Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
1.1. Получение и очистка белковых гидролизатов 13
1.1.1. Основные принципы получения белковых гидролизатов 14
1.1.2. Подходы к описанию механизма гидролиза белков 20
1.1.3. Очистка белковых гидролизатов 24
1.1.4. Заключение 28
1.2. Физико-химические свойства белковых гидролизатов 28
1.2.1. Растворимость и термостабильность 31
1.2.2. Эмульгирующие свойства 32
1.2.3. Реологические свойства 34
1.2.4. Осмолярность продуктов, содержащих белковые гидролиз аты 35
1.2.5. Методы улучшения вкусовых качеств пищевых гидролизатов 1.2.5.1. Селективное отделение горьких пептидов 37
1.2.5.2. «Маскировка» горького вкуса 38
1.2.5.3. Ферментативная обработка гидролизатов экзопротеазами 39
1.2.6. Заключение 39
1.3. Применение белковых гидролизатов 40
1.3.1. Использование белковых гидролизатов в медицине 40
1.3.2. Применение белковых гидролизатов в пищевой промышленности 43
1.3.3. Применение белковых гидролизатов для получения комбинированных кормов 47
1.3.4. Использование гидролизатов в микробиологической промышленности 50
1.3.5. Заключение 52
Глава 2. Экспериментальные исследования. Объекты и методы 54
2.1. Объекты исследований 54
2.2. Методы исследований з
2.2.1. Ферментные препараты из поджелудочной железы млекопитающих и изучение их свойств 56
2.2.1.1. Определение оптимального коэффициента разбавления суспензии поджелудочной железы 56
2.2.1.2. Определение температурного оптимума действия комплекса протеаз поджелудочной железы
и определение термостабильности 57
2.2.1.3. Определение рН-оптимума ферментного комплекса поджелудочной железы 57
2.2.1.4. Определение гидролизующей способности ферментного препарата из поджелудочной железы в сравнении с панкреатином 58
2.2.1.5. Определение активности ферментного препарата СПЖ в промышленных условиях 58
2.2.2. Ферментативный гидролиз мясокостного фарша. 59
2.2.2.1. Обезжиривание мясокостного фарша и получение субстрата для ферментативного гидролиза 59
2.2.2.2. Определение оптимального соотношения фермента к субстрату 60
2.2.2.3. Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза 60
2.2.3. Сернокислотный гидролиз отходов мясо- и птице перерабатывающей промышленности 61
2.2.3.1. Определение оптимальной концентрации гидролизующего агента 62
2.2.3.2. Определение кинетических параметров кислотного гидролиза
2.2.4. Аминокислотный анализ белковых субстратов и гидролизатов 63
2.2.5. Определение содержания общего азота 64
2.2.6. Определение содержания триптофана в присутствии других аминокислот 65
2.2.7. Количественное определение содержания пептидной фракции в получаемых гидролизатах 65 2.2.8. Гидролиз многокомпонентной смеси белковых субстратов ферментами различной субстратной
специфичности 66
Глава 3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Изучение возможности применения суспензии поджелудочной железы убойных животных для гидролиза белка 69
3.1.1 Изучение активации ферментного комплекса суспензии поджелудочной железы млекопитающих 69
3.1.2 Эффективность использования ферментных препаратов суспензии поджелудочной железы по сравнению с панкреатином 76
3.2. Изучение ферментативного гидролиза вторичного сырья
мясоперерабатывающей промышленности 78
3.2.1. Подготовка мясокостного сырья к гидролизу 78
3.2.2. Выбор соотношения между ферментом и субстратом..82
3.2.3. Изучение кинетических характеристик гидролиза обезжиренного мясокостного сырья ферментным комплексом суспензии поджелудочной железы 83
3.2.4. Влияние сочетания различных видов белковых субстратов и ферментных препаратов на сбалансированность аминокислотного состава гидролизатов 1 3.2.4.1. Сочетанный гидролиз суспензии МКС ферментами СПЖ и протосубтилином 104
3.2.4.2. Применение биомассы пивных дрожжей для увеличения степени конверсии белков МКС и улучшения аминокислотного состава гидролизатов 107
3.2.4.3. Обогащение ферментативных гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет белков крови и пивных дрожжей 109
3.3. Изучение кислотного гидролиза субстратов, содержащих коллаген и кератин 114
3.3.1. Выбор оптимальной концентрации гидролизующего агента 114
3.3.2. Изучение кинетических особенностей сернокислотного гидролиза мясокостного остатка после ферментативного гидролиза 117
3.3.3. Изучение кинетических особенностей сернокислотного гидролиза рогокопытного сырья 124
3.3.4. Изучение кинетических особенностей сернокислотного гидролиза перопуховых отходов 127
Глава 4. Разработка и масштабирование технологического процесса получения гидролизатов и его апробация в промышленных условиях 137
Глава 5. Применение ферментативных гидролизатов в микробиологии 150
