Введение к работе
Актуальность темы.Новейшая биотехнология (биоинженерия) – это наука о генно – инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.
Разработка методов культивирования клеток invitro, освоение этих методов специалистами биофабрик позволила решить многие вопросы реального производства вирусвакцин и диагностикумов. Однако, необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, получение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической трансформации клеток.
Проблема поиска различных биологически активных компонентов ростовой среды для наиболее эффективного культивирования клеток в вирусологии и биотехнологии актуальна. На сегодня важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она остается незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных культур (Нариманов А.А., 1991; Хижняк Л.Н., Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., 2000; Рянский А.Л., 2001; Еремец В.И., 2011;TaylerW., 1974 и др.; ReuvenyS. etal.,1986;VelezD. еtal., 2006). При культивировании клеток чаще используется сыворотка крови крупного рогатого скота, но ее широкое использование ограничивается дефицитом и высокой стоимостью (Манцыгин Ю.А. и др., 1983; Хаертынов С.Х., 1982; EvegeЕ. etal. 1985; JaymeD. etal. 1988 идр.). Для стимуляции роста клеток применяются гомо - и гетеровидовые варианты сывороток крови, обычно крупного рогатого скота, лошадей и свиней. Оптимальная концентрация сывороточного компонента в среде при этом составляет 10% (Ганиев И.М., 2007; Гурьянов Н.И., 2008).
Поиск замены ее более дешевыми биологически активными веществами является перспективным (Иванов А.В. и др., 2010; Плотникова Э.М., 2012).
На ранних этапах становления культур клеток широко применялись мышечные экстракты плодов коров, но в последние десятилетия они не используются. Ранее была предпринята попытка оценки биологических свойств и биохимического состава экстрактов из мышц, печени, почек плодов коров (Гильмутдинов Р.Я., 2008; Закиров Р.Р., 2009; Самуйленко А.Я., 2011). Результаты исследований показали, что экстракт из мышц плодов коров является прекрасной биодобавкой в питательные среды при выращивании клеток для репродукции на них вирусов, с целью получения вакцинных и диагностических препаратов против возбудителей заболеваний сельскохозяйственных животных (Гаффаров Х.З., Гумеров В.Г., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И.и др., 2012). Данная проблема решена не полностью, не только с технологической точки зрения, но и в связи с резким уменьшением количества плодов коров на мясокомбинатах.
1.2 Цели и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации биодобавки в питательные среды при выращивании культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:
получить экстрактиз кабачков и мышц щуки;
исследовать биохимические показатели сывороток крови коров, бычков, плодов коров, экстрактов из остаточных сгустков крови, мышц плодов коров и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки;
изучить ростстимулирующий эффект сывороток крови коров (СКК), бычков (СКБ), плодов коров (СКПК), экстрактов из остаточных сгустков крови (ЭОСКПК) и мышц плодов коров (ЭМПК), и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ) в 10% концентрации в питательной среде на перевиваемых культурах клеток LEK, MDBK, Vero, PK-15;
оценить репродукцию вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) на культуре клеток MDBK, парагриппа-3 (ПГ-3) на культуре клеток LEK; реовируса на культуре Vero, выращенных на питательной среде с вышеперечисленными биодобавками.
1.3 Научная новизна работы.Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Установлено, что комбинированный экстрактов в 10% концентрации в питательной среде хорошо стимулирует рост клеток при сравнительно низкой плотности их посева - 40 тыс. кл/см2, LEK - 5,65±0,12, MDBK – 5,74±0,13, PK-15 – 5,74±0,16, Vero – 6,85±0,11, что практически лишь незначительно уступает контролю. Дается характеристика комбинированного экстракта по основным биохимическим показателям, которые сравнительно ниже, чем у сывороток крови крупного рогатого скота и их экстрактов, но несмотря на это данная биодобавка хорошо стимулирует рост клеток. Впервые проведена оценка репродукции вирусов ИРТ, ПГ-3 крупного рогатого скота на перевиваемых культурах клеток MDBK и LEK, а также реовируса тип Iштамма «Lang», на клетках Veroс добавлением в их ростовую среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки.
Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С., Хазиев Л.Р. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.
1.4 Практическая значимость работы. Разработана технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки; показана возможность его применения в средах для культивирования перевиваемых линий клеток с целью репродукции на них вирусов. Результаты выполненных исследований используются в производственном процессе в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань.
1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях: «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).
1.6 Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
1.7 Основные положения, выносимые на защиту:
1. Технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки на основе раствора Хэнкса в качестве биодобавки в питательные среды при выращивании перевиваемых культур клеток и репродукции на них вирусов;
2. Ростовые свойства экстракта, состоящего из биологически активных веществ растительного и животного происхождения относительно перевиваемых линий клеток LEK, MDBK, Vero, PK-15 при добавлении его в культуральную среду в концентрации 10%;
3. Репродукция вирусов на перевиваемых культурах клеток, выращенных на среде с использованием сочетанного экстракта.
1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка литературы и приложений. Работа содержит 11 таблиц, проиллюстрирована 21 рисунком. Список использованной литературы включает 163 библиографических источников, в том числе 47 на иностранном языке и 4 ссылки на интернет – сайт.
