Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы . 11
2.1 Распространенность бешенства 11
2.2 Биологические свойства возбудителя бешенства . 13
2.3 Методы диагностики и эпизоотологического мониторинга бешенства 16
2.4 Профилактика и меры борьбы с бешенством . 30
3 Результаты собственных исследований 34
3.1 Природно-географическая характеристика Калининградской области 34
3.2 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации и мер борьбы с бешенством в Калининградской области 35
3.3 Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области . 56
3.4 Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011-2013 гг 63
3.5 Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин 70
4 Заключение 76
5 Список сокращений 79
6 Список использованной литературы 80
7 Список иллюстративного материала 117
8 Приложения 120
- Биологические свойства возбудителя бешенства
- Методы диагностики и эпизоотологического мониторинга бешенства
- Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области
- Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Бешенство занимает исключительно важное место в инфекционной патологии, поскольку болезнь поражает большое количество видов домашних и диких животных, представляя смертельную опасность для человека. Эпизоотологическая, эпидемиологическая и социальная опасность данной болезни привлекает внимание как медицинских, так и ветеринарных специалистов во всем мире [2, 4, 8].
Оральная вакцинация является эффективным методом борьбы с природным бешенством, отвечающим интересам охраны природы и обеспечивающая устойчивость животных к заражению [10, 14].
В последние годы в Европейских странах показана значимость оральной иммунизации диких животных в борьбе с этой болезнью, которая позволила ликвидировать бешенство среди животных [5, 17].
Однако эти мероприятия, проводимые в России на протяжении многих лет, не привели к ожидаемому результату из-за отсутствия должной организации, неполной вакцинации поголовья и недостаточного финансирования мероприятий [9].
Вместе с тем, по мнению некоторых ученых [1, 2, 3, 15], аттенуированные вакцинные штаммы вируса бешенства РБ-71 (РВ-97), ЕRА, SAD B 19, SAD Bern, используемые для изготовления оральных вакцин, могут привести к поствакцинальному бешенству животных и циркулировать в природе.
В связи с этим, актуальной остается проблема контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне.
В тоже время, по данным ряда авторов [7, 13], научно обоснованные противоэпизоотические мероприятия должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии этого зооноза с учетом климатогеографических, экологических факторов и биологических свойств возбудителя бешенства, циркулирующего в регионе.
В этом отношении интерес представляет Калининградская область, расположенная в Центральной Европе, входящая в состав Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации, где начиная с 2007 г. по настоящее время проводится планомерная оральная вакцинация диких плотоядных животных.
Степень разработанности проблемы. По итогам международного семинара-совещания ветеринарных служб 39 стран СНГ и Европы, состоявшегося 03 сентября 2003 года по согласованию с Минсельхозом России, Калининградская область была включена в долгосрочную Международную Программу по искоренению бешенства животных. В рамках данной Программы Служба ветеринарии и государственной ветеринарной инспекции области совместно с Федеральным центром охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) разработала региональную Программу по оральной вакцинации диких плотоядных животных против бешенства в Калининградской области на 2007-2015 годы. В ходе реализации Программы, начиная с осени 2007 года в регионе, проводится оральная вакцинация диких плотоядных животных. Контроль эффективности вакцинопрофилактики на данной территории до 2010 года проводился ФГБУ «ВНИИЗЖ», начиная с 2010 г. по настоящее время - ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В доступной литературе имеются единичные данные о заболеваемости бешенством животных по Калининградской области за 1993-2000 гг. [11], однако данных по комплексному изучению ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области и биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории данного региона, не отмечено.
Цель и задачи. Цель исследований – провести анализ эпизоотической ситуации и изучить эффективность вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Изучить эпизоотолого-эпидемиологическую ситуацию по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг.
-
Провести анализ эффективности оральной вакцинации диких плотоядных животных по эпизоотологическим показателям.
-
Провести исследования костной ткани на обнаружение тетрациклина и сывороток крови на выявление вируснейтрализующих антирабических антител целевых животных, отстрелянных в зонах применения оральной вакцины.
-
Провести анализ биологических свойств изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах и в зонах проведения оральной вакцинации Калининградской области.
