Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Распространение кишечных инфекций у животных 12
1.2 Ассоциативное течение кишечных инфекций у животных 26
1.3 Патогенность и антибиотикорезистентность возбудителей кишечных инфекций 30
1.4 Заключение по обзору литературы 36
Глава 2. Материалы, объекты и методы исследования 38
2.1 Микробиологические методы 39
2.1.1 Методы идентификации микроорганизмов (морфологические, культуральные, биохимические, серологические) 39
2.1.2 Определение биологических свойств выделенных микроорганизмов (гемолитическая, адгезивная, протеолитическая активность, факторы персистенции, продукция ДНКазы и фосфатазы) 42
2.1.3 Определение резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам 45
2.1.4 Определение вирулентности микроорганизмов методом биопроб 48
2.2 Вирусологические исследования 49
2.3 Статистические методы 50
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1 Ретроспективный анализ инфекционной патологии собак в Иркутской области 52
3.2 Характеристика кишечного микробиоценоза здоровых собак 58
3.2.1 Морфологические, культуральные, биохимические свойства микроорганизмов 59
3.2.2 Патогенные свойства микроорганизмов 71
3.3 Характеристика кишечного микробиоценоза больных собак 74
3.3.1 Морфологические, культуральные, биохимические, серологические свойства микроорганизмов 75
3.3.2 Патогенные свойства микроорганизмов 87
3.3.3 Микробиоценозы у собак с кишечными моно-инфекциями 94
3.3.4 Микробиоценозы у собак с кишечными ассоциированными инфекциями 95
3.4 Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных от собак 98
3.4.1 Антибиотикорезистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae 98
3.4.2 Антибиотикорезистентность бактерий семейств Micrococcaceae и Streptococcaceae 114
3.5 База данных для исследований по изучению этиологических возбудителей кишечных инфекций у собак 121
3.6 Оптимизация терапии при моно- и ассоциированных инфекциях собак на территории Иркутской области 122
Глава 4. Заключение 127
Выводы 139
Практические рекомендации 142
Список использованной литературы 143
Приложение 164
- Патогенность и антибиотикорезистентность возбудителей кишечных инфекций
- Ретроспективный анализ инфекционной патологии собак в Иркутской области
- Антибиотикорезистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae
- Оптимизация терапии при моно- и ассоциированных инфекциях собак на территории Иркутской области
Введение к работе
Актуальность темы. Сложность и многогранность задач современной ветеринарии состоит в необходимости защиты животных от инфекционных болезней. Особую важность имеет борьба с болезнями, общими для человека и животных, в т.ч. собак, разделяющих с человеком около 10% разновидностей бактерий. Патология собак включает широкий спектр инфекционных заболеваний. Среди них значительно распространенными являются кишечные инфекции, регистрируемые преимущественно у щенков, молодых собак с пониженной резистентностью, заболеваемость которых достигает 40%, а смертность среди заболевших - 45-50% (Швачкина И.В., 2000; Бутенков А.И., 2005). Кишечные инфекции собак могут быть обусловлены как вирусными, так и бактериальными агентами (Широбокова М.А., 1992; Сидоров И.В. с соавт., 2001; Половинка В.В., 2005). Бактериальные кишечные инфекции представлены (наряду с другими формами) эшерихиозами и заболеваниями, вызванными условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae. Гастроэнтериты и гастроэнтероколиты, вызываемые эшерихиями, распространены повсеместно и поражают животных различных видов, поэтому представляет одну из сложных проблем для современной ветеринарии (Онищенко И.С., 2008.). Возбудителями эшерихиозов являются диареегенные кишечные палочки: энтеропатогенные, энтероинвазивные, энтеротоксигенные, энтерогеморрагические, энтероагрегирующие и диффузно-агрегирующие (Strockbine N.A. et al, 1986; Lee J.H. et al, 2000). Как отмечает А.С. Муханова (2010), диарея, обусловленная патогенными E.coli, является важной и частой проблемой здоровья домашних животных. Несмотря на достаточно широкое изучение диареегенных кишечных палочек в медицине, в ветеринарии проведены отдельные исследования по выявлению частоты их выделения и бактерионосительства среди различных видов животных, в т.ч. собак. При этом нет достаточных данных об их патогенных свойствах и резистентности к антимикробным препаратам (Онищенко И.С., 2008).
Также следует отметить неуклонно возрастающую роль условно-патогенных представителей семейства Enterobactericeae в возникновении инфекционной патологии животных (Лезова А.А., 2006), что диктует необходимость изучения и оценки их патогенного потенциала. Гетерогенность микробных популяций условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ) по фенотипическим признакам (факторы адгезии, инвазии, персистенции) свидетельствует о необходимости установления уровня их патогенности при оценке этиологической значимости в инфекционной патологии (Михайлова Л.В., 2011; Бондаренко В.М., 2011).
В последние годы получает широкое распространение изучение вопросов ассоциативных (ассоциированных) заболеваний (Олескин А.В. с соавт., 2000; Курбанмагомедов КБ., 2009; Терехов В.И. с соавт., 2011 и др.), составляющих большую часть болезней инфекционной природы и представляющие большую опасность для животных (Коромыслов Г.Ф., 1998; Терехов В.П., 1999; Ефимова М.А., 1999; Равилов А.З. с соавт., 2000; Красиков А.П., 2000;
Афанасенко В.И., 2000; Лобанова Н.В., 2004; Шаньшин Н.В., 2004; Гусев В.В. с соавт., 2004; Малошевич В.Э., 2005; Ковальчук Н.М., 2005). Наблюдается увеличение роли ассоциированных инфекций, вызванных комплексом различных этиологических агентов (Большаков А.Л.,1998; Сафин М.А. с соавт., 1998; Берестенева Е.В., 2003; Апатенко В.М., 2005; Параева О.М., 2007; Малахеева Л.И., 2008; Латышев С.Н., 2009; Терехов В.И. с соавт., 2011).
