Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Аналитический обзор литературы
1.1. Источники, строение и состав кератинов 15
1.2. Сбор и обработка кератинового сырья 32
1.3. Ферментные препараты в переработке белкового сырья: источники, специфичность, получение и применение 45
1.4. Основные направления использования кератиновых гидролизатов 71
1.5. Современные теории и концепции питания. Роль белков и белковых препаратов в питании человека 75
Глава II. Материалы, методы и объекты исследований
2.1. Объекты исследований 91
2.2. Условия выполнения и принципиальная схема исследований 103
2.3. Общие методы исследований 105
2.4. Специальные методы исследований (микробиологические, биологические, хроматографические, спектроскопические, математические) 106
Глава III. Исследование условий получения усвояемых форм кератиновых белков на основе ферментной биомодификации
3.1. Выбор и характеристика ферментного препарата для гидролиза кератинов 119
3.2. Изыскание условий предварительной обработки кератинов в водных средах с использованием химических реагентов 131
3.3. Исследование и оптимизация ферментативного гидролиза кератинов 152
Глава IV. Функционально-технологические свойства в составе пищевых сред и токсикологическая оценка белковых продуктов на основе модифицированных кератинов 201
4.1. Характеристика состава и биологическая ценность биомодифицированного кератина
4.2. Исследование физико-химических и биохимических свойств кератинового гидролизата
4.3. Разработка гипотетической модели структуры кератинового гликопротеина
4.4. Исследование функционально-технологических свойств биомодифицированного кератина
4.5. Токсикологическая оценка кератинового гидролизата
Глава V. Исследование условий биоконверсии кератинсодержащего сырья живой культурой Streptomyces fradiospiralis вкм А -157
5.1. Исследование условий биоконверсии кератинсодержащего сырья живой культурой продуцента 260
5.2. Исследование влияния различных факторов на степень биоконверсии кератинов 272
5.3. Определение биологической ценности микробной биомассы Streptomyces fradiospiralis в опытах in vivo 284
Глава VI. Разработка практических рекомендаций и частных технологий получения функциональных продуктов на основе модификации кератинов
6.1. Разработка структурной схемы здоровья и долголетия человеческого организма 287
6.2. Применение биомодифицированных кератинов в технологии получения экструзионных продуктов функционального назначения 329
6.3. Рекомендации по применению кератиновых продуктов в отраслях народного хозяйства 338
Общее заключение 343
Выводы 346
Список использованных источников 349
Приложения 383
- Ферментные препараты в переработке белкового сырья: источники, специфичность, получение и применение
- Специальные методы исследований (микробиологические, биологические, хроматографические, спектроскопические, математические)
- Изыскание условий предварительной обработки кератинов в водных средах с использованием химических реагентов
- Разработка гипотетической модели структуры кератинового гликопротеина
Введение к работе
Мировые тенденции в области питания связаны с созданием ассортимента продуктов, способствующих улучшению здоровья при ежедневном потреблении в составе рациона функциональных продуктов. В последнее время популярность здоровой пищи сильно возрасла. Рынок функциональных продуктов в настоящее время достигает 3,6 млн т и имеет тенденцию к дальнейшему увеличению [126]. Функциональные продукты определяются тремя основными качествами: пищевая ценность, вкусовые качества и физиологическое воздействие.
Уравнение «здоровье есть функция питания» является базовым для современной пищевой науки. Научный подход к проблеме обеспечивается исследованиями ученых в области химии, биохимии, физики продуктов питания, а также диетологии и медицинской профилактики.
Поскольку процесс питания является функцией взаимосвязи человека с окружающей средой, пища должна способствовать адаптации организма человека к неблагоприятным внешним условиям и помимо основной функции -удовлетворения физиологических потребностей организма человека в пищевых веществах и энергии - должна выполнять профилактические задачи.
Идея улучшения здоровья населения путем создания условий для рационального здорового питания получила официальное признание в Российской Федерации с появлением концепции государственной политики в этой области [121].
Начат выпуск отечественных продуктов питания, обогащенных функциональными ингредиентами. В производстве продуктов функционального питания применяют более 50 видов разнообразного сырья растительного и животного происхождения [116]. Их широкая реклама способствует внедрению в сознание потребителей идей позитивного питания. Концепция позитивного питания включает разработку теоретических основ производства, реализацию и потребление функциональных продуктов.
