности технологии производства сырокопченых колбас с использованием пробиотических культур )100
6.2 Управление качеством и контроль за безопасностью производства сырокопченых колбас с использованием принципов системы ХАССП )106
Выводы 132
Библиография
- Роль стартовых культур в формировании качества сырокопченых колбас
- Объекты исследований и постановка эксперимента
- Изучение биотехнологического потенциала пробиотических микроорганизмов
- Сенсорная оценка сырокопченых колбас с пробиотическими свойствами
Введение к работе
При любом уровне экономического развития пищевой отрасли мясные изделия пользуются высоким потребительским спросом. Снижение их себестоимости при гарантированном сохранении стандартного качества -важнейшее условие расширения ассортимента и увеличения объемов выпуска этого вида продукции. Одним из реальных путей решения этой задачи в настоящее время является разработка и внедрение новых технологий, ориентированных на обеспечение качества и безопасности мясных продуктов.
Перспективным направлением является реализация
биотехнологических методов в мясной промышленности, связанная с созданием новых технологических решений, основанных на эффективном использовании как собственных ферментных систем биологических объектов, так и целенаправленно внесенных микроорганизмов (бактериальных стартовых культур), продуцирующих ферменты, белки, незаменимые аминокислоты и витамины. Многообразие технологических приемов обработки мясного сырья микроорганизмами позволяет вырабатывать готовые продукты высокого качества, обладающих не только функциональными, но и пробиотическими свойствами. Эффективность применения бактериальных стартовых культур зависит от их биоактивности, состава и свойств микроорганизмов, условий культивирования, состава сырья, режимов технологической обработки.
Достижения в развитии методов биомодификации сырья животного происхождения, изучение особенностей метаболизма микроорганизмов, повышение их функциональных свойств заложены в фундаментальных и
прикладных исследованиях Л.В. Антиповой, В.М. Богданова, Л.И.
Воробьевой, В.И. Ганиной, Н.С. Королевой, И.А. Рогова, В.Ф. Семенихиной, А.Б. Лисицына, Н.Н. Липатова (ст), В.В. Хорольского, L. Bener, G.B. Gibson, W.P. Hammes, F.K. Liicke, N.P. Shan и др.
Среди ингредиентов, определяющих функциональные свойства продуктов питания, особое место занимают микроорганизмы с пробиотическими свойствами, формирующие нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта. Это является одним из решающих факторов формирования значимости продуктов питания с пробиотическими свойствами.
Как известно, колбасы и сырокопченые колбасы с длительным сроком хранения занимают значительную долю в рационе питания населения, а выбор мясных продуктов с пробиотическими свойствами ограничен в виду недостаточных сведений об антагонизме действия пробиотических культур в мясном сырье, содержащем различные пищевые ингредиенты, о влиянии различных технологических факторов на выживаемость микроорганизмов, о роли и значении этих культур в формировании функционально-технологических свойств сырья и готового продукта.
Разработка объективных критериев оценки пробиотических свойств микроорганизмов, основанных на изучении их физиологических, биохимических характеристик, создает возможность для технологического использования их в производстве сырокопченых колбас.
Анализ научно-технических результатов исследований в данном направлении показывает перспективность разработок, связанных с изучением влияния условий культивирования и сохранения биоактивности пробиотических микроорганизмов под действием физических и химических факторов в ходе технологического процесса производства сырокопченых
колбас.
С точки зрения пробиотических свойств микроорганизмов большой интерес представляют пропионовокислые бактерии и бифидобактерии, которые имеют многоуровневую защиту против мутагенов среды, в связи с этим применение пробиотических микроорганизмов, обладающих высоким биотехнологическим потенциалом и антимутагенными свойствами в качестве стартовых культур в производстве сырокопченых колбас является актуальным и перспективным.
Роль стартовых культур в формировании качества сырокопченых колбас
Одним из перспективных направлений производства мясных изделий следует признать создание и использование биологически активных веществ на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
Установлено, что микроорганизмы, внесенные с заквасками, посредством ферментов изменяют структуру колбас, образуя новые вещества, способствующие улучшению качественных показателей продукта (5, 8,9,15,22,30,32,35,44,47, 51, 52, 54, 55, 67,78, 89,100,102,105,114).