Научная новизна. Впервые проведен ветеринарно-географический анализ распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2013 гг., разработана карта эпизоотологического районирования территории области.
Изучены биологические свойства изолятов вируса бешенства, выделенные на территории Калининградской области, и установлено их антигенное соответствие вакцинным штаммам.
Проведен контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства среди диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011-2013 гг. и даны соответствующие рекомендации.
Теоретическая и практическая значимость. Установленное антигенное соответствие эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Калининградской области, вакцинным штаммам рабического вируса имеет важное значение для диагностики и профилактики бешенства в данном регионе.
В результате проведенных исследований разработаны: «Рекомендации по купированию первичных очагов бешенства», «Методические рекомендации по индикации возбудителя бешенства методом ОТ-ПЦР», «Информационное научно-популярное издание «Защити себя от бешенства», утв. директором ФГБУ «ФЦРТБ-ВНИВИ» чл.-корр. РАСХН, профессором А.В. Ивановым 09.06.2011 г., 14.11.2013 г. и 08.07.2013 г., соответственно. Издана Памятка по профилактике бешенства для населения (500 экз.), одобренная ученым советом ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», протокол №1 от 15.01.2013 г.
Представлены результаты эпизоотологического мониторинга распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2012 гг., разработана электронная эпизоотическая карта области по заболеванию бешенством животных с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Знания зон повышенного риска распространения болезни позволяют уточнять оптимальные масштабы и сроки профилактической вакцинации животных, своевременно регулировать численность диких животных и вести борьбу с бродячими собаками.
Показана прямая корреляционная связь заболеваемости бешенством животных с плотностью популяции лисиц с коэффициентом корреляции (r) равным 0,36. Рекомендовано снижение плотности популяции лисиц до 0,1-0,2 гол./км 2 в районах, где этот показатель выше.
Установлено, что способ раскладки вакцины с применением малой авиации является более эффективным по сравнению с раскладкой вручную, которое находит отражение на поедаемости вакцины и уровне заболеваемости бешенством среди диких животных.
Показано, что заболеваемость бешенством животных в целом в Калининградской области имеет обратную зависимость от объема вакцинации и кратности применения антирабической вакцины с r = – 0,66.
Установлена эффективность оральной вакцинации диких плотоядных животных на территории Калининградской области, которая обеспечила благополучие области по данной инфекции. При этом активность вируснейтрализующих антител в сыворотке крови целевых животных составила 0,5 МЕ/мл и более, свидетельствующая о достаточном уровне протективного иммунитета. Для создания популяционного иммунитета среди дикой фауны на территории Калининградской области, рекомендуем продолжать кампанию оральной вакцинации и контроль эффективности ее проведения.
Методология и методы исследования.
В работе применяли культуральные, вирусологические, серологические методы исследования, иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализы, реакцию нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С13, биопробу на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1.
Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории иммунологии и биохимии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» МСХ РФ, а также неблагополучных очагах по заболеваемости бешенством Калининградской области согласно тематическим планам НИР (№ госрегистрации 01200202604). Отдельные фрагменты работы выполнены с участием к.б.н. Сабировой В.В., к.в.н. Усольцева К.В. и зав. отделом организации и мониторинга противоэпизоотических и лечебно-прифилактических мероприятий ГУВ Калининградской области «СББЖ» ветврача Дреерис А.Ф.
Методы исследований
Метод иммунофлуоресценции (ИФ) проводили в прямом варианте по ГОСТу 26075-84 с использованием «Флуоресцирующего антирабического глобулина», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.
Прямой сэндвич - вариант ИФА проводили с использованием «Набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхоз-надзором 03.03.2008 г. [12].
Непрямой вариант ИФА для определения антител проводили согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г. [6]. В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Овечий» ГНКИ, по методу B. Dietzschold et al. (1996).
Реакцию нейтрализации (РН) проводили в культуре клеток ВНК-21 С 13 с использованием стандартного вируса бешенства CVS, адаптированного к культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике, рекомендованной МЭБ [16]. В качестве контрольной положительной сыворотки использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки (референс-сыворотка), сер. NCA-03 c активностью 20 МЕ/мл.