Освоение позитивного питания в условиях Российской Федерации нуждается в форсированном изучении указанных аспектов независимо от социальных и рыночных условий. Питание считается одним из факторов, определяющим физическое и умственное развитие человеческого организма. Основным поставщиком белкового питания традиционно является мясная промышленность.
Огромный вклад в развитие теории и практики создания мясопродуктов специализированного назначения внесли представители ряда отечественных научных школ: Л.В. Антипова, А.П. Джангиров, Г.И. Касьянов, Л.С. Кудряшов, К.С. Ладодо, Н.Н. Липатов, А.Б. Лисицын, И.А. Рогов, Н.В. Тимошенко, Э.С. Токаев, А.В. Устинова, М.Л. Файвишевский, СБ. Юдина и др.
Применимость белков в получении различных функциональных продуктов связано с их функционально-технологическими свойствами, которые зависят от природы и концентрации биополимеров и низкомолекулярных веществ в пищевых системах, температуры, рН.
С целью повышения функционально-технологических свойств и снижения себестоимости продукции предприятия мясной промышленности стали активно использовать белки растительного и животного происхождения. Однако недостатки растительных белков известны и связаны, главным образом, с наличием лимитирующих биологическую ценность аминокислот и ограничениями по органолептическим свойствам.
Последние разработки ученых в России и за рубежом связаны с получением препаратов белков животного происхождения. Их ассортимент достаточно широк и базируется на источниках: кровь промышленных животных, соединительная ткань, молоко и молочная сыворотка и другие [213]. Экономическая целесообразность и аминокислотный состав кератиновых белков позволяют положительно оценить перспективы использования этих малоценных вторичных продуктов мясной отрасли.
Актуальность проблемы. Актуальность проблемы переработки кера-тинсодержащего сырья биотехнологическими методами вызвана целым рядом неотложных задач, остро стоящих перед мясной промышленностью:
недостаток пищевого и кормового белка в мировом производстве;
необходимость рациональной переработки вторичного сырья в мясной промышленности;
перераспределение в последнее десятилетие источников вторичного кератинсодержащего сырья в связи с сокращением поголовья скота и увеличением поголовья птицы в России;
увеличение массовой доли малоценного сырья от бройлеров, непригодного для производства перо - пуховых изделий и, как следствие, ухудшение экологической обстановки;
ограничение производственных мощностей по переработке кератинсодержащего сырья гидротермическим и химическим способами;
незначительные объемы отечественного производства комбикормов с применением промышленных кератиновых продуктов гидротермического способа (перьевая и рого - копытная мука) ввиду низкой степени их усвояемости организмом животных;
развитие сферы производства функциональных продуктов питания и широкое распространение пищевых добавок при отсутствии или ограниченном ассортименте с высокой жироудерживающей способностью;
увеличение спроса на натуральные компоненты из сырья животного происхождения в связи с интенсивным подъемом отечественной косметической промышленности.
Работа является составной частью НИР кафедры технологии мяса и мясных продуктов ВГТА в рамках федеральных грантов "Теория и практика продуктов лечебно-профилактического и специального назначения на основе рационального использования вторичного сырья мясной и птицеперерабатывающей промышленности" (1996-1997 гг.) и "Разработка теоретических аспектов биотехнологических процессов в создании биопрепаратов специального назначения на основе рационального использования второстепенных белковых ресурсов»( 1996-1999 гг.); НТП Министерства образования РФ "Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и
техники", подпрограмма "Технологии живых систем" по теме 204.01.014 (2000-2002 гг.), НТП «Пища. Экология. Человек», подпрограмма «Биологическая безопасность и лечебно-профилактическое питание» (1998-2000 гг.); ИНТП «Технология экологического прогнозирования, мониторинга и рационального природопользования» по теме «Разработка и внедрения комплексной системы обеспечения производства лечебно-профилактических и специальных препаратов, экологической безопасности продуктов на основе сырьевых ресурсов перерабатывающих отраслей АПК» (1998-2000 гг.).
Тема диссертации соответствует плану госбюджетных НИР кафедры технологии мяса и мясных продуктов ВГТА "Разработка технологии и оборудования биологически полноценных экологически чистых мясных продуктов на основе рационального использования ресурсов" (1991-2000 гг.) и "Теоретические и практические аспекты производства биологически полноценных, лечебно-профилактических и функциональных продуктов питания на основе биотехнологий и рационального использования сельскохозяйственного сырья" (2001-2003 гг.); в рамках хоздоговорных научно-исследовательских тем, выполняемых по заказу ЗАО НПО «Техкон» (Солнечногорский район Московской области) и ОАО «Крекер» г. Воронежа.