Активность большинства микроорганизмов обусловлена их основными свойствами: высокой приспособляемостью к меняющимся условиям жизни, способностью быстро размножаться и широким спектром возможных биохимических реакций.
В качестве стартовых культур в основном используются нитратвосста-навливающие микрококки, гомоферментативные молочнокислые бактерии и педиококки, дрожжи и нетипичные молочнокислые бактерии в виде чистых или смешанных культур (91).
Из литературных источников известно, что при посоле мясопродуктов микрофлора играет активную роль, по крайней мере, в трех важных в технологическом отношении явлениях: стабилизации окраски, улучшении органолептических характеристик мясопродуктов и повышении сохранности (6,11,91).
Состав микрофлоры зависит от сырья, условий и режима посола. С течением времени в рассоле возрастает доля молочнокислых в общем количестве бактерий, а среди молочнокислых - число штаммов, адаптированных к условиям посола, в частности Lactobacillus plantarum и Streptococcus lactis (4,60,88).
Однако даже эти наиболее приспособленные к условиям посола штаммы не развиваются в свежих рассолах и в течение первых шести суток претерпевают только лаг-фазу с преимущественно спиртовым характером брожения. Лишь впоследствии брожение приближается к молочнокислому. Отсюда вытекает целесообразность применения в практике старых рассолов с относительно стабилизировавшейся микрофлорой. Еще более перспективно применение специально подготовленных стартовых культур или их комбинаций (58,83,85).
Молочнокислые бактерии являются биологической основой формирования колбасы как пищевого продукта, важнейшим консервирующим фактором. Посредством молочнокислых бактерий происходит осуществление биохимических превращений основных компонентов мяса с образованием соединений, обуславливающих вкус и аромат, консистенцию; изменение физико-химических параметров мясного фарша в направлении, неблагоприятном для развития микробов, которые способны вызвать порчу мяса; подавление развития технически вредной и патогенной микрофлоры путем образования различных веществ, обладающих антимикробным действием (65, 76, 83,100).
Доминирующим критерием отбора микроорганизмов в качестве стартовых культур во всем мире служит степень влияния микроорганизма на вкусоароматические характеристики готового продукта в условиях интенсификации технологий производства мясопродуктов. Общепринятыми ароматообразователями являются представители семейства микрококков и отдельные штаммы молочнокислых бактерий. Кроме того, успешное протекание технологического процесса при производстве колбас в большей степени зависит от активности используемой закваски. При составлении заквасок учитывается ряд определенных признаков молочнокислых бактерий, характеризующих их производственную ценность. Это, помимо вышеперечисленных органолептических показателей, устойчивость к поваренной соли, желчи, нитриту натрия, фенолу, который в малых концентрациях действует как протоплазматический яд, с целью получения стойких бактериальных заквасок; сочетаемость штаммов при их совместном культивировании и т. д. (97,98,100).
Скрининг ароматобразующих штаммов обычно осуществляется по степени образования так называемых предшественников аромата -карбонильных соединений с разветвленной углеродной цепью. Источником этих соединений являются аминокислоты: лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, серосодержащая аминокислота - метионин и свободные жирные кислоты (53, 54). Источники же аминокислот - полипептиды, образующиеся в большей степени в результате воздействия эндогенных ферментов мышечной ткани на белок (86).
Известно, что в результате углеводного обмена микроорганизмов образуются продукты, которые играют очень важную роль в формировании аромата. Образующиеся наряду с молочной кислотой пировиноградная, уксусная кислоты, этиловый спирт, ацетоин и другие вещества придают сырью, а впоследствии и мясопродукту долго сохраняющийся вкус и аромат. Важная роль в формировании аромата принадлежит продуктам расщепления жиров: свободным жирным кислотам и карбонильным соединениям (52, 61, 68,69,71,83,90).
Объекты исследований и постановка эксперимента
Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» Восточно-Сибирского государственного технологического университета и в колбасном цехе ОАО «Петровкс-Забайкальский мясокомбинат».