Заключение 154
Выводы 157
Список литературы
- Подходы к описанию механизма гидролиза белков
- Ферментные препараты из поджелудочной железы млекопитающих и изучение их свойств
- Сернокислотный гидролиз отходов мясо- и птице перерабатывающей промышленности
- Обогащение ферментативных гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет белков крови и пивных дрожжей
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из основных задач современности является вовлечение в сферу производства дополнительных источников сырья, создание комбинированных продуктов пищевого, медицинского и микробиологического назначения с оптимальным соотношением биологически активных веществ. Большими резервами увеличения выработки таких продуктов располагает мясная промышленность. Учитывая реальную ограниченность имеющихся природных ресурсов, актуальна разработка прогрессивных технологий, обеспечивающих максимальное использование белка животного происхождения.
В настоящее время большое внимание стали уделять рациональному использованию малоценных продуктов убоя и переработки скота для получения белковых гидролизатов, которые находят широкое применение в пищевой промышленности и медицине в качестве продукта для восстановления белкового баланса в организме, снижения явлений интоксикации и повышения активности иммунной системы, а также в производстве кормов и микробиологических сред.
Рациональное использование вторичного сырья мясной промышленности может привести не только к значительной экономии материальных ресурсов, но и позволит создать безотходные технологии, способствуя оздоровлению окружающей среды.
Работа проводилась с учетом трудов Горбатова В.М., Рогова И.А., Липатова Н.Н., Файвишевского МЛ., Сницаря А.И., Лимонова Г.Е., Гаевого Е.В., Волика В.Г., Либермана С.Г., и др., посвященных проблеме использования непищевых отходов мясной промышленности и изучению их биологической и питательной эффективности. Решение задач, поставленных в работе, основано на фундаментальных исследованиях в области гидролиза белка, выполненных Беликовым В.М., Ке-стнером А.И., Богатковым СВ., Неклюдовым А.Д., Латовым В.К., Крыловым И.А., Иванкиным А.Н. и др.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является создание технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающих предприятий, способных найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.
Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих задач:
Изучить протеолитическую активность и термостабильность комплекса ферментов суспензии поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота, определить эффективность ее использования в качестве ферментного препарата для гидролиза белков.
Определить параметры предварительной подготовки мясокостной сырья для ферментативного гидролиза.
Вычислить кинетические параметры процесса гидролиза белкої мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы, изучиті закономерности высвобождения отдельных аминокислот из полипептидных цепей.
Изучить возможность повышения степени конверсии белков мясокостного сырья в результате дополнительного гидролиза прото-субтилином и протеазами дрожжей рода Saccharomyces, и обогащения аминокислотного состава гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет сочетания различного белкового сырья.
Вычислить кинетические параметры кислотного гидролиза остаточных белковых компонентов и кератинсодержащего сырья. Изучить особенности накопления и деструкции аминокислот в процессе термохимической деградации белков.
Разработать лабораторную схему комплексной переработки вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности в амино-кислотно-пептидные смеси, способные найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.
Провести масштабирование процесса ферментативного гидролиза мясокостного сырья и разработать технологию промышленного получения ферментативных гидролизатов.
Научная новизна. Определены параметры температурной активации ферментного комплекса поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота как технологического сырья для ферментативного гидролиза. Установлены кинетические закономерности накопления свободных аминокислот в процессах гидролиза белков мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы свиней и сернокислотного гидролиза коллаген- и кератинсодержащего сырья. Определены условия повышения степени конверсии белка за счет применения ферментных препаратов с различной субстратной специфичностью. Установлено влияние сочетания различных видов сырья на сбалансированность аминокислотного состава гидролизатов.