Целью работы является разработка концептуальных подходов и методологии получения биомодифицированных кератинов с заданными функционально -технологическими свойствами.
Для решения поставленной цели были сформулированы и решались следующие основные задачи:
разработка подходов и способов переработки кератинового сырья методами биомодификации и биоконверсии живой культурой микроорганизма;
осуществление системного анализа специальных требований к вторичному кератинсодержащему сырью, фракционному и компонентному составу, молекулярному массе и функционально-технологическим свойствам биомодифицированных продуктов;
обоснование перспективных направлений использования биомодифи-цированных кератинов для производства продуктов в пищевой, косметической и кормовой промышленности;
обоснование и разработка методологии оценки качественных и количественных характеристик биомодифицированных кератиновых продуктов;
разработка и совершенствование на основе полученных научных данных и реализация в производственных условиях перспективных технологий, обеспечивающих повышение выхода и качества, органолептических показателей и функционально-технологических свойств биомодифицированных кератинов.
Научная концепция работы состоит в адаптировании биокаталитических процессов к целенаправленной трансформации кератинов на основе установления их структурных особенностей и физико - химических свойств модифицированных продуктов с целью получения кормовых, косметических препаратов и пищевых продуктов.
Научные положения, выносимые на защиту:
структурная и биохимическая характеристика кератинов и продуктов их биомодификации;
подходы к целенаправленной модификации кератинов на основе ферментации и управляемого биокатализа;
оценка технологической и биологической функциональности модифицированных кератинов;
методологические принципы и обоснование направлений использования биомодифицированных продуктов в отраслях народного хозяйства;
обоснование профилактической роли продуктов на основе биомодифицированных кератинов при питании и кормлении.
Научная новизна. Обобщены, расширены и систематизированы информационные сведения о химическом составе, функциональных свойствах, пищевой и биологической ценности, практическом использовании различных видов кера-тинсодержащего сырья.
Установлены закономерности процессов биотрансформации кератин-содержащего (перо - пухового) сырья различными протеолитическими ферментными препаратами и методом ферментации живой культурой микроорганизма. Обоснованы рациональные режимы и параметры процессов получения продуктов с заданным составом.
Выделены и охарактеризованы особенности кератиновых продуктов усвояемых форм. Доказано наличие углеводного компонента и тип его связи с белком в структуре керопептида.
Разработана гипотетическая модель кератинового гликопротеина, объясняющая уровень и целенаправленность функционально-технологических свойств и органолептических характеристик гидролизата.
Научно обоснованы и экспериментально подтверждены технологические приемы по увеличению выхода кератиновых продуктов.
Определены факторы, оказывающие влияние на выход целевого компонента при предварительной обработке и гидролизе кератинсодержащего сырья в лабораторных и производственных условиях.
Изучены токсикологические и профилактические свойства кератинового ферментативного гидролизата в опытах на теплокровных животных.
Определены особенности компонентного состава (среднемолекулярные пептиды и наличие цистина) керопептида, отвечающего специфическим требованиям для производства косметических средств.
Предложены способы и подходы к обработке кератинсодержащего сырья методом биоконверсии живой культурой продуцента Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157, позволяющие увеличить долю перерабатываемого сырья с 2 до 10 % и получить полноценную биомассу с высокой кормовой ценностью.
Исследованы свойства гидролизата в составе пищевых систем на примере мясных фаршей для производства колбасных изделий. Впервые установлены закономерности изменения функционально-технологических свойств (ЖУС) кератиновых гидролизатов в составе мясных систем от их
11 строения и компонентного состава. Установлена высокая способность гидро-лизата к связыванию жировых компонентов с получением стойких эмульсий.
Методами математического планирования и оптимизации подтверждены условия получения кератиновых продуктов с заданными свойствами.
Сформулированы доказательства, подтверждающие функциональность и целесообразность использования гидролизатов кератинового сырья при производстве пищевых продуктов.
Практическая значимость. Разработаны концептуальные подходы и методология получения биомодифицированных кератинов с заданными функционально-технологическими свойствами для рационального использования вторичных кератинсодержащих ресурсов на пищевые, кормовые и косметические цели.
Сформированы информационные банки, уточняющие химический состав кератинов и продуктов их деградации, иллюстрирующие их функционально-технологические свойства применительно к технологии мясных изделий, косметических средств и кормовых продуктов.
Установлены параметры и условия получения и применения кератиновых гидролизатов при производстве пищевых продуктов.