Выделение возбудителя бешенства проводили биопробой на белых мышах согласно ГОСТу 26075-84 и в культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) – согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г. [6].
Выделение вирусной РНК из проб патологического материала осуществляли согласно инструкции по применению для выделения РНК/ДНК «Рибо-сорб» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва), постановку обратной транскрипции – согласно инструкции по применению комплекта реагентов для получения кДНК на матрице «РЕВЕРТА-L» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва).
Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства проводили по эпизоотологическим показателям, а также оценке поедаемости антирабической вакцины согласно «Методическим указаниям по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в ткани зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», разработанным ВНИИЗЖ (2010), уровню сероконверсии у целевых животных в непрямом ИФА согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г.[6] и в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике, рекомендованной МЭБ (2008) [16].
Эпизоотологические исследования. Для решения отдельных вопросов эпизоотологии бешенства (распространения, эпизоотичность, сезонность, источник и факторы передачи возбудителя инфекции) применяли различные приемы и способы, описанные в «Рекомендациях по методике эпизоотического исследования» под редакцией И.А. Бакулова (1975). Эпизоотологическое районирование территории Калининградской области, а также количественную оценку напряженности эпизоотической ситуации проводили по методике, описанной М.Г. Таршисом и В.М. Константиновым (1975). При анализе эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области использовали статистические данные Госветслужбы и ТУ Роспотребнадзора по Калининградской области.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- характеристика эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг. Районирование территории области по степени распространения заболевания;
- биологическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах Калининградской области;
- поедаемость антирабической вакцины и уровень сероконверсии у целевых животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel. Для получения достоверных результатов все опыты проводили повторно не менее трех раз.
Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).
Биологические свойства возбудителя бешенства
При изучении особенностей бешенства в определенных районах России [18, 27, 35, 113, 174, 176, 225], обобщены: время, место вспышек эпизоотии, пути распространения. Все эти данные вносились в эпизоотологический кадастр неблагополучных пунктов. На основе картографирования обобщенного материала были определены пути и направления развития эпизоотии бешенства, что позволило установить определенную связь во времени и пространстве.
Из приведенных данных следует, что бешенство представляет исключительную опасность для людей и животных, является важной экологической, эпизоотологической, эпидемиологической и социально-экономической проблемой. Разработка научно обоснованных противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий требует изучения особенностей расселения вирусоносителей в каждом конкретном регионе, их экологии, пространственной структуры нозоареала с учетом территориальных и временных особенностей возможного распространения.
Несмотря на достигнутые успехи, проблема бешенства до конца не решена, она стала актуальной в связи с прогрессирующим распространением болезни среди диких животных [161].
Проведение противоэпизоотических мероприятий должно основываться на изучении краевой эпизоотологии этого зооноза, на своевременном выявлении возбудителя бешенства и изучении его биологических и молекулярно-генетических свойств штаммов возбудителя бешенства, циркулирующих в регионе [24, 85, 126, 136, 216, 228].
Биологические свойства возбудителя бешенства. Возбудитель бешенства животных и человека – РНК-содержащий вирус, относится к роду Lissavirus семейства Rhabdoviridae, имеет характерную для рабдовирусов пулевидную форму, покрыт липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой имеются выступы. Вирионы вируса имеют длину приблизительно 100-430 нанометров и в поперечном сечении около 45-100 нанометров [15].
Геномом является одноцепоченая РНК с молекулярной массой 3,5-4,6х106 дальтон.
Среди рабдовирусов позвоночных выделено 2 рода – Lissavirus и Vesiculovirus. Род Lissavirus включает вирус бешенства и подобные вирусу бешенства (лиссаподобные) вирусы, которые характеризуются как общностью основных свойств генома вириона, так и общей способностью вызывать энцефалит у позвоночных животных. Кроме того, у всех видов рода Lissavirus обнаружен общий групповой нуклеокапсидный антиген, который ответственен за продуцирование комплементсвязывающих и преципитирующих антител [45, 140, 200, 205, 214].