Сырьём являлись - фарш говяжий, колбасный фарш. Готовые колбасные изделия. Материалами исследований служили разные штаммы пробиотических микроорганизмов, комбинированная закваска В. longum В 339 М , P. shermanii КМ-186; замороженный комбинированный бактериальный концентрат, состоящий из P. freudenreichii subsp freudenreichii АС-2500 и В. longum В 339 М, вырабатываемые в научно-производственной лаборатории заквасок ВСГТУ согласно существующим НД на эти бакконцентраты. вырабатываемый в научно-производственной лаборатории заквасок ВСГТУ согласно ТУ 9229-007-02069473-2004 «Препараты пропионовокислых бактерий»,
Контрольные образцы сырокопченых колбас изготовляли в соответствии с ГОСТ 16131 и технологической инструкцией по производству сырокопченой колбасы «Столичная» высшего сорта с использованием стартовых культур LS-25.
Схема проведения экспериментальных исследований приведена на рисунке 1 (цифрами обозначены исследуемые показатели).
При проведении исследований использовались современные и стандартные физико-химические, биохимические и микробиологические методы.
В соответствии с поставленными задачами при исследовании сырья, промежуточного и готового продукта определяли следующие показатели - Величину активной кислотности определяли потенциометрическим методом на приборе рН 222.2. - Содержание влаги по ГОСТ 17681 -77. - Содержание хлорида натрия определяли в водной вытяжке из продукта методом Мора. Метод основан на осаждении иона хлора ионами серебра в нейтральной среде в присутствии в качестве индикатора хромата калия [30]. - Содержание нитрита определяли методом, основанным на измерении интенсивности окраски, образующейся при взаимодействии нитрита натрия с сульфаниламидом и Ы-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлоридом в безбелковом фильтрате [30]. - Определение степени окисления жира проводили по методу, основанному на окислении йодоводородной кислоты пероксидами, содержащимися в жире, с последующим оттитровыванием выделившегося йода тиосульфатом натрия [30]. - Количественный учет жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий определяли на среде ГМК-1 методом предельных разведений по ТУ 10-10-02-789-192-95.[19]
Среду готовили по следующей методике: сухую среду (50г) вносят в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют, устанавливают рН (7,1 + 0,2). Среду разливают в у пробирки высоким столбиком по (10 ± 0,5) см и стерилизуют при 121 С в течение (15±2)мин. Готовую среду перед использованием регенерируют на водяной бане путем кипячения в течение 30 мин. Охлаждают до (36 + 2)С и используют для посевов.
Для проведения качественного учета нужно в стерильных условиях, над пламенем горелки 1 см3 закваски пипеткой перенести в первую пробирку с 10 см3 среды, новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки и 1 см3 смеси из нее переносят во вторую пробирку и т.д. В общей сложности готовят не менее 10 разведений. Готовые посевы выдерживают в термостате при (35±1)С в течение 1-2 суток. По окончании выдержки подсчитывают выросшие колонии, и по количеству колоний в последнем разведении устанавливают число живых клеток.-Массовую долю жира определяли экстрагированием хлороформом. Метод основан на извлечении жира из продукта при постоянном встряхивании с последующим отделением экстракта и на определении в нем содержания высушиванием до постоянной массы.
- Для определения антимутагенной активности применяли тест Эймса, а в качестве индикатора мутагенности - тест-штамм Salmonella typhimurium ТА 100. Штамм несет мутацию ауксотрофности по гистидину и ревертирует к прототрофности под действием мутагенов, вызывающих мутации типа замены пар оснований. Принцип метода состоит в том, что под действием мутагена на селективной среде вырастают ревертанты по гистидину, по числу которых, определяют мутагенный эффект. Соответственно антимутагены снижают число индуцированных ревертантов.