Определены особенности кератиновых продуктов, дана характеристика их составов и биологической ценности в сравнении с промышленными аналогами.
Разработана усовершенствованная технология получения керопептида ТУ 10.5850616.004-91 и внедрена в производство; налажено промышленное производство новой серии косметических изделий «Золотой шелк» (2003 г.) с применением керопептида, увеличивающего влагосвязывающую и эмульгирующую способности шампуней и восстанавливающего структуру поврежденных волос за счет наличия в составе среднемолекулярных пептидов и цистина.
Разработаны эффективные способы биоконверсии кератинового сырья в целях производства микробной биомассы для комбикормов.
Усовершенствована технология получения экструдированного продукта с применением кератинового гидролизата для пищевых и кормовых целей.
Новизна технических решений подтверждена выдачей авторского свидетельства на изобретение № 1 077081 и положительного решения о выдаче патента РФ на заявку №2002118169/13 (019119) от 12.01.2004.
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций, курсовом и дипломном проектировании, выполнении УИРС и НИР студентов специальностей 270900,271200, 271500.
Представленная работа является обобщением многолетних исследований, проведенных лично автором и при его участии под руководством доктора технических наук, профессора Антиповой Л.В. Работа выполнялась в творческом содружестве со специалистами кафедр ВГТА: технологии мяса и мясных продуктов, микробиологии и биохимии, бродильных производств и виноделия, процессов и аппаратов химических и пищевых производств, а также кафедр физиологии и биохимии, аналитической химии и Центра коллективного пользования Воронежского государственного университета, научно-исследовательского центра Воронежского государственного аграрного университета, лаборатории отдела экологии, токсикологии и гигиены Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии (г. Воронеж), аккредитованного испытательного центра пищевых продуктов, продовольственного сырья, кормов, почв, агро-химикатов ФГУ ГЦАС «Воронежский», лабораторий и производственных цехов Всероссийского научно-исследовательского института птицеперерабатывающей промышленности Солнечногорского района Московской области, лабораторий и производственных цехов ЗАО НПО «Техкон» Солнечногорского района Московской области.
Считаю своим долгом выразить искреннюю признательность профессорам Воронежской государственной технологической академии д.б.н. Же-ребцову Н.А., д.т.н. Острикову А.Н., д.т.н. Пащенко Л.П., д.т.н. Григорову B.C., д.т.н. Вострикову СВ., д.т.н. Магомедову Г.О., профессорам Воронежского государственного университета д.х.н. Селеменеву В.Ф. и д.б.н. Ковалевой Т.А., профессору ВНИВИПФиТ д.в.н. Аргунову М.Н., Генеральному ди-
13 ректору ЗАО НПО «Техкон» д.ф-м.н. Мухтарову Э.И. за консультации и помощь при выполнении научно-исследовательских работ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы публиковались, докладывались и обсуждались:
- на международных конгрессах, научных, научно-практических конференциях и симпозиумах: "47th International Congress of Meat Science and Technology" (Krakow, Poland, 2001), "Пища. Экология. Человек" (Москва, 2001); "Успехи современного естествознания" (Дагомыс, 2002); "Проблемы и перспективы развития агропромьппленного комплекса регионов России" (Уфа, 2002); "Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания" (Кемерово, 2002); "Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья" (Москва, 2002); Форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003); "Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции" (Воронеж, 2003); "Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство" (Воронеж, 2003); "Перспективы производства продуктов питания нового поколения" (Омск, 2003); "XVI European Symposium on the Quality of Poultry Meat and Xth European Symposium on the Quality of Eggs and Egg Products" (Saint-Brieuc, France, 2003); "ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОДУКТЫ ПИТАНИЯ: гигиенические аспекты и безопасность" (Краснодар, 2003)
- на всероссийских и республиканских конференциях: "Разработка процессов получения комбинированных продуктов питания" (Москва, 1984); "Состояние и перспективы мало- и безотходной технологии и использование вторичных материальных ресурсов" (Кутаиси, 1985); "VII съезд Всесоюзного микробиологического общества" (Алма-Ата, 1985); "Электрофизические методы обработки пищевых продуктов" (Москва, 1985); "Актуальные проблемы Продовольственной программы" (Воронеж, 1985); " Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг" (Орел, 2001); "Косметические средст-
14 ва и сырье: безопасность и эффективность" (Москва, 2001); "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 2002); "Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения" (Углич, 2002); "Технологии живых систем" (Москва, 2003);
- на отчетных научных конференциях ВГТА за 1982-1985, 2001-2003 гг.