Учитывая рост смешанных инфекций, перед специалистами ветеринарной медицины возникают новые требования при проведении диагностических исследований. Правильно оценить сложившуюся эпизоотическую ситуацию, эффективно спланировать профилактические мероприятия возможно лишь в случае полного представления о структурном составе этиологически значимых инфекционных агентов, входящих в состав ассоциаций.
Одной из причин распространения ассоциированных инфекций явилось появление антибиотикорезистентных микроорганизмов (Светоч Э.А., 1992; Бойко Н.В. с соавт., 2010). В настоящее время резистентные и множественно резистентные формы встречаются практически у всех клинически значимых микроорганизмов (Страчунский Л.С., 2002; Богданов М.Б. с соавт., 2004). Как указывают Н.В. Данилевская (2005), Н.В. Пименов (2006), в настоящее время наблюдается отсутствие эффективности многих препаратов последних поколений, которые никогда не назначали не только животным, использованным в эксперименте, но и в целом в ветеринарной медицине. В связи с этим распространение антибиотикорезистентных штаммов в ветеринарии требует изучения чувствительности возбудителей инфекционных заболеваний животных, в т.ч. собак, к антимикробным препаратам (АМП) различных поколений и фармакологических групп, а также рациональной организации антибиотикотерапии (Данилевская Н.Б., 2010).
Исходя из вышеизложенного, целью работы является: изучить таксономическую характеристику кишечных инфекций у собак (ассоциированных и моновариантов), биологические свойства и антибиотикорезистентность их возбудителей на территории Прибайкалья.
Для выполнения указанной цели поставлены следующие задачи:
-
Изучить нозологический профиль инфекционной патологии собак на территории Прибайкалья на основе сбора и систематизации данных государственной ветеринарной статистической отчетности.
-
Изучить таксономическую характеристику и свойства бактерий кишечного микробиоценоза здоровых собак.
-
Выявить структурный состав этиологически значимых инфекционных агентов при кишечных ассоциированных и моно-инфекциях бактериальной этиологии у собак на изучаемой территории.
-
Изучить биохимические характеристики и фенотипические маркеры патогенности возбудителей кишечных инфекций у собак (антилизоцимная, адгезивная, гемолитическая, протеолитическая активность, продукция щелочной фосфатазы и ДНКазы). Дать сравнительную оценку биологической активности микроорганизмов в микробных ассоциациях и в монокультурах.
-
Определить антибиотикорезистентность микроорганизмов,
выделенных от собак при кишечных ассоциированных и моно-инфекциях, с целью определения эффективного антимикробного препарата при лечении больных собак.
6. Создать и зарегистрировать базу данных для дальнейших исследований по изучению этиологических возбудителей кишечных инфекций собак, их фенотипических маркеров патогенности на территории Прибайкалья.
Научная новизна работы. Изучен спектр микроорганизмов, выделенных из кишечника здоровых собак на территории Прибайкалья, их биологическая активность и уровень антибиотикорезистентности.
Выявлен нозологический профиль инфекционных болезней собак на изучаемой территории. Показана роль кишечных инфекций в инфекционной патологии собак. Установлено, что кишечные инфекции у собак с одинаковой частотой протекают в виде ассоциированных и моновариантов. Показаны различия в частоте встречаемости моно- и ассоциированного вариантов кишечных инфекций у собак разных возрастов и пород.
Выявлены основные этиологические агенты, вызывающие кишечные инфекции у собак. Определен диапазон серологических вариантов эшерихий. Изучены патогенные свойства возбудителей эшерихиозов и инфекций, вызываемых условно-патогенными энтеробактериями. Выявлена их фенотипическая гетерогенность. Установлен более высокий уровень патогенности (вирулентности) энтеробактерий в микробных ассоциациях по сравнению с монокультурами. Получены данные о распространенности антибиотикорезистентных штаммов среди эшерихий и других энтеробактерий -возбудителей кишечных инфекций у собак, установлены уровни устойчивости к АПМ различных фармакологических групп, а также к Р-лактамным препаратам. Выявлен более высокий уровень антибиотикорезистентности у энтеробактерий в микробных ассоциациях по сравнению с моновариантами.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведен анализ всех инфекционных болезней собак бактериальной этиологии за 8 лет и дана оценка нозологического профиля инфекционной патологии собак на территории Прибайкалья. Получены данные о частоте выделения диареегенных кишечных палочек разных групп и условно-патогенных энтеробактерий от больных собак на изучаемой территории. Установлены данные по фенотипическим свойствам исследованных микроорганизмов, что вносит вклад в оценку их этиологической значимости при кишечных инфекциях у собак. Проведена систематизация регистрации кишечных инфекций собак, биологических особенностей и антибиотикорезистентности их возбудителей (моноварианты и микробные ассоциации) с созданием базы данных для оптимизации мониторинга данных инфекций на территории Прибайкалья.
Материалы исследований используются в практике работы ФГБУ «Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория»; внедрены в учебный процесс на кафедре специальных ветеринарных дисциплин ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» для обучения ветеринарных специалистов (протокол заседания №2 от 18.09.2013 г), на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО «Иркутская
государственная медицинская академия последипломного образования» (акт внедрения №23 от 17.05.2013г.). Разработаны методические рекомендации «Методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», утвержденные Методическим советом ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» (11.04.2013 г.).