Нуклеопротеин является группоспецифическим антигеном для всех лиссавирусов, играет важную роль в развитии клеточного иммунитета и отвечает за выработку преципитирующих и комплементсвязывающих антител. Гликопротеин индуцирует образование вируснейтрализующих антител (ВН), отвечающих за протективный иммунитет. Кроме того, появляются литические антитела, разрушающие клетки, зараженные вирусом. РНК вируса бешенства кодирует 5 основных структурных белков: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (P-белок), матриксный протеин (M-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую, РНК-полимеразу (L-белок) [30].
Вирус имеет плавучую плотность в CsCI – 1,32 г/см3. Очищенные рабические вирионы содержат 2-3% РНК, 3% углеводов, 23% липидов и более 70% белка. Полипептид с самой высокой относительной молекулярной массой (отн. мол. масса 80000, 1783 молекул на вирион) оказался гликопротеином (G), образующим шипы внешней оболочки. Он ответственен за продукцию вируснейтрализующих антител, антигемагглютининов и за формирование иммунитета к заражению вирусом бешенства.
Вирус отличается значительной лабильностью биологических свойств. На основе различий гликопротеидного компонента, выявляемого в реакции нейтрализации, в группе вируса бешенства выделяют 12 генотипов, рода Lissavirus, к 1-ому генотипу относят абсолютное большинство уличных и фиксированных штаммов из различных частей света, в том числе и классический стандартный – CVS. Лиссаподобные вирусы остальных генотипов выделены первоначально на Африканском континенте от летучих мышей – Lagos bat virus (2-й генотип), от землеройки и человека – Mokola virus (3-й генотип), а также человека и летучей мыши – Duvenhage virus (4-й генотип). Позднее вирус Duvenhage был выделен на территории ФРГ и России [284]. К 5-му и 6-му генотипам относят вирусы европейских летучих мышей (EBL 1, EBL 2), к 7-му генотипу – австралийских летучих мышей (ABLV), к 8-му генотипу относят вирус Khujand, выделенный в Центральной Азии, к 9-му – вирус Aravan, выделенный в Центральной Азии, к 10-му – вирус Иркут – в Восточной Сибири, к 11-му – вирус Shimoni bat – в Кении, к 12-му генотипу – вирус западно-кавказских летучих мышей [61, 146, 233, 274, 302].
Биологические свойства вируса бешенства подвержены к естественной изменчивости. Установлено несколько биологических вариантов уличного вируса. Имеют определенные особенности штаммы вируса, выделяемые при арктическом бешенстве («диковании») животных, «болезни безумной собаки» в Западной Африке, при бешенстве крупного рогатого скота, распространяемом летучими мышами в Центральной и Южной Америке и передающими скоту паралитическую форму болезни. Отклоняется от классических и биологические свойства «лисьего бешенства», выделенные от мышевидных грызунов в центральной Европе, Лиссаподобных вирусов, выделенных от землеройки, летучих мышей и насекомых в Африке [62].
Методы диагностики и эпизоотологического мониторинга бешенства
Идентификация штаммов рабического вируса с помощью моноклональных антител. Перспективным в диагностике бешенства является и применение моноклональных антител, обладающих моноспецифичностью по сравнению с поликлональными антисыворотками и позволяющими проводить идентификацию штаммов рабического вируса в частности, дифференцировать серотипы – 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 9, 10, 11 и 12 вирусов группы бешенства [6, 8, 106, 109, 110, 168, 308, 309].
В настоящее время МКА успешно применяются для диагностики, антигенного анализа лиссавирусов, селекции аттенуированных и высокоиммуногенных мутантов вакцинного вируса, для картирования антигенной структуры рабического гликопротеина, идентификации эпизоотических вариантов полевых штаммов, а также для дифференциации полевых и вакцинных вирусов при широких опытах оральной иммунизации [110, 143, 152, 267, 291].
Использование МКА позволяет проводить также оценку антирабических вакцин по выявлению тех эпитопов гликопротеина (и др. структурных белков) ВБ, которые участвуют в формировании иммунного ответа организма [191].
В литературе имеются данные о применении МКА в качестве терапевтического средства при экспериментальном бешенстве [62].