Практическая ценность работы. Результаты научных исследований использованы при разработке промышленной технологии ферментативного гидролиза мясокостного сырья. Разработана нормативная документация, включающая технологический регламент на производство сухого гидролизата мясокостного фарша, утвержденный ВНИ-ИМПом в 1997 г. и технические условия ТУоп 6-09-10-0002-06-99 «Мясокостный гидролизат сухой», утвержденные ОАО «Мясокомбинат Раменский» 29 июня 1999 г. 2
Технология апробирована в цехе технических фабрикатов ОАО
«Мясокомбинат Раменский». Полученные гидролиза рекомендова
ны к использованию в составе питатёльныхсред для роста микроорга
низмов.
Новизна предложенной технологии подтверждена тремя патентами
РФ.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на конференциях; «Лечебно-профилактическое и детское питание» (С.-Петербург, 1996 г.), «Прогрессивные экологически безопасные технолопіи хранения и переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» (г.Углич, 1996 г.), на 43-м Международном конгрессе ICOMST (Окленд, Новая Зеландия, 1997 г.), на конференциях в Москве в 1999 г.: «Пища. Экология. Человек», «Химия и биотехнология пищевых веществ» (к 100-летию со дня рождения А.Н.Несмеянова), «Проблемы фундаментальных исследований в области обеспечения населения России здоровым питанием».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, технологической части, результатов проверки применения продуктов в микробиологии, выводов, списка литературы и приложений.
Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу, 18 рисунков, библиография включает 200 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.
Подходы к описанию механизма гидролиза белков
Общепризнанными являются следующие основные способы осуществления гидролиза : ферментативный , кислотный и фер-ментативно-кислотный. Щелочной гидролиз белков используют существенно реже из-за значительной рацемизации и разрушения аминокислот и пептидов в щелочных растворах при высоких значениях рН [49, 75, 90, 148].
Для получения белковых гидролизатов с низкой и средней степенью конверсии белка могут быть использованы ферменты как животного, так и микробного происхождения [30, 46]. Из ферментов животного происхождения чаще всего используют пепсин, трипсин, а-химотрипсин, карбокси- или аминопептидазы в индивидуальном виде или в виде смесей ферментов, примерами которых может служить панкреатин, широко используемый как в медицине, так и в пищевой промышленности, а также плазмин и сычужные ферменты [82, 104, ПО, 119, 157, 171, 190, 199]. Причем наиболее близки по свойствам к ферментам желудочно-кишечного тракта человека ферменты, выделяемые из организма свиней [66, 151].
Из ферментов микробного происхождения чаще всего используют бактериальные и грибные протеазы. Последние, являясь в большинстве случаев смесью нескольких ферментов, обладают более широкой субстратной специфичностью и обеспечивают, как правило, более глубокую степень гидролиза белка [84, 121, 126, 145, 198]. Для получения белковых гидролизатов с низкой степенью конверсии обычно используют эндопептидазы: пепсин, трипсин или комплекс сериновых протеиназ типа протосубтилина [199].
При необходимости увеличить степень конверсии белка до 15-50 % отдают предпочтение панкреатину или комплексу протеаз грибного происхождения, содержащих экзопептидазы, например таких, как проназа или протеаза С [60, 65, 113, 123-125].
Применение свиного пепсина позволяет получать гидролизаты белков молока и крови со степенью конверсии 5-10 % , что в ряде случаев снижает их аллергенные свойства и позволяет использовать в качестве основы для создания продуктов детского питания [101, 160, 174] .