По результатам исследований получено Свидетельство Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (РОСПАТЕНТ) о государственной регистрации БД № 2011620749 от 7.10.2011 г. «Биологические свойства и антибиотикоустойчивость микроорганизмов, выделенных из различных биотопов собак».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Бактериальные кишечные инфекции в нозологическом профиле инфекционной патологии собак. Ассоциированные и моно-инфекции у собак.
-
Этиологический спектр возбудителей бактериальных кишечных ассоциированных и моно-инфекций у собак, доминирующие возбудители, диапазон серологических вариантов патогенных эшерихий, состав условно-патогенных энтеробактерий и стафилококков; уровень их патогенности (вирулентности) и антибиотикочувствительности. Микробиоценоз кишечника здоровых собак.
-
Формирование базы данных по бактериальным кишечным инфекциям собак (ассоциированные и моноварианты), уровня их патогенности и антибиотикочувствительности для оптимизации мониторинга бактериальных инфекций на территории Прибайкалья.
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы нашли отражение в 10 научных публикациях, в т.ч. в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций - 3, методических рекомендациях - 1.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были
представлены на конференциях разного уровня: II Сибирский конгресс
«Актуальные вопросы ветеринарной медицины», г. Новосибирск, 2010 г.; X
Международная Байкальская научно-практическая конференция, г. Иркутск,
2010 г.; III Межрегиональный семинар «Организация санитарно-
эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями,
г.Иркутск, 2010; XI Международная Байкальская научно-практическая
конференция по проблемам ветеринарной медицины, г. Иркутск, 2011 г.;
Международная научн.-практ. конф. «Актуальные вопросы ветеринарной
медицины Сибири» (к 100-летию профессора В.Р.Филиппова), г. Улан-Удэ,
2013; научн.-практ. конф. с междунар. участием «Актуальные проблемы
современной инфектологии», г. Иркутск, 2013; ІУМежрегиональньїй семинар
«Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за
инфекционными заболеваниями», г. Иркутск, 2013.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы результатов собственных исследований, состоящих из шести подглав, а также главы
заключение, включающей обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации, приложение. Работа изложена на 163 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 11 таблицами. Список литературы содержит 210 работ, из них 177 отечественных и 33 зарубежных авторов.
Патогенность и антибиотикорезистентность возбудителей кишечных инфекций
Патогенность является наиболее важным биологическим свойством возбудителей инфекционных болезней, влияющим на ход эпидемического процесса (Покровский В.И. с соавт., 1993). Для определения степени патогенности широко применяется термин «вирулентность», т.е. количественное проявление (мера) патогенности (Супотницкий М.В., 2000; Поздеев O.K., 2002). По мере развития молекулярной биологии, генетики, микробиологии и связанных с ними дисциплин, было установлено, что патогенность - это генетически детерминированная способность микроорганизмов вызывать заболевания у хозяина, а ее носителем являются клон или клоновая линия (Фролов А.Ф. с соавт., 1986; 1989; Ряпис Л.А. с соавт., 1988; Петровская В.Г., 1987; Бондаренко В.М., 1999 и др.). Природные популяции бактерий одного вида состоят из многих клоновых линий и являются неоднородными как по фенотипическим признакам, так и по уровню патогенности и вирулентности отдельных клонов. В связи с этим, для определения уровня патогенности микроорганизма необходимо использовать не вид микроорганизмов как таковой, а отдельные штаммы этого вида (Петровская В. Г., 1987). A.M. Зарицкий (1988) и другие авторы отмечают, что вирулентность является штаммовым, а не видовым признаком. Таким образом, в каждом из микроорганизмов, представителей условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при кишечных инфекциях, можно предполагать наличие отдельных штаммов, обладающих различным уровнем патогенности, которые, в зависимости от этого, могут быть или возбудителями кишечных инфекций или быть непатогенными (Слободкин В.И., 2003).
Гетерогенность микробных популяций, существование фенотипических различий между диареегенными и банальными вариантами кишечной палочки (как следствие их модификационной изменчивости и процесса адаптации микроорганизмов к условиям среды обитания) позволили О.В.Бухарину с соавт. (2000) рекомендовать использование биопрофиля в качестве информативного критерия маркирования эшерихий.
Многие авторы указывают на условность или относительность деления микроорганизмов на официально признанные патогенные и условно-патогенные (Петровская В.Г., 1987; Фролов А.Ф. с соавт., 1989; Петровская В.Г. с соавт., 1994; Бондаренко В.М., 2011; Анганова Е.В., 2012 и др.). Для каждого патогенного вида микроорганизма характерен свойственный только ему набор факторов или признаков (маркеров) патогенности (материальных носителей вирулентности), благодаря которым осуществляется развитие инфекционного процесса. К таким фенотипическим маркерам патогенности относятся (Бондаренко В.М., 2011):
1. Адгезивная активность и способность к образованию бактериальных биопленок (прикрепление и колонизация);
2. Энтеротоксигенность (диарейный симптомокомплекс);
3. Гемолитическая и цитотоксическая активность (цитотоксичность, повреждение клеточных мембран);
4. ДНКазная активность;
5. Протеазная активность; 6. Фосфатазная и лецитиназная активность.
Адгезивная активность - это способность микроорганизмов прикрепляться к поверхности субстрата - клеткам организма хозяина. У энтеробактерий молекулы адгезинов входят в состав специализированных органелл - ворсинок (фимбрий, пилей), называемых «фимбриальными адгезинами» (Сидоренко СВ., 2001). Помимо адгезинов в процессе адгезии могут участвовать различные ферменты, разрушающие слизь, например, гиалуронидаза, нейроминидаза, муциназа и другие (Руководство..., 1984).