Разработки экспонировались на международных и межрегиональных научно-технических выставках: "Технологии живых систем" (Москва, 2001-2003), "Продторг-2001", "Продторг-2002" (Воронеж, 2001; 2002), "Чернозе-мье-2001" (Воронеж, 2001), по результатам которых включены в каталоги «Технологии живых систем» (2002, 2003), в составе коллективной экспозиции - удостоены дипломов выставочных центров, в том числе за участие в конкурсе инновационных проектов «Продторг - 2001», «Продторг - 2002», «Технологии живых систем - 2002» и золотой медали «Продторг - 2002» (Воронеж, 2002).
Публикации. По материалам работы опубликовано 48 научных трудов, в том числе 1 авторское свидетельство, 1 положительное решение о выдаче патента РФ, статьи и тезисы докладов.
Ферментные препараты в переработке белкового сырья: источники, специфичность, получение и применение
Среди биотехнологических методов оправдал и зарекомендовал себя способ применения ферментов, среди которых при обработке пищевого сырья наибольшую популярность приобрели различные гидролитические ферменты.
Использование ферментов превратилось в важнейший промышленный принцип совершенствования пищевой технологии. Существенный вклад в это внесли достижения микробиологии и биохимии [261]. Производство продуктов питания в настоящее время превратилось из своего рода искусства в высокоспециализированную технологию, которая основывается на открытиях естественных наук.
Биохимические процессы, протекающие при хранении сырья и при производстве пищевых продуктов, связаны с действием естественных, собственных ферментов пищевого сырья [132], а также ферментов, вносимых в ходе технологического процесса в виде ферментных препаратов экзогенного происхождения [52]. В связи с экономической целесообразностью это прежде всего препараты ферментов, продуцируемые различными микроорганизмами; кроме того, для получения ферментных препаратов используют проросшее зерно, ткани животных или тропические растения.
В настоящее время многие отрасли промышленности - хлебопечение, виноделие, пивоварение, производство спирта, сыроделие, производство органических кислот, чая, аминокислот, витаминов, антибиотиков - основаны на использовании различных ферментативных процессов. Они находят все более широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и мясной отрасли.
В последнее время в связи с внедрением безотходных технологий и необходимостью обеспечения безвредности производств популярны способы деструкции непищевых отходов мясных предприятий с помощью специфических ферментов [187]. Они позволяют получить обессоленные белковые гидролизаты, не требуют жестких условий обработки, максимально сохраняют полный набор аминокислот. При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная ценность получаемых продуктов, значительно повышаются их растворимость и усвояемость [144].
Ферментативный гидролиз позволяет сохранить полный набор аминокислот, находящихся в составе белков (табл. 1.5) [213].
Опыт использования гидролиза кератинового сырья показывает, что необходима его предварительная обработка для разрушения водородных и дисульфидных связей с целью обеспечения доступности пептидных связей в молекуле кератина [115]. Обработку проводят мочевиной, бикарбонатом натрия при давлении 0,2 МПа [255], кислотной или щелочной денатурацией при 100 С [183]. Гидролиз ведут ферментами при температуре и рН, обеспечивающим максимальную активность используемых протеаз. Для обогащения отходов к необработанному сырью добавляют препараты ферментов и ведут гидролиз до достижения максимальной степени обогащения аминокислотами [181, 184]. Затем температуру поднимают до уровня, необходимого для инактивации энзимов. Водный раствор отделяют от непереработанного твердого остатка, концентрируют и высушивают (при необходимости).
Ферментативный гидролиз кератинов приобретает важное значение в связи с возможностью создания на его основе различных белковых добавок и гидролизатов не только кормового, но и пищевого значения. В связи с этим открытие высокоэффективных продуцентов и производство на их основе ферментных препаратов приобретает чрезвычайно актуальную задачу.
Применение ферментных препаратов способствует созданию малоотходных технологий, позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшить качество полуфабрикатов и готовой продукции, уменьшить расход сырья на единицу выпускаемой продукции, повысить культуру производства, улучшить условия труда, уменьшить загрязненность и количество сточных вод. Очевидно, успешное решение этих производственных задач тесно связано с выделением, физико-химической и биохимической характеристикой специфических энзимов и соответствующих препаратов.