Для получения белковых гидролизатов с различной степенью конверсии могут быть использованы не только нативные , но и иммобилизованные ферменты [37, 39, 75]. Однако использование иммобилизованных ферментов дает определенный эффект при гидролизе водорастворимых белков в средах с концентрациями субстратов не более 3-4 % и практически не эффективно при гидролизе концентрированных растворов (7-10 %) или при гидролизе нерастворимых в воде белков , например сои или мяса [75]. Как свидетельствуют литературные данные, положительный эффект, связанный с сокращением расхода реагентов и приближением условий процесса к температурному оптимуму, в этом случае могут давать ферменты , иммобилизованные на полиэлектролитных полимерных матрицах , например на карбоксиметилцеллюлозе [65, 39, 64]. В связи с этими обстоятельствами, несмотря на кажущуюся экономическую и технологическую эффективность использования иммобилизованных биокатализаторов , их применение оказалось весьма ограниченным для получения гидролизатов с различной сте 16 пенью конверсии белка и практически непригодным для переработки отходов пищевой и сельскохозяйственной продукции.
Таким образом, те надежды, которые возлагались в 60-70-е годы на использование иммобилизованных ферментов для получения белковых гидролизатов с различной степенью конверсии, не оправдались на практике и оказались полезны, главным образом, для трансформации низкомолекулярных соединений: ацил-аминокислот, пептидов, стероидов, антибиотиков, олигосахаридов и т.п. [75, 21].
С точки зрения ряда исследователей более перспективной заменой иммобилизованным ферментам является совмещение процесса гидролиза белков с одновременной ультрафильтрацией [150, 153]. В этом случае продукты гидролиза удаляются из реакционной смеси, а сам фермент и гидролизуемый белок остаются в последней, что позволяет не только контролировать степень конверсии белка в смеси аминокислот и пептидов, но и существенно уменьшить процесс ингибирования ферментов продуктами гидролиза. В зависимости от пористости мембран можно в определенной степени регулировать молекулярно-массовое распределение продуктов гидролиза, прошедших через мембраны, что особенно важно для получения белковых гидролизатов со средней степенью конверсии белка, содержащих наиболее легко усваиваемые в желудочно-кишечном тракте пептиды с молекулярной массой от 1 до 10 кДа . В настоящее время существуют многочисленные конструкции биореакторов, предназначенные для этих целей [122, 131, 132, 197]. Подобное совмещение позволяет использовать не только нативные, но и частично сшитые стабилизированные ферменты, а также биокатализаторы, иммобилизованные на полиэлектролитных комплексах [97].
По сути дела в этом случае мы имеем дело с техническим моделированием функций желудочно-кишечного тракта, в частности с функцией гидролитического расщепления и всасывания (удаления) продуктов гидролиза из реакционной (перевариваемой) смеси в условиях достаточно эффективного удаления веществ, ингибирую-щих ферменты.
Недостатком такого метода гидролиза является низкая концентрация продуктов гидролиза в растворе, прошедшем через мембраны, требующего последующего концентрирования раствора при помощи вакуумного выпаривания или обратного осмоса [165].
В последнее время в качестве перспективных биокатализаторов для гидролиза используют ферменты из термофильных микроорганизмов, так как в этом случае гидролиз можно проводить при 65-70 С, что, с одной стороны, сокращает время проведения процесса, а, с другой стороны, обеспечивает пастеризацию реакционной смеси и вследствие этого существенное уменьшение содержания микрофлоры [117].
Следует особо отметить актуальность гидролиза так называемых «вторичных отходов» мясной и молочной промышленности, так как после получения различных изделий пищевого назначения остается около 50 % белковых отходов, которые требуют обязательной утилизации как с экологической, так и с практических точек зрения [22, 23, 45, 72, 74].
Ферментные препараты из поджелудочной железы млекопитающих и изучение их свойств
Для определения оптимальной концентрации гидролизующего агента гидролиз проводили растворами серной кислоты с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50 и 60% в течение 7 часов при температуре 120 С, измеряя по окончании процесса концентрацию азота концевых аминогрупп аминокислот и низших пептидов формольным титрованием и содержание в гидролизатах свободных аминокислот. Оптимальной считалась концентрация серной кислоты, при которой за 7 часов процесса наблюдалась 80-90% степень гидролиза белка в сочетании с минимально возможным разрушением лабильных аминокислот.
В экспериментах по определению кинетических параметров кислотного гидролиза использовали 50%-ный водный раствор серной кислоты. Гидролиз проводили 24 часа при температурах 100, ПО, 120С. При этом в течение первых 7 часов гидролиза ампулы поочередно вынимали через каждые 60 мин, охлаждали на воздухе, и в полученных гидролизатах определяли содержание азота концевых аминогрупп формольным титрованием и аминокислотный состав.