Энтеротоксигенность проявляется за счет эндо и экзотоксинов. Эндотоксины высвобождаются в среду организма после гибели клетки и обладают воспалительным и пирогенным действием неспецифического характера. Экзотоксины представляют собой токсические молекулы, секретируемые в окружающую среду с помощью специальных систем (Коротяев А.И. с соавт., 1998).
Гемолизины являются одними из важнейших факторов патогенности, в частности, кишечных и внекишечных штаммов Е. coli (Smith H.W. et al., 1985; Hacker J. et al., 1986; Burgos Y. et al., 2010). Гемолизины - это порообразующие цитолизины, способные лизировать эритроциты, а также повреждать клеточные мембраны, оказывая цитопатическое действие, таким образом, выступая в качестве показателя потенциальной цитотоксичности условно-патогенных энтеробактерий. Гемолизины обнаружены у энтеробактерий многих видов — E.coli, K.pneumoniae, Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. и т.д. (Голубев B.A., 1984; Бондаренко B.M. с соавт., 1988; Саляхов Р.З. с соавт., 2003; Bauer М.Е. et al.,1996; Chinen І. et al., 2002). Как отмечает B.M. Бондаренко (1988), наиболее изученными в данном аспекте являются кишечные палочки, способные продуцировать несколько типов гемолизинов, например, а-гемолизин, обладающий гемолитической, цитотоксической и летальной активностью.
Эффект проявления ДНКазы у бактерий заключается в повреждении структуры нуклеиновых кислот. Фосфатазная активность способствует увеличению проницаемости клеточных мембран. Протеазная активность способствует стимуляции образования медиаторов воспаления, деструкции клеточных мембран, гипоксии тканей (Бондаренко В.М., 2011).
В настоящее время большое внимание уделяется изучению персистентной активности микроорганизмов. Согласно исследованиям О.В. Бухарина (1992), к факторам персистенции относятся антилактоферриновая (АлфА), антилизоцимная активность (АЛА) и антикомплементарная активность (АКА). Данный автор подчеркивает, что именно персистентные свойства бактерий, направленные на инактивацию факторов естественной резистентности макроорганизма, определяют развитие длительности, тяжесть течения и исход заболеваний микробной этиологии. При этом, как отмечают В.М.Бондаренко с соавт. (2000), одним из наиболее значимых факторов персистенции у микроорганизмов, в т.ч. энтеробактерий, является антилизоцимная активность. По данным А.П. Малышкиной (1983), В.М. Бондаренко с соавт. (1987), Н.В. Шеенкова с соавт. (1993), Е.В. Голошвы с соавт. (2002), данное свойство встречается у многих видов микроорганизмов - сальмонелл, кишечных палочек, протеев, клебсиелл, стафилококков и т.д. Вопросы персистенции бактерий в организме хозяина приобретают особое значение для изучения патогенеза различных инфекций, а также выработки эффективных методов диагностики и антиинфекционной терапии.
Одной из основных проблем в лечении инфекционных заболеваний у домашних животных является распространение штаммов микроорганизмов, устойчивых к антимикробным препаратам (Белоусов Ю.Б., 1993; Данилевская Н.Б., 2010 и др.). Н.Б. Данилевская (2010) сравнивает ветеринарные клиники, где противомикробные препараты назначаются в большом ассортименте по различным показаниям домашним животным, с медицинскими стационарами, где часто регистрируется так называемая «госпитальная инфекция», что требует рациональной организации антибиотикотерапии. Проведенные данным автором исследования на домашних животных показали, что произошел серьезный дрейф штаммов микроорганизмов в сторону развития у них множественной резистентности к антибиотикам. Как указывают Н.В. Данилевская (2005), Н.В. Пименов (2006), в настоящее время наблюдается отсутствие эффективности многих препаратов последних поколений, которые никогда не назначали не только животным, использованным в эксперименте, но и в целом в ветеринарной медицине. Усугубило проблему использование антимикробных препаратов для профилактики желудочно-кишечных болезней, ассоциированных с дисбиотическими явлениями в микробиоценозе кишечника животных, что выразилось в нарастании множественной лекарственной резистентности условно-патогенных микроорганизмов, появлении и циркуляции в хозяйствах высоко вирулентных штаммов различных видов микроорганизмов (Девришов Д.А. с соавт., 1996; Мефед К.М., 2007). Применение антибиотиков в сельском (в т.ч. в кормах) и рыбном хозяйстве привело к появлению новых источников резистентных микроорганизмов. По данным А.П. Пехова (1986), при изучении последствий применения кормов, содержащих окситетрациклин, установлено, что устойчивые штаммы E.coli, содержащие R-плазмиды, могут переходить от сельскохозяйственных животных к работникам ферм. Расширение применения фторхинолонов в ветеринарной практике (учитывая перекрестную резистентность в пределах данной группы препаратов) значительно повышает риск возникновения устойчивых к ним патогенных бактерий (Падейская Е.Н., 2005). Применение в сельском хозяйстве гликопетидных антибиотиков привело к появлению ванкомицинорезистеных энтерококков в Европе. В связи с подобными фактами, как отмечает F.C. Tenover (2005), призыв к осторожному использовании антимикробных препаратов распространяется не только на здравоохранение, но и на ветеринарию, сельское хозяйство и животноводство.