Внеклеточные ферменты выделяются живой клеткой во внешнюю среду. Многие из них синтезируются микроорганизмами, вызывают расщепление биополимеров, продукты которых становятся доступными для транспорта из питательной среды через биологические мембраны, и их дальнейшие превра щения внутри микробной клетки; сюда же относятся ферменты растений, способные мигрировать к местам локализации субстратов и там осуществлять их деструкцию [101]. Внутриклеточные ферменты находятся либо в клеточных органеллах, либо в комплексе с надмолекулярными структурами. В технологии ферментных препаратов более предпочтительны продуценты активно синтезирующие внеклеточные ферменты.
В настоящее время промышленность России выпускает ряд чистых ферментов и ферментных препаратов. Последние представляют собой смеси, содержащие помимо основного целевого фермента, активность которого в препарате превалирует, другие менее активные ферменты и балластные вещества. Чистые ферменты используют главным образом в медицине и при научных исследованиях; в промышленных целях применяют ферментные препараты различной степени чистоты.
Специальные методы исследований (микробиологические, биологические, хроматографические, спектроскопические, математические)
Исследование биоконверсии кератинсодержащего сырья продуцентом Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 проводили глубинным способом, включавшим два этапа. Предварительно готовили споровую культуру продуцента на плотной питательной среде в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51446-99. Для ее приготовления [156] брали 200 г очищенного и нарезанного кусочками картофеля, заливали 1 дм3 водопроводной воды и кипятили 15-20 мин, не допус кая разваривания клубней. Отвар фильтровали через ватно-марлевый фильтр и доводили объем фильтрата до первоначального. В фильтрате растворяли 5 г пептона, 5 г натрия хлорида и расплавляли при нагревании текучим паром в автоклаве 20 г агар-агара. Устанавливали рН 7,0-7,2. Разливали в пробирки и стерилизовали при температуре 121 С в течение 30 мин. Для приготовления скошенных питательных сред пробирки с расплавленным горячим агаром раскладывали наклонно под углом 5-6 и оставляли до полного их застывания. [226] Стерильность среды контролируют термостатированием ее 72 ч при + 37С. В стерильных условиях чистую культуру продуцента в лиофиль-но высушенном виде из запаянных стеклянных ампул высевали водно-споровой суспензией на плотную агаризованную питательную среду и выращивали при +37 С в течение 20 сут [135]. Далее, на первом этапе, в асептических условиях чистую культуру штамма в виде водно-споровой суспензии вносили в количестве 2 % к объему питательной среды (100 см3). Для получения вегетативного мицелия использовали споро-вый материал, содержащий 10 спор/см . Состав среды был следующий, %: крахмал растворимый - 2,00; соевая мука - 2,00; (NH4)2S04 - 0,30; NaCl - 0,25; КН2РО4 - 0,05; СаСОз - 0,30, рН среды 7,4. Все питательные среды на обоих этапах стерилизовали при Р=0,1 МПа в течение 1 ч [296]. Затем в охлажденную до 28 С питательную среду вносили водно-споровую суспензию и готовили посевной материал в колбах емкостью 750 см3 на лабораторной качалке при перемешивании п=3 с"1, температуре 28 С в течение 48 ч до образования вегетативного мицелия с соотношением объема среды и колбы 1:7,5. На втором этапе осуществляли собственно культивирование продуцента. Для этого в асептических условиях стерильные питательные среды № 1 и № 2 вносили в качалочные колбы с соотношением объемов среды и колбы 1:7,5 и засевали вегетативным мицелием культуры, полученной на первом этапе; объем засевной культуральной жидкости составлял 5 % к объему питательной среды исследуемого состава.