Для определения аминокислотного состава гидролизаты фильтровали через бумажный складчатый фильтр для освобождения от непрогидролизованных остатков и гуминовых веществ, центрифугировали при 5000 G и 20 С в течение 20 минут. К 200 мкл супернатанта добавляли 1 мл дистиллированной воды, нейтрализо 63 вали IN NaOH до рН 2,2 и центрифугировали при 14000 G и 4 С в течение 20 минут. 400 мкл супернатанта разбавляли нитратным буфером (рН 2,2) до объема 10 мл. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и помещали в пластиковую пробирку вместимостью 200 мкл для последующего аминокислотного анализа.
В случае определения аминокислотного состава твердых белковых субстратов навески измельченных образцов подвергали исчерпывающему кислотному гидролизу, действуя 6 М соляной кислотой при температуре ПО + 1 С в среде инертного газа, аналогично методике Мура и Стейна [184].
Для определения аминокислотного состава смеси белков водной суспензии, полученной в результате обезжиривания мясокостного фарша, 20 мл водной суспензии концентрировали под вакуумом при температуре 55-60С на роторном испарителе. Навески сухого остатка массой по 50 мг помещали в ампулы, и подвергали полному гидролизу 6М соляной кислотой, как описано выше.
По окончании гидролиза ампулы охлаждали, гидролизат фильтровали через бумажный фильтр в круглодонные колбы, затем выпаривали под вакуумом на роторном испарителе для удаления соляной кислоты. Сухой остаток растворяли в буферном растворе с рН 2,2, включающем: цитрата натрия - 9,8 г, соляной кислоты концентрированной - 8,3 г, тиодигликоля - 1 мл, каприловой кислоты - 50 мкл, воды до 1 л.
Анализ выполняли на автоматическом аминокислотном анализаторе LC-3000 фирмы "Eppendorf Biotronic" (Германия). Для эф 64
фективного разделения аминокислот использовали четырех-буферную систему А, В, С, D со значениями рН 3,3; 3,6; 4,5 и 11,0 соответственно. Работа анализатора выполнялась по программе, предусматривающей ступенчатое изменение вида буфера и температуры хроматографической колонки на каждой стадии, длительность которой задана отдельно. Стандартное время анализа от момента ввода пробы до завершения выхода пика последней аминокислоты на аминограмме - аргинина - составляло 50 минут при скорости подачи элюента 0,22 мл/мин. Использованный метод позволял надежно определять с точностью ± 5% наличие в растворе 17 аминокислот с минимальным уровнем содержания в растворе 0,500 ± 0,006 мкМоль/мл [41, 108]. Обсчет хроматограмм проводили с использованием автоматической компьютерной программы Winpeak V 3.24" фирмы "Eppendorf Biotronic" (Германия).
Сернокислотный гидролиз отходов мясо- и птице перерабатывающей промышленности
В настоящее время отечественная и мировая промышленность выпускает различные протеолитические ферменты, которые выделяют из различных источников сырья, секретирующих ферменты. Среди них встречаются представители эндопептидаз (сериновые, тиоловые, кислые протеиназы), а также аминопептидазы и карбок-сипептидазы.
К сериновым протеиназам относятся ферментные препараты животного и микробного происхождения, такие как трипсин, химот-рипсин, проназа, римопротелин, щелочная бактериальная протеина-за, литические протеиназы и др., отличающиеся широкой специфичностью действия и разнообразием типов гидролизуемых связей [42].
К тиоловым принадлежат катепсины и такие часто применяемые в практике протеиназы растительного происхождения, как папайи, химопапаины А и В, бромелаин, фицин, наиболее быстро гид-ролизующие связи, образованные лейцином и глицином [12].