В нашей стране изучению антигенных особенностей вирусов бешенства, циркулирующих на территории России, занимались М.А. Селимов [169], М.А. Селимов и соавт. [128, 130, 166], А.Д. Ботвинкин [38], А.Д. Ботвинкин и соавт.[7, 33, 35], С.В. Грибенча [62], С.В. Грибенча и соавт. [152], И.В. Кузмин и соавт. [106], М.А. Selimov et al. [283, 285], V.V. Khozinski et al. [278]. Впервые в стране авторы использовали МКА к нуклеопротеиду панелей института Wistar (Филадельфия, США) [309], Центральной ветеринарной лаборатории Великобритании (CVL, Уэйбридж, Великобритания) [260] и Центра вирусных болезней животных (Тюбенген, Германия) [281], цит. по Е.М. Полещук и соавт. [150]. А.Д. Ботвинкиным и соавт. [6, 35, 297] было установлено, что на территории России среди наземных млекопитающих распространены штаммы вирусов только серотипа 1. По классификации Международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV Master Species List 2009 – v 10 (9th Report) это вид Rabies virus (RABV, вид классического бешенства), соответствующий генотипу 1. Этими же авторами [6, 34, 35, 36, 285, 297] на территории страны среди летучих мышей (рукокрылых) была установлена циркуляция вирусов серотипов 1 и 5. Серотип 5 в настоящее время соответствует виду European bat lyssavirus-1 (EBLV-1, лиссавирус европейских летучих мышей 1-го типа). В России вирус этого генотипа был впервые выделен в 1985 г. от девочки, укушенной летучей мышью, в Белгороде [285]. К 2003 г. среди рукокрылых России была установлена циркуляция двух новых вирусов с оригинальными генотипами. На основании приоритетных работ российских исследователей Международный комитет по таксономии вирусов в 2009 г. присвоил им статус видов. Это «Иркут» (Irkut virus), выделенный А.Д. Ботвинкиным от трубконоса сибирского Murina leucogaster в Восточной Сибири (Иркутск) и Западной – Кавказский лиссавирус летучих мышей (West Caucasian bat virus), обнаруженный Е.М. Полещук и соавт. [77], А.D. Botvinkin et al. [274], I.V. Kuzmin et al. [237, 262, 275, 299]. В 2007 г. в Приморском крае от погибшей женщины, укушенной летучей мышью, был выделен штамм «Озерное», аналогичный вирусу Irkut [84]. Это второй случай гибели людей от бешенства после укуса летучими мышами в стране и третий случай выделения лиссавирусов «не серотипа 1» на территории России.
Среди представителей вирусов серотипа 1, циркулирующих среди наземных млекопитающих в России, было выявлено 9 антигенных вариантов [38, 6]. При этом антигенный вариант 1 характеризовался ограниченным географическим распространением. Он был обнаружен только в центральной части России – в Тульской, Брянской и Калужской областях. Вирусы варианта 2, а также группа имели очень широкое распространение и обнаруживались практически на всех территориях России. Варианты 3, 4, 5 были выделены на северо-западе страны в Псковской, Ленинградской, Калининградской областях. Дополнительно, вариант 3 был найден на севере Азиатской части России (Якутия), 5 – в Восточной Сибири (Забайкальский край). Варианты 6 и 8 циркулировали в Урале и в Сибири. Дополнительно вариант 6 найден в Центральной части России. Вариант 8 преобладал на юге страны (Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская область). Вариант 7 обнаружен на северо-востоке в Сибири, вариант 9 – в Тыве.
Для вариантов 3, 4, 5, 7, 9, распространенных главным образом на севере и северо-западе страны, [6, 35] установили положительную реакцию с моноклональным антителом P-41 из панели Центра вирусных болезней животных (Тюбинген, Германия), которое выступало маркером группы арктических и арктически подобных вирусов [281]. Положительно реагирующие с Р-41 маркером изоляты, были найдены также на территории Европейской части России, в Центральном (Тверская область) и Центрально-Черноземном районах (Курская область) [116, 267].