Ретроспективный анализ инфекционной патологии собак в Иркутской области
Анализ эпизоотологической ситуации по инфекционной заболеваемости собак на изучаемой территории проведен по данным статистических отчетов Иркутской межведомственной ветеринарной лаборатории (табл. 2)
В 2004 г от собак (кал и патологический материал) выделено 5 культур диарегенных E.coli серотипов 02, 09, 018, 0141, 0121 (частный сектор Тулунского и Черемховского районов). В 3-х случаях у собак частного сектора г. Иркутска установлен лептоспироз. Псевдомоноз диагностирован у 10 собак при взятии смывов из ушей больных отитом, а также трупов собак (Иркутский, Братский и Тайшетский районы). Стафилококкоз выявлен у 188 собак частного сектора г. Иркутска и г. Братска (в т.ч. S.aureus - ИЗ, S.epidermidis - 75). Возбудитель стрептококкоза выделен в 22 случаях из смывов больных собак. Спектр условно-патогенных энтеробактерий был представлен P.vulgaris (18 случаев из смывов и патологического материала собак Иркутского и Братского районов), а также M.morganii (1 случай из смыва собаки частного сектора г. Иркутска). На микозы исследовано 96 проб, выявлено 2 случая микроспории.
В патологическом материале и смывах с прямой кишки собак методом ИФА выявлен антиген парвовируса у 6 собак, принадлежащих владельцам г.Иркутска. Кроме того, в патматериалах от собак установлен антиген вируса чумы плотоядных в одном случае по г. Иркутску.
В 2005 г всего было выделено 9 диареегенных E.coli прижизненно из кала, а также из трупов собак, в т.ч. в Иркутском районе - 1 случай серотип 01; в Братском районе - 2 штамма О20, 1 штамм 0111, 3 штамма 02, 1 штамм 01; в Тулунском районе - 1 случай О101.
Выявлен 1 случай лептоспироза при микроскопическом исследовании мочи собаки частного сектора г. Братска. Кроме того, у собак выделено 24 культуры P.aeruginosa. Псевдомонозы зарегистрированы у животных в частном секторе Иркутского, Братского и Тайшетского районов. При исследовании выделений с пораженных участков кожи, лап и ушей больных собак выделено 94 культуры S.aureus, 103 - S.epidermidis, 8 - S.haemoluticus, 32 - S.saprophyticus, 2 — S.lentus, 2 — S.intermedius. Также установлено 17 случаев стрептококкоза (S.faecalis) у собак частного сектора Братского района. При исследовании смывов от больных собак выделены следующие культуры: P.vulgaris — 21, M.morganii — 2, C.freundii — 2.
Методом ИФА выявлен антиген вируса аденовирусной инфекции в патматериале от собаки частного сектора Шелеховского района. В смывах из прямой кишки установлен антиген парвовирусной инфекции у 3-х собак, две из которых принадлежали владельцам г. Иркутска, 1 - Иркутского района. В 2006 г колибактериоз собак был представлен 1 случаем выделения штамма E.coli (серотип 02) в Куйтунском районе. Возбудитель псевдомоноза P.aeruginosa выделен в 15 случаях от больных собак частного сектора Иркутского и Братского районов. Стафилококкоз зарегистрирован в 326 случаях от больных собак, принадлежащих частным владельцам Иркутского, Братского, Качугского, Тайшетского, Куйтунского, Зиминского, Нижнеудинского, Усольского и Черемховского районов. При этом S.aureus верифицирован в 122 случаях, S.intermedius - 46, S.epidermidis - 101, S.saprophyticus - 30, S.haemoluticus - 22, S.ablus - 2, S.xylosus — 1, S.hyicus - 1, S.warneri в 1 случае. Стрептококкоз (S.faecalis) был диагностирован у 26 собак частного сектора Иркутского (7), Братского (13) и Тайшетского (6) районов.
При исследовании смывов от больных собак выделено 43 культуры: 37 — P.vulgaris, 1 — P.mirabilis, 5 — C.freundii.
При исследовании материалов на микозы у собак диагностированы 2 случая микроспории. Вирусологические исследования показали наличие парвовирусной инфекции у одной собаки, принадлежащей частному владельцу г. Иркутска.
В 2007 г зарегистрирован 1 случай колибактериоза, выделена кишечная палочка серотипа 02 из трупа щенка в Братском районе. Возбудитель псевдомоноза зарегистрирован по 11 случаев в Иркутском и Братском районах. В 523 случаях диагностирован стафилококкоз (смывы с ротовой полости, препуция больных собак, кошек, принадлежащих частным лицам), в т.ч. Иркутский район - 239, Братский район - 183, Нижне-Удинский - 36, Черемховский - 12, Тулунский - 4, Тайшетский - 4, Усольский - 4, Качугский - 1, Зиминский район - 40. При этом выделены S.intermedius, S.epidermidis, S.saprophyticus, S.haemoluticus, S.sciuri, S.aureus, S.xylosus, S.warneri. Стрептококкоз {S.faecalis) обнаружен в 40 случаях от больных собак.
Также отмечалось выделение условно-патогенных энтеробактерий (97 случаев). При этом 28 культур P.vulgaris изолировано из смывов больных собак Иркутского и Братского районов; 18 культур P.mirabilis - из смывов и кала собак Иркутского и Братского районов; 26 C.agglomerans -прижизненно от больных собак Иркутского, Братского, Зиминского районов; 26 культур C.freundii, C.diversus - со смывов собак Тулунского, Зиминского и Братского районов.
В 6 пробах патматерила от собак частного сектора г. Иркутска выявлен антиген аденовирусного гепатита, подтвержденный гистологическими исследованиями. Парвовирусная инфекция отмечена в 7 случаях у собак частного сектора г. Иркутска и г. Ангарска. Методом ИФА в патологическом материале от трупа собаки выявлен антиген чумы (1 случай). При серологической диагностике лептоспироза от собак исследовано 67 проб, получено 37 положительных результатов, процент реагирования составил 55,2%.