Кислые протеиназы распространены у животных (пепсин) и микроскопических грибов - аспергиллов, пенициллов, мукоров, Rhi-zopus, Trichoderma и др. Внеклеточные кислые протеиназы грибов наряду с другими видами протеолитических ферментов входят в состав комплексных препаратов из культур микромицетов, таких как амилоризин, пектаваморин, пектофоетидин, целловиридин и др. Для гидролиза белков животного происхождения наиболее хорошо зарекомендовал себя ферментный комплекс, секретируемый в поджелудочной железе млекопитающих и содержащий целый ряд ферментов различной субстратной специфичности, в частности, трипсин (КФ 3.4.21.4), химотрипсины А и В (КФ 3.4.21.1), химот-рипсин С (КФ 3.4.21.2), карбоксипептидазу (КФ 3.4.16.1). Эти ферменты составляют основу известного препарата, получившего название панкреатин. Последний широко применяется в медицинской и пищевой промышленности благодаря его широкой субстратной специфичности и способности гидролизовать белки, жиры и полисахариды различного химического состава [59].
Для панкреатина изучена температурная зависимость и определены некоторые кинетические параметры его действия [65, 70]. Однако, выделение и очистка панкреатина, как любого ферментного препарата, требует ряда дополнительных химических и технологических стадий, которые существенно увеличивают стоимость продукта. В связи с этим в последние два десятилетия многие исследователи вместо индивидуальных ферментов и комплексных ферментных препаратов начали использовать животные или микробные клетки, например, для трансформации стероидов, получения отдельных аминокислот, создания ферментных электродов и др. [15, 39]. Ферментные системы нативных клеток обладают рядом преимуществ, к числу которых относятся наличие в них кофакторов (тиамина, рибофлавина, нуклеотидов и др.), а также более высокая устойчивость к изменению рН среды. Поэтому представляло интерес изучить возможность использования суспендированных клеток поджелудочной железы для гидролиза белковых субстратов.
Из литературы известно, что суспензия поджелудочной железы используется для гидролиза белков крови с последующим получением препаратов для парентерального белкового питания [6]. Однако относительно низкая активность суспензии поджелудочной железы не давала возможность за короткое время получить высокую степень расщепления белков. В связи с этим нами была предпринята попытка увеличить протеолитическую активность ферментного комплекса за счет подбора условий разбавления суспензии, и инкубирования ее при различных температурах.
За исключением единичных сообщений [40, 47], в литературе практически отсутствуют количественные характеристики активности ферментного комплекса поджелудочной железы убойных животных в различных условиях. Поэтому одной из первых задач исследования было изучение термостабильности и протеолитической активности суспензии поджелудочной железы (СПЖ) в буферных растворах.
Из приведенной таблицы видно, что, в отличие от известных литературных данных [51] максимальная протеолитическая активность наблюдалась в случае небольшого разбавления фарша поджелудочной железы водой (гидромодуль 0,50). Причем интересно отметить, что ферментативная активность СПЖ свиней на 15-50% выше, чем активность СПЖ к.р.с. Поэтому для получения белковых гидролизатов мы использовали СПЖ свиней.
В работе [51] экстрагирование ферментного комплекса поджелудочной железы и активацию проводили при низких температурах (5-7 С). Тогда как известно, что для активации ферментных систем пивных и пекарских дрожжей [95] наиболее целесообразно было инкубирование при более высоких температурах (40-50 С). В связи с этим было предпринято изучение активности ферментного комплекса СПЖ при температурах 20-65 С.
Предварительные исследования показали, что при комнатной температуре активность ферментов СПЖ свиней и крупного рогатого скота практически не изменялась в течение 2-3 сут. При температуре выше 65 С протеолитическое действие ферментного комплекса СПЖ практически прекращалось.
Последующий анализ данных по влиянию температуры на протеолитическую активность (ПА) ферментного комплекса СПЖ показал (рис. 1а), что максимальная активность ферментов, находящихся в СПЖ свиней, достигалась при 50 С через 1,5 ч и оставалась стабильной в течение 2 ч. Дальнейшее повышение или понижение температуры приводило к уменьшению ферментативной активности.
Обогащение ферментативных гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет белков крови и пивных дрожжей
Однако при этом возникал дисбаланс между изолейцином и лейцином (соотношение ИЛЕ:ЛЕИ увеличивалось с 1:4 до 1:5,3), что впоследствии могло отрицательно сказаться на биологической ценности полученного конечного продукта. Поэтому в дальнейшем было решено не увеличивать долю крови в субстрате и остановиться на соотношении белка мясокостного сырья к белку крови 1:2. Дисбаланс между изолейцином и лейцином было предложено исправить, введя в качестве дополнительного субстрата дрожжи рода Saccharo-myces carlsbergensis , т.к. известно, что их белок богат изолейцином. Кроме того, наличие достаточной ферментативной активности у биомассы дрожжей позволило использовать ее и в качестве ферментного препарата.