Порядок проведения эксперимента состоял в следующем: в 2 мл верхнего агара, содержащего 0,5 мМ гистидина/биотина, добавляли 0,1 мл свежей культуры Salmonella typhimurium, 0,1 мл испытуемого мутагена и 0,1 мл испытуемого в качестве антимутагена образца. Смесь быстро перемешивали и выливали на поверхность минимальной агаризованной среды (нижнего агара) в чашки Петри. Путем интенсивного перемешивания достигали равномерного распределения верхнего агара на поверхности нижнего. Чашки инкубировали в течение 48ч при 37С.
Изучение биотехнологического потенциала пробиотических микроорганизмов
Как было отмечено в литературном обзоре пропионовые и бифидобактерии являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Несмотря на очевидную практическую ценность, они остаются наименее изученными с точки зрения их использования в мясной промышленности.
Теоретической предпосылкой использования пропионовокислых бактерий для биотехнологической обработки мясного сырья является широкий температурный диапазон роста (15-30) С. Есть данные, что они растут при более низких температурах (2-7) С, оптимальное значение рН 6,5-7,0, при рН ниже 5,0 жизнеспособность снижается, они характеризуются достаточно высокой устойчивостью к соли. При метаболизме пропионовокислых бактерий образуются пропионовая и уксусная кислоты, обладающие консервирующими свойствами. От других брожений они отличаются высоким выходом АТФ, участием некоторых уникальных ферментов и реакций, они восстанавливают нитриты при утилизации лактата, обладают высокими антимутагенными свойствами (18,20,103,133,154).
Несмотря на уникальные свойства, пропионовокислые бактерии пока не нашли широкого применения в мясной промышленности из-за недостаточности сведений о механизме их проявления в мясном субстрате. Работа Нефедовой Н.В. (66, 70) ограничена изучением влияния пропионовокислых бактерий в биомодификации свойств мясного фарша и микробиологическими исследованиями сырья при посоле и готовых продуктов при хранении. Что касается других свойств - устойчивости к физическим и химическим факторам при культивировании их в мясной системе, проявление антимутагенной активности сведений в литературе не обнаружено.
С учетом вышеизложенного представляет интерес разработка новых подходов к выбору пробиотических микроорганизмов для биотехнологической обработки сырья, отвечающей специфическим требованиям технологических процессов производства мясных продуктов.
Для выбора наиболее перспективных штаммов пробиотических микроорганизмов изучали их биотехнологический потенциал. Для исследований были использованы различные штаммы моно и поликультур пропионовокислых и бифидобактерий, а также комбинированные закваски.
Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности способны продуцировать вещества, к которым относятся экзополисахариды (ЭПС). Пропионовокислые бактерии синтезируют вязкие ЭПС в окружающую среду (3, 17), которые, на наш взгляд, будут участвовать в формировании функционально-технологических свойств и структурообразовании мясного фарша. В этой связи, концентрация ЭПС и вязкость выбраны как одни из важных показателей при подборе культур для практического применения. О биоактивности пробиотических культур судили по количеству жизнеспособных клеток, свидетельствующему о состоянии популяции микроорганизмов, и удельной скорости роста, характеризующей состояние клетки. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Анализ полученных результатов показывает, что все представленные микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью, о чем свидетельствует количество жизнеспособных клеток 1010-10иКОЕ/см3.
Комбинированная закваска, состоящая из Bifidum longum 339М, P. freudenrechii subsp freudenreichii AC-2500 имеет высокую удельную скорость водосвязывающей способности сырокопченых колбас в целях быстрого удаления влаги из продукта. Как известно, комбинированные закваски обладают большей биохимической активностью по сравнению с монокультурами. Эти данные можно учесть для мясных продуктов с низкой влажностью.
Трехштаммовая культура пропионовокислых бактерий также имеет достаточно высокую удельную скорость роста - 0,54 ч и умеренную вязкость, поэтому их можно использовать для производства мясных продуктов с промежуточной влажностью.
Результаты исследований послужили основой для разработки нового подхода, позволяющего реализовать свойства пропионовокислых бактерий в технологии сырокопченых колбас.
Данный подход применен в дальнейших исследованиях при разработке технологии сырокопченых колбас с пропионовокислыми бактериями.