Вместе с тем, в пределах одной территории могут циркулировать одновременно несколько вариантов вируса, один из которых преобладает, а другие встречаются в единичных количествах. Было высказано предположение, что существенное значение в формировании ареалов этих вариантов принадлежит географическим барьерам, в качестве которых в условиях России могут выступать горные массивы и обширные территории с низкой плотностью популяций основных хозяев вируса (например, таежные массивы). В пределах области распространения генетической подгруппы вирусов ее представители были выделены от разных видов домашних и диких животных. При этом вирусы бешенства всех представленных подгрупп выделяли также и от человека. Связь с каким-либо специфическим хозяином генетическое подтверждение не получила.
Методы обнаружения генома вируса бешенства. Для обнаружения генома вируса бешенства используют два метода: дот-гибридизацию и обратно-траскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР).
Сущность метода дот-гибридизации заключается в выявлении и идентификации РНК вируса с использованием специфических ДНК зондов, в качестве которых используют меченый Р32 фаг М13, несущий вставки размером 200-400 п.о., комплементарные различным генам вакцинного штамма вируса бешенства (штамм РV) или рекомбинантную плазмиду, содержащую 96% кодирующей последовательности нуклеопротеина вируса бешенства (штамм ERA). Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешенства является обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) [241, 271, 280, 303]. С помощью ПЦР диагноз можно поставить до 5 ч. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 ч. ПЦР состоит из комплекса различных средств и методов – анализ длин амплифицированных фрагментов генома; определение STR SNP – маркеров; рестрикционный анализ; SybrGreen технология; high resolution melting – плавление с высоким разрешением; определение нуклеотидной последовательности; филогенетический анализ и молекулярное клонирование [102].
Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области
Из данных таблицы 4 видно, что максимальная обращаемость населения регистрировалась в 2008 г. – 2928 и за последующий период постепенно снижалась. Так, в 2011 г. по поводу укусов животными в лечебно-профилактические учреждения обратилось – 2469, в том числе дикими – 51, 2012 г. – 2417 человек, в том числе дикими – 58.
Максимальный курс антирабических прививок было оказано в 2009 г. и 2011г., за указанные годы госпитализировано 525 человек. К 2012 г. оказана медицинская помощь 1785 пострадавшим, в том числе в условиях стационара – 207. Случаев заболеваний гидрофобией, благодаря своевременно проведенным лечебно-профилактическим прививкам покусанных, не отмечено. Из данных таблицы 4 видно также, что обращаемость населения к 2012 г. снижается по сравнению с 2008 г. на 511 чел. и на 107 – госпитализированных пострадавших.
Нередко отмечались случаи самовольного отказа пострадавших после контакта с животными от лечебно-профилактических прививок. В этой связи необходимо проводить разъяснительную работу об опасности бешенства и мерах его профилактики среди населения, а также среди охотников, лесников, егерей и людей других профессий, которые находятся в группе риска. Случаев заболеваний гидрофобией, благодаря своевременно проведенным лечебно-профилактическим прививкам покусанных, не отмечено. В тоже время отмечались случаи самовольного отказа пострадавших после контакта с животными от лечебно-профилактических прививок. В этом отношении нами издана Памятка для населения по профилактике бешенства и информационное научно – популярное издание «Защити себя от бешенства», утв. директором ФГБУ «ФЦРТБ-ВНИВИ» от 08.07.2013 г. (см. Приложение А, Б).
Необходимо отметить, что Госветслужба Калининградской области постоянно взаимодействует с соответствующими структурами здравоохранения, оказывая бесплатную антирабическую помощь.
Меры борьбы с бешенством в Калининградской области. В связи с неблагополучной эпизоотической обстановкой по бешенству в Калининградской области и в целом в Российской Федерации, на территории области принято к исполнению Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 13 от 01.02.2012 г. «Об усилении мероприятий, направленных на профилактику бешенства в Российской Федерации».
В целях недопущения ухудшения обстановки по бешенству органами ветеринарного и государственного санитарно-эпидемиологического надзора Калининградской области проводится совместная организационная работа. Принято Постановление Главы администрации (губернатора)
Калининградской области от 10 мая 2000 года №181 «О мерах по предупреждению заболеваемости людей и животных бешенством».