В 2008 г при микроскопическом исследовании мочи собак в 2 пробах обнаружены лептоспиры (Братский район). Стафилококкозы у собак отмечены в 401 случае, стрептококкозы — в 26 случаях. Прочие бактериальные возбудители были выделены в 84 случаях, т.ч. в Иркутском районе: 23 - P.vulgaris, 1 - P.mirabilis, 4 - E.agglomerans, 2 - C.freundii; в Братском районе: 42 - P.vulgaris, 4 - C.freundii; в Тулунском районе: 3 -С. di versus.
В 2009 г от собак частного сектора выделено 5 диареегенных E.coli методом смыва с прямой кишки (026, 086, ОП7, 09, ОП5, 033, ОП1). Лептоспироз установлен в 9 случаях при микроскопическом исследовании мочи собак (Иркутский район - 7, Братский район - 2). Псевдомоноз (P.aeruginosa) диагностирован в 10 случаях (Иркутский район - 3, Братский район - 7). В 305 случаях зарегистрирован стафилококкоз у больных собак, принадлежащих частным лицам в Иркутском, Братском, Усольском, Зиминском, Тайшетском, Черемховском, Боханском и Нижне-Удинском районе. При этом выделены следующие виды стафилококков: S.aureus, S. intermedins, S.epidermidis, S.saprophyticus, S.haemoluticus, S.xylosus, S.warneri. Стрептококки (S.faecalis) изолированы в 60 пробах смывов от собак.
Прочие бактериальные возбудители выделены в 96 случаях в Братском районе (P.mirabilis - 63, Bac.subtilis - 33), в 19 случаях в Иркутском районе (P.vulgaris - 9, P.mirabilis - 5, E.agglomerans - 4, P.rettgeri - 1), в 3 случаях в Черемховском районе (P.vulgaris - 3).
В 2010 г был выявлен один случай (Иркутский район) колибактериоза собак (смыв с прямой кишки). Выделена кишечная палочка серотипа 0115. Установлены 33 случая псевдомоноза (P.aeruginosa), в т.ч. в смывах с ушных раковин собак частного сектора Братского района - 25 случаев, в смывах с препуция больных собак в г. Иркутске - 8 случаев. Случаев стафилококкоза - 362, случаев стрептококкоза - 141. В 105 случаях выделяли УПМ из смывов с ушных раковин, препуция, влагалища, кожи
Методом иммуноферментного анализа выявлен антиген аденовирусного гепатита у 25 собак, принадлежащих частному сектору городов Иркутск, Ангарск, Усолье-Сибирское, Тайшет, п. Усть-Уда (в.т.ч. -из патологического материала от трупов собак - 15, крови - 1, смывов - 2, фекалий - 7). Также при исследовании патологического материала и взятии смывов с прямой кишки установлено 11 случаев парвовирусного энтерита у собак частного сектора городов Иркутск, Ангарск, Тайшет. Методом ИФА в одной пробе от собаки частного сектора г. Иркутска выявлен антиген чумы (смыв с прямой кишки).
В 2011 г было отмечено 5 случаев колибактериоза (1 - О20 из пробы кала у щенка, 4 - 02, 09, 0141, 041), 11 - микоплазмоза, 3 - псевдомоноза, 102 - стафилококкоза, 3 - стептококкоза. Условно-патогенную микрофлору выделяли в 12 случаях. Из микозов у собак были выявлены 11 случаев микроспории и 10 - трихофитии.
Антибиотикорезистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae
Возбудители кишечных инфекций у собак, представленные энтеробактериями, были протестированы на чувствительность к 16 антимикробным препаратам различных фармакологических групп (ампициллин, карбенициллин, цефазолин, цефалотин, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, тетрациклин, канамицин, гентамицин, амикацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, полимиксин, фурадонин, хлорамфеникол).
Проведенные исследования показали, что 20,0% бактерий семейства Enterobacteriaceae оказались чувствительными ко всем использованным в данной работе антимикробным препаратам. Остальная часть микроорганизмов проявила различную степень антибиотикоустойчивости.
Следует отметить, что среди диареегенных эшерихий количество микроорганизмов, чувствительных ко всем АПМ, составило 21,7% и было выше, чем среди условно-патогенных энтеробактерий (14,3%), однако, данное различие не носило значимого характера (р 0,05). Чувствительными оказались следующие штаммы: патогенные эшерихий (0139 - 100,0%; 08 -50,0%; 018 - 33,3%), а также E.agglomerans - 33,3%.
Установлено, что энтеробактерий имели широкий спектр устойчивости: от двух до 12 антимикробных препаратов. При этом в 6,7% случаях микроорганизмы были устойчивы к двум антибиотикам, в 10,0% - к трем, а в 3,3% - к четырем препаратам. Около 17% штаммов энтеробактерий оказались устойчивыми к пяти антимикробным препаратам. Почти половина (43,3%) энтеробактерий обладала множественной (т.е. к шести и более антимикробным препаратам) устойчивостью, при этом чаще отмечалась резистентность микроорганизмов к шести и семи антибиотикам (13,3%). Кроме того, исследованные штаммы энтеробактерий проявили устойчивость и к более широкому спектру антимикробных препаратов (к восьми, девяти и двенадцати антибиотикам) (рис. 10).
Энтеробактерий, полученные от собак, больных кишечными инфекциями, почти в половине случаев обладали резистентностью к шести и более антимикробным препаратам; 36,7% из них проявили устойчивость к двум-пяти АПМ, пятая часть оказалась чувствительной ко всем антибиотикам, а монорезистентные штаммы отсутствовали (рис. 11).