По окончании культивирования био массу и культуральную жидкость продуцента разделяли и проводили соответствующие анализы. Определение общего количества вегетативных форм микроорганизмов в 1 см" образцов проводили при культивировании на мясо-пептонном агаре при температуре 37 С в течение 24 ч с десятичным разведением стерильной водой и подсчетом выросших колоний (от 30 до 300 штук) на чашках Петри (5=90 мм). Отбор проб регламентирован ГОСТ 21237-75 и ГОСТ Р 51447-99. Общую протеолитическую активность (ПС) ферментных препаратов определяли модифицированным методом Ансона (ГОСТ 20264.2) [11] с использованием в качестве субстрата казеината натрия по Гаммерстену в пределах рН 5,0-9,0. За единицу ПС принимали количество фермента, которое за 1 мин при 30 С катализирует переход в не осаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние количество субстрата, содержащее 1 мкмоль тирозина. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле: с - отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления трихлоруксусной кислоты; - оптическая плотность раствора; - тирозиновый эквивалент = 1,59; - продолжительность гидролиза, мин; - масса ферментного препарата, взятого для реакции, мг; - коэффициент пересчета г в мг. Для определения кератиназной активности (КА) [272] брали 200 мг из мельченной шерсти (предварительно промытой хлороформом и водой, высушенной на воздухе), добавляли 10 мл 0,05 М боратного буфера рН 9,0, содержащего количество фермента, эквивалентное 0,02 единицы общей проте олитической активности (ПС). Энергично встряхивали и оставляли на 3 часа при 37 С для гидролиза кератина. Одновременно ставили 2 контроля, на растворение шерсти в буфере и содержание растворимого белка в культураль-ной жидкости. По калибровочной кривой, построенной по растворам сывороточного альбумина, определяли количество расщепленного белка (мкг/см3) культуральной жидкости за 1 час гидролиза. Количество пептидов и аминокислот определяли нингидриновым методом [11, 287, 99] или лигандно-обменной хроматографией [273]. Последний состоит в том, что аминокислоты лучше, чем пептиды удерживаются в виде медных хелатов внутри гранул сефадекса G- 25 в Си (ОН)2 - форме. При анализе белковых гидролизатов для осаждения белков добавляли этанол (96 %) из расчета 40 см на 150 см3 раствора и выдерживали его 24 часа при 8-г10 С. Выпавший осадок удаляли фильтрованием, фильтрат упаривали до объема 10 см3 на водяной бане при 50-ИЮ С и прибавляли 5 см3 30 % раствора щавелевокислого калия. Оксалат калия удаляли фильтрованием, объем вытяжки доводили до 20 см водой. Водорастворимую фракцию азотсодержащих компонентов (5 см ) наносили на колонку G- 25 в Си (ОН)2 - форме. Элюцию проводили 0,05 N бо-ратным буфером, рН =11 со скоростью 30 см /час. Собирали фракции по З см\ В каждой пробирке измеряли оптическую плотность при 570 нм.
Изыскание условий предварительной обработки кератинов в водных средах с использованием химических реагентов
При сравнительном изучении химического состава различных видов кератина (табл. 1.2) выявлено, что массовая доля жира в них резко увеличивается более чем 3-4 раза с переходом от рого-копытного сырья (0,53-1,98 %) к волосу (2,50 %) и перу (3,00 %). Это связано с прижизненными функциями, особенностями биосинтеза и строением кератинов различного происхождения. В случае волоса и пера способность к жироудержанию подтверждается также и строением фолликула (рис. 3.6), из которого следует, что анатомическое расположение волоса (пера) находится в непосредственной близости с сальной железой, которая в процессе жизнедеятельности организма выделяет свой секрет для покрытия волоса (пера). В результате этого производные кожи надежно защищены от неблагопрятных внешних воздействий, так как кератин волоса и пера представляет собой ос-спираль отличающийся от структуры рогов и копыт меньшей прочностью.
Рис. 3.6. Строение фолликула и корня волоса в продольном разрезе: 1-роговой и подроговой слои; 2-эпидермис; 3-на-ружное эпителиальное влагалище; 4-кутикула корня волоса; 5-корковое вещество волоса; 6-мозговое вещество волоса;7 соединительнотканная сумка корня волоса; 8-луковица; 9 соединительнотканный сосочек луковицы; 10-живые эпителиальные клетки луковицы; 11 -шейка корня волоса (граница между ороговевшими и неороговевшими клетками корня волоса); 12-фолликул корня волоса (цилиндрический слой); 13-внутреннее эпителиальное влагалище; 14-мускул, приподнимающий корень волоса; 15-сальная железа; 16-жировая полость; 17-жировой канал; 18-жировой канал в разрезе; 19-стержень волоса
Гидрофобные свойства кератинов сохраняются в случае относительно высокомолекулярных структур. При глубоком распаде кератинов наблюдается возрастание гидрофильности, снижающей или полностью исключающей связывание с жировыми компонентами. В аспекте разработки функциональных гидро-лизатов следует акцентировать, что белковые продукты гидролиза должны быть лимитированы по молекулярной массе, в частности содержать усвояемые белко вые фрагменты в виде высокомолекулярных пептидов. Однако, следует заметить, что при глубокой деструкции кератинов образуются , в основном, аминокислоты, которые неспособны удерживать воду, а полностью растворяются в ней. Дифференцировано провести гидролиз с получением продуктов заданных свойств возможно лишь с применением ферментативного гидролиза. Для этого необходим выбор специфических ферментов и подбор условий, обеспечивающих требования к конечным продуктам реакции.