На основании полученных результатов можно констатировать, что исследуемые культуры имеют высокий биотехнологический потенциал, с учетом которого можно подбирать микроорганизмы в соответствии с требованиями технологического процесса производства сырокопченых колбас.
Сенсорная оценка сырокопченых колбас с пробиотическими свойствами
Качество мясных изделий в значительной степени определяется их вкусом и ароматом.
Специфический вкус и приятный аромат сырокопченым колбасам придает образующийся в процессе их производства сложный комплекс химических веществ. Также известно, что в сырокопченых колбасах летучие вещества образуются главным образом в результате протеолитических, окислительных, микробиологических процессов и за счет веществ пряностей и коптильного дыма (56, 82). Применение бактериальных стартовых культур создает хорошие предпосылки для получения сырокопченых колбас с разнообразными вкусовыми и ароматическими свойствами. В результате углеводного обмена микроорганизмов образуются продукты, которые играют очень важную роль в формировании аромата. Образующиеся наряду с молочной кислотой пировиноградная, винная, уксусная, пропионовая кислоты, этанол, ацетоин и другие вещества придают мясному продукту долго сохраняющийся вкус и аромат. Важная роль в формировании аромата принадлежит продуктам расщепления жиров: свободным жирным кислотам и карбонильным соединениям (7,44, 51, 52, 57, 67).
С целью изучения влияния комбинированного бакконцентрата на процессы формирования вкуса и аромата сырокопченых колбас был определен качественно-количественный состав летучих компонентов.
В таблице 11 приведен перечень идентифицированных летучих соединений, величины их индексов удерживания (ИУ) и концентрация относительного содержания. В концентрате летучих веществ исследованных колбас зарегистрировано 150 веществ, 85 из них идентифицировано. Основными летучими компонентами исследуемых образцов колбас являются алифатические насыщенные и ненасыщенные альдегиды, спирты, кетоны, жирные кислоты, которые всегда присутствуют в мясных продуктах. Второй группой веществ являются терпены, источником этих соединений являются в основном пряности. Также в образцах колбас найдены производные фенола, которые являются компонентами коптильного дыма.
Сравнение полученных данных по составу двух образцов колбас показало, что их качественный состав не одинаков, найдены значительные различия и в количественном содержании многих летучих соединений. В опытном образце найден ряд веществ, отсутствующих в контроле, таких как а-Туейн, п-Цимен, -Терпинен, фенилэтиловый спирт, триметоксибензол
Важнейшую роль в образовании аромата играют карбонильные соединения - альдегиды, кетоны и др. Как видно из таблицы 12, содержание альдегидов в опытном образце больше на 30 % по сравнению с контролем, а по содержанию кетонов разница составила 17 %. В основном своем составе карбонильные вещества представлены высокомолекулярными соединениями, которые имеют приятный запах.
По содержанию веществ фенольного ряда опытные образцы превосходят контрольные в 2 раза. Например, отмечено большое содержание а -Фелландрена, З-Карена, гваякола, метилгваякола.
Известно, что коптильные вещества, помимо придания продукту запаха копчения, осуществляют антиокислительную защиту стартовых культур от нитроксильного радикала (16). Следует отметить, что коптильные вещества обладают консервирующими свойствами, что имеет большое значение для сырокопченых колбас при длительном хранении.
Содержание эфиров и карбоновых кислот в исследуемых образцах примерно одинаковое.
Необходимо отметить разницу в 3,5 раза по содержанию терпенов между опытным образцом и контролем. Известно, что одним из основных продуктов бифидоброжения и пропионовокислого брожения является уксусная кислота. В форме ацетил - КоА уксусная кислота является предшественником не только жирных кислот, но и терпенов - неомыляемых липидов, молекулы которых построены путем объединения нескольких молекул пятиуглеродного углеводорода изопрена. Как показали исследования, в опытных образцах обнаружено большое количество терпенов. Многие из них придают сырокопченым колбасам свойственный аромат специй. К примеру, /?-Пинен в опытном образце превышает контрольный в 22 раза, /?-Мирцен - в 6 раз, аг-Терпинен - в 2 раза, линалоол - в 2,5 раза.