Эшерихии характеризовались наличием штаммов, устойчивых к широкому спектру антимикробных препаратов: от двух до девяти. При этом по 17,4%о составили штаммы, резистентные к пяти и семи АМП. Устойчивыми к двум-пяти АМП и полирезистентными (к шести и более антибиотикам) оказались по 39,1% диареегенных эшерихии. Свойством множественной антибиотикорезистентности обладали E.coli 08 (25,0%), E.coli 018 (33,3%), а также E.coli 015, 0141 и E.coli О101 (по 100,0%). Полиантибиотикорезистентность была выявлена у 66,7% ЕНЕС; 41,7% ЕТЕС и 25,0% ЕРЕС.
Среди условно-патогенных представителей энтеробактерии количественный спектр антибиотикорезистентности составил от трех до 12 антибиотиков. Устойчивость к двум-пяти препаратам проявили 28,6% штаммов. Полирезистентными оказались около 57,2% энтеробактерии.
Как видно из представленных данных, условно-патогенные энтеробактерии (Proteus spp., E.agglomerans, C.freundii), имея более широкий спектр антибиотикорезистентности (12 АМП) по сравнению с эшерихиями, чаще обладали свойством полирезистентности (57,2% и 39,1% соответственно) (р 0,05).
Штаммы Proteus spp. во всех случаях характеризовались резистентностью к 8-12 АМП, C.freundii - устойчивостью к пяти препаратам; среди E.agglomerans третья часть оказалась чувствительной ко всем антибиотикам; в 33,3% случаев имела место полиантибиотикорезистентность. Количественный спектр антибиотикоустойчивости отдельных представителей семейства Enterobacteriaceae показан на рисунке 12.
Изучение антибиотикоустойчивости исследованных штаммов к различным антибиотикам показало, что большая часть исследованных энтеробактерий проявили резистентность к полимиксину (60,0%), карбенициллину, цефотаксиму, цефтазидиму (около 51%), цефалотину (50,0%) и цефтриаксону (46,7%). Третья часть микроорганизмов оказалась устойчивой к цефазолину и фурадонину. К ампициллину и тетрациклину оказались резистентны 20,0 и 23,4% штаммов соответственно.
Значимо реже (р 0,05) отмечалась устойчивость к гентамицину, канамицину, амикацину, офлоксацину и ципрофлоксацину. Резистентность к данным антимикробным препаратам варьировала на уровне от 3,3% до 6,7% (рис. 13).
Как видно из вышеуказанного рисунка, промежуточная устойчивость у исследованных микроорганизмов чаще отмечалась в отношении к цефтриаксону 20,0%), тетрациклину (13,3%) и полимиксину (каждый десятый штамм). К остальным антимикробным препаратам встречаемость данного свойства варьировала от 3,3% (цефотаксим, цефтазидим, ципрофлоксацин) до 6,7% (ампициллин, карбенициллин, цефазолин, цефалотин, канамицин, амикацин). Не выявлена промежуточная резистентность энтеробактерий к гентамицину и офлоксацину.
Большинство энтеробактерий, выделенных от собак с кишечными инфекциями оказались чувствительными к канамицину, гентамицину, амикацину, офлоксацину, ципрофлоксацину (около 90%), хлорамфениколу (80,0%)), фурадонину, тетрациклину и ампициллину (около 70%).
Проведенные исследования показали, что среди отдельных представителей бактерий семейства Enterobacteriaceae к ампициллину продемонстрировали устойчивость только штаммы Proteus spp. и диареегенные штаммы Е.соИ. У всех прочих микроорганизмов выявлена либо промежуточная устойчивость, либо чувствительность к указанному антибиотику. К карбенициллину проявили устойчивость представители всех таксономических групп, за исключением C.freundii (рис. 14).
К цефазолину уровень резистентности патогенных кишечных палочек составил 26,1%; условно-патогенных энтеробактерий - 57,1%, в т.ч. бактерий родов Proteus - 100,0%; Enterobacter - 33,3%). К цефалотину были устойчивы около половины штаммов E.coli и более 70% УПЭ (за счет представителей родов Proteus, Enterobacter и Citrobacter). К цефотаксиму, цефтриаксону и цефтазидиму устойчивость продемонстрировали как условно-патогенные энтеробактерий (около 70%), так и диареегенные штаммы E.coli (на уровне от 39,1 до 52,3% ).
К канамицину оказались резистентны только штаммы Proteus spp., к гентамицину - диареегенные штаммы E.coli и к амикацину - Proteus spp. и штаммы E.coli. При этом резистентность к данным антимикробным препаратам условно-патогенных бактерий рода Proteus колебалась от 33,3% (канамицин) до 66,7% (амикацин), а резистентность диареегенных штаммов E.coli не превышала 8% (рис. 15).
Оптимизация терапии при моно- и ассоциированных инфекциях собак на территории Иркутской области
Для изучения особенностей применения антибиотиков при лечении больных собак проведен анализ их использования в факультетском клинико-экспериментальном отделе «Айболит» Иркутской государственной сельскохозяйственной академии и ветеринарной клинике г. Иркутска «Смайл». Для исследования были взяты данные амбулаторных журналов учета больных животных.
Лечение животных, больных кишечными инфекциями, проводят комплексно с использованием этиотропных средств, препаратов, нормализующих процессы пищеварения, предотвращающих обезвоживание, интоксикацию, а также стимулирующих иммунологическую реактивность организма.