Условия проведения гидролиза смешанного субстрата, состоящего из суспензии мясокостного фарша и боенской крови, последовательно двумя ферментными препаратами (биомассой активированных дрожжей и суспензией поджелудочной железы) не отличались от описанных в п. 3.2.4.2. Кривая накопления азота аминогрупп в процессе сочетанного гидролиза представлена на рис. 9, а аминокислотный состав полученных продуктов приведен в табл.13 и 14. Степень конверсии белка достигла 53-55%, а выход свободных аминокислот составил 38-41%. Из табл. 14 видно, что полученный гид-ролизат характеризовался наиболее высоким индексом E/N, равным 0,75. Соотношение между изолейцином и лейцином оказалось близким к рекомендованному ФАО/В 03 и составило 1:1,8.
Подводя итог вышеизложенному, можно придти к заключению, что сочетанный гидролиз различных белковых субстратов ферментами биомассы пивных дрожжей и поджелудочной железы дает ощутимый прирост азота аминогрупп и свободных аминокислот в гидролизате. В зависимости от выбранных источников сырья и их соотношения между собой и дрожжевой биомассой можно получать продукты с желаемым аминокислотным составом. Так, в нашем случае наиболее эффективным явилось использование в качестве субстрата смеси мясокостного сырья, боенской крови и активированной биомассы пивных дрожжей в соотношении 1:2:0,75 (по белку). Гидролиз такой смеси целесообразно проводить в две ступени: ферментами дрожжевой биомассы и ферментами СПЖ, соблюдая условия оптимальной работы для каждого ферментного комплекса.
После ферментативного гидролиза мясокостного фарша или его сочетания с кровью и дрожжевой биомассой и фильтрации гид-ролизата остается значительное количество твердых отходов. Как показал анализ, последние содержат до 50 % белка в пересчете на сухое вещество и могут быть использованы для производства мясокостной муки или же для получения кислотного гидролизата. Последний вариант реализации остатка представляется наиболее интересным, так как позволяет получать гидролизаты с высокой степенью конверсии, способные найти применение в самых разнообразных отраслях промышленности (см. п. 1.3).
В качестве гидролизующего агента целесообразно применение серной кислоты. Во-первых, при нейтрализации сернокислотного гидролизата гидроксидом кальция образуется твердый сульфат кальция, на котором сорбируются частично гидролизованные белковые компоненты. В таком виде полученный осадок можно использовать в качестве пищевой добавки для откорма птиц. Во-вторых, серная кислота не является летучей и в меньшей степени вызывает коррозию аппаратуры, чем другие минеральные кислоты.
Для выбора оптимальной концентрации гидролизующего агента был проведен ряд экспериментов. Мясокостный остаток после ферментативного гидролиза подвергали гидролизу растворами серной кислоты различной концентрации (см. п. 2.2.3.1)
Результаты эксперимента представлены на рис. 10 - 12. Из рис: 10 видно, что наибольшее суммарное содержание аминокислот в гидролизате мясокостного остатка наблюдалось при концентрации серной кислоты 50% (масс.) и составляло около 60 г/л, что соответствует степени конверсии белка 96-97%. Увеличение концентрации гидролизующего агента до 60% не приводило к увеличению суммарного выхода аминокислот.
При использовании для гидролиза мясокостного остатка 50% раствора серной кислоты наблюдался наибольший выход глицина, аланина, пролина, аспарагиновой и глутаминовой кислот (рис. 11). Аналогичные зависимости были получены для лейцина, изолейцина, валина, аргинина, треонина, фенилаланина.
Одновременно увеличение концентрации кислоты приводило к деструкции метионина, цистина, гистидина, и серина (рис. 12), причем гистидин начинал разрушаться при концентрациях гидролизующего агента выше 20%), серии - при концентрациях выше 50%, метионин и цистин - при концентрациях выше 40%).