При информационно-патентном поиске установлено, что ферментные системы и какие-либо известные препараты слабо воздействуют на нативные кератины. Весь имеющийся опыт исследовательской практики свидетельствует , что для целенаправленного гидролиза кератина, определяющегося прежде всего качеством и соотношением продуктов его деградации, необходимо предварительное ослабление структуры кератинов. Применительно к о кератинам ослабление его структуры связано прежде всего с разрушением (полным или частичным) дисульфидных связей, стабилизирующих межцепочечные связи в структуре белка с минимальным воздействием на внутрицепо-чечные пептидные связи для последующего специфического гидролиза пептидных связей ферментами.
Гидромодуль обработки сырья различного происхождения в присутствии высоких температур оказывает достаточно большое влияние на разрушение различных прочных структур, в том числе белковых и полноту извлечения целевых компонентов [101]. Вместе с тем влияние воды на деструкцию белков упроченной структуры мало изучено, хотя применение воды необходимо для их дальнейшей биоконверсии ферментами из класса гидролаз [103].
Разработка гипотетической модели структуры кератинового гликопротеина
Достаточно большое количество разнообразных фактов по исследованию кератинов дает основание предполагать следующую структуру кератинового гликопротеина (рис. 4.10). Качественный состав белковой цепи представлен всеми известными аминокислотами, некоторые фрагменты последовательности аминокислот общеизвестна (цистеин-цистеин-глутаминовая ки-слота-пролин-серин) [108]. Теоретически в этом месте через дисульфидную связь двух аминокислот цистеина возможно присоединение второй молекулы гликопротеина, и получение более высокомолекулярного гидролизата при понижении температурного воздействия при его предварительной обработке. Как и любая белковая цепь она имеет на разных концах аминную и карбоксильную группы. По результатам данных о специфичности действия ферментов препарата «Савиназа» на кератиновые белки с карбоксильного конца пептидной цепи необходимо расположить одну из ароматических аминокислот, предпочтительнее тирозин. Окрашивание реактивом Фолина боковых радикалов тирозина, триптофана и цистеина говорит об отсутствии в этих участках белковой цепи связей с углеводными компонентами в виде редуцирующих веществ (например, D-глюкозы, D-галактозы или D-маннозы). Согласно проведенным исследованиям в этой области по гликопротеинам [213], к полипептидной цепи в разных участках присоединены олигосахариды, состоящие из 2-15 моносахаридных единиц - гексозаминов, гексоз, сиаловых кислот и фруктоз. Присоединение углеводных компонентов к белковой цепи происходит по R-группам серина, треонина и аспарагиновой кислоты [103]. Разрыв третичной структуры в белке кератине в наших исследованиях обнаруживается по повышению массовой доли тирозина. С другой стороны водородной связи, образованной тирозином, в третичной структуре чаще находятся глутаминовая или аспарагиновая кислоты (на рисунке дано равномерное распределение энергии по обеим связям между атомом углерода и двух кислорода с общим электроотрицательным зарядом за скобкой в соответствии с последним общепринятым мнением по этому вопросу).
В кератиновом белке изображаемый гликопротеин может также присоединяться к другим структурам, например к более высокомолекулярному протеогликану посредством углеводного компонента.
Значительная водоудерживающая способность керопептида как пищевой белковой добавки наглядно объясняется наличием как гидрофильных R-групп части аминокислот, так и остатками полисахаридов.
Высокой жироудерживающей способности керопептид обязан прежде всего присутствию в своем составе гликопротеина с гидрофобными R-группами таких аминокислот как изолейцин (21,97 мас.%), лейцин (16,98 мас.%), валин (4,97 мас.%) и аланин (2,09 мас.%). По аминокислотному составу кератинового гидролизата, определенному нами при обработке препаратом фрадиоспиралиси-ном Г 10х [23], их суммарное содержание достигает не менее 46 % от общего количества свободных аминокислот.
Установлено [213], что гликопротеины фибриллярных белков животного происхождения выполняют роль матриц, регулирующих ориентированное расположение этих белков, а также стабилизируют фибриллы и их агрегацию с протеогликанами и принимают участие в минерализации тканей.
Таким образом, целым рядом тонких физико-химических и биологических методов определено, что основным продуктом ферментативного гидролиза кератинового (перо-пухового) сырья являются гликопротеины. Высокие функционально-технологические свойства керопептида в мясных фаршевых системах обеспечиваются структурными особенностями его белково-углеводного комплекса.