Активными антимикробными препаратами являются:
1. Амоксициллин 15% LA применяется внутримышечно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы однократно.
2. Кобактан, содержащий в качестве действующего начала 29,64 мг цефкинома сульфата и в качестве вспомогательного вещества этилолеат до 1мл. Применяется в основном внутримышечно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы 1 раз в день в течение 10 дней.
3. Нороклав, содержащий в 1 мл в качестве действующих веществ 140 мг амоксициллина в форме амоксициллина тригидрата и 35 мг клавулановой кислоты. Применяется внутримышечно в дозе 1 мл на 12-15 кг живой массы 1 раз в день в течение 10 дней.
4. Амоксилав, содержащий 125 мг амоксициллина тригидрата и 31,25 мг калиевая соль клавулановой кислоты, а также вспомогательные компоненты: лимонная кислота безводная, натрия цитрат безводный, натрия бензоат, целлюлоза микрокристаллическая, натрия кармеллоза, ксантановая камедь, кремния диоксид коллоидный, кремния диоксид, натрия сахаринат, маннитол, ароматизаторы (клубничный, дикой вишни, лимонный). Применяется внутримышечно по 1 мл на 10 кг живой массы 1 раз в течение двух дней, всего 5 инъекций.
5. Интрамицин, содержит в 100 мл в качестве действующих веществ бензилпенициллина прокаиновую соль - 20 г и дигоидрострептомицина сульфат - 20 мг (20000000 ЕД), а в качестве вспомогательных компонентов: гидроксиметансульфинат натрия - 0,4 г, метилпарагидроксибензоат натрия -0,14 г, прокаин-гидрохлорид - 2,0 г. Сорбитол 70% - 13 г, цитрат натрия - 2 г, водную эмульсию полидиметилсиолксанового масла 30% - 0,05 г и воду для инъекций - до 100 мл. Применяется внутримышечно 1 мл на 10 кг живой массы 1 раз в день в течение 10 дней.
6. Гентам в 1 мл содержит 150 мг амоксициллина тригидрата и 40 мг гентамицина сульфата, а также вспомогательные компоненты: бутилгидрокситолуол, магния стеарат, спирт бензиловый и растительное масло. Применятся внутримышечно или подкожно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы однократно в течение 5 суток.
7. Байтрил в 1 мл содержит в качестве действующего вещества энрофлоксацин - 25 мг, а также вспомогательные компоненты - спирт бутиловый - 30 мг, калия гидрат окиси - 3,94 мг и воду для инъекций - до 1 мл. Применяется подкожно 1 раз в сутки в дозе 0,2 мл на 1 кг живой массы в течение 3-10 дней.
8. Зинаприм в 1 мл в качестве действующих веществ содержит 200 мг сульфаметазина и 40 мг триметоприма. Препарат вводят внутримышечно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы однократно в течение 3-5 суток.
9. Гентаприм в 1 мл в качестве действующих веществ 30 мг гентамицина сульфата, 200 мг сульфадиметоксина и 40 мг триметоприма. Применяется внутримышечно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы двукратно в течение 5 дней.
Ю.Альбипен ЛА, содержащий в качестве действующего вещества в 1 мл 100 мг ампициллина в форме ангидрида, а в качестве вспомогательных веществ - алюминия стеарат, додецил галлат, триглецириды. Применяется подкожно в дозе 1,5 мл на 10 кг живой массы однократно, при необходимости повторяют через 48 часов.
П.Кламоксил ЛА, содержит в 1 мл 150 мг амоксициллина и вспомогательные вещества алюминия стеарат и фракционированное кокосовое масло. Применяется подкожно в дозе 1 мл на 10 кг живой массы однократно, при необходимости вводят повторно через 48 часов.
Все используемые препараты относятся к антимикробным препаратам, проявляющими синергизм в отношении широкого спектра микроорганизмов. Широкое применение таких антибиотиков может также свидетельствовать о неточных или неопределенных диагнозах. Их длительное использования может привести к увеличению числа штаммов антибиотикоустойчивых возбудителей болезней собак, что указывает на возможность применения антибиотиков узкого спектра действия на основании анализа антибиотикочувствительности.
Нами проведено изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из прямой кишки больных кишечными инфекциями (колибактериоз и сальмонеллез) собак.
Возбудители кишечных инфекций представленные семействами Enterobacteriaceae, Micrococcaceae и Streptococcaceae были протестированы на чувствительность к 29 антимикробным препаратам различных фармакологических групп: ампициллин, карбенициллин, цефазолин, цефалотин, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, тетрациклин, канамицин, гентамицин, амикацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, полимиксин, фурадонин, хлорамфеникол, бензилпенициллин, оксациллин, цефалексин, цефуротаксон, цефаклор, эритромицин, рокситромицин, линкомицин, клиндамицин, рифампицин, ванкомицин, фузидин, линезолин.
Результаты исследований показали, что треть (36,4%) исследованных антибиотиков эффективно при лечении моно-инфекций и только 8,3% -ассоциированных инфекциях. Наиболее эффективными в отношении возбудителей, как моно-, так и ассоциированных инфекций оказались офлоксацин, ципрофлоксацин, гентамицин, канамицин, и амикацин. Из числа эффективных антибиотиков, действующих на бактерии рода Staphylococcus, как при моно-, так и при ассоциированных инфекциях, следует отметить ципрофлоксацин. Из используемых препаратов рекомендуем гентам и гентаприм.
Таким образом, при комплексном лечении собак, больных кишечными инфекциями, рекомендуем применение антибиотиков узкого спектра действия, таких как офлоксацин и ципрофлоксацин, а также гентам и гентаприм.