В соответствии с этим Постановлением принято Постановление администрации Калининградской области от 29 сентября 2000 г. № 460 «Об утверждении Временных правил содержания собак и кошек в городах и других населенных пунктах области». Издан совместный Межведомственный план мероприятий по профилактике бешенства людей и животных в Калининградской области на 2006-2010 гг., предусматривающий проведение в полном объеме специфических мер профилактики районными и городскими службами, включающие противоэпидемические, противоэпизоотические мероприятия в период эпиднеблагополучия и мероприятия по ликвидации очагов бешенства. В соответствии с этим планом Территориальные управления Роспотребнадзора и Россельхознадзора по Калининградской области, а также Госветслужба области проводят ежегодные совещания заинтересованных служб для решения вопросов профилактики бешенства среди животных и предупреждения заболевания у людей, проводят эпидемиологическое расследование в очагах бешенства по каждому случаю укусов людей животными. Госветслужба области и органы здравоохранения проводит санитарно-просветительную работу среди населения о мерах по предупреждению бешенства.
Кроме того, ветспецалисты СББЖ обеспечивают своевременную диагностику бешенства животных, ликвидацию очагов болезни и в случае подтверждения бешенства разрабатывают оперативные планы по оздоровлению очагов заболевания. Для купирования первичных очагов и профилактике бешенства нами разработаны рекомендации, утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 09.06.2011 г. (см. Приложение В).
Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин
Из данных рисунков 10 и 11 в пробах срезов нижней челюсти лисиц и енотовидных собак, содержащих тетрациклин, видны кольца желтого цвета (№№ 50, 190, 248, 508, 792, 8, 557, 660, 611 и 676), что свидетельстует о поедании антирабической вакцины этими животными и их отсутствие - в пробах срезов ткани нижней челюсти животных, не содержащей тетрациклин (№ 35 и 337). При этом обнаружение в пробах нескольких колец (№№ 190, 508, 660 и 611), свидетельствовало о неоднократном поедании вакцины целевыми животными.
Из данных рисунков 12 и 13 в пробах срезов зубов лисиц и енотовидных собак, содержащих тетрациклин, видны полосы желтого цвета (№№ 136, 519, 153, 531, 628, 108, 441, 568, 442 и 603), что свидетельствует о поедании анирабической вакцины этими животными и их отсутствие – в пробах срезов зубов животных, не содержащих тетрациклин (№ 478 и 404). При этом обнаружение несколько желтых полос (№№136, 519, 153, 531, 628, 108, 441, 568, 603), свидетельствовало о неоднократном поедании вакцины целевыми животными.
Таким образом, анализом полученных данных установлена эффективность применяемой антирабической вакцины на анализируемой выборке животных, обеспечивающей поедаемость вакцины лисицами - 67,0% и енотовидными собаками – 52,0% и выработку специфических антител к вирусу бешенства у 64,5% лисиц и 51,0% енотовидных собак от вакцинированных.
Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин.
По данным ветслужбы Калининградской области, оральная вакцинация диких плотоядных животных в разные годы проводилась с использованием антирабических вакцин из разных штаммов: с 2007 по 2011 гг. – вакцина «Оралрабивак» из штамма «РВ-97», с 2012 по 2013 гг. – вакцина «Рабивак» из штамма «ERA G333». Отличалось и кратность применения антирабических вакцин. Так, в 2007-2009 гг. вакцинация проводилась однократно, а с 2010 г. – дважды в год весной и осенью. Необходимо отметить, что в разные годы отличался и способ раскладки антирабической вакцины. Так, в 2007 г. раскладка вакцины проводилась вручную, в 2008-2010 гг. – с применением малой авиации и частично вручную и в 2011-2013 гг. – с применением малой авиации.
В связи с вышеизложенным, на следующем этапе исследований интерес представляла сравнительная характеристика поедаемости вакцины, уровня сероконверсии, а также результатов исследований мозга целевых животных на наличие антигена вируса бешенства на фоне использования различных антирабических вакцин, способа раскладки и кратности их применения.
Кроме того, научно-практический интерес представлял анализ заболеваемости бешенством диких животных в Калининградской области на фоне применения различных антирабических вакцин.
Показано, что эффективность антирабической вакцинации зависит от штамма применяемой вакцины, кратности и способа е раскладки.
Установлено, что способ раскладки с применением малой авиации является более эффективным по сравнению с раскладкой вручную, которое находит отражение на поедаемости вакцины и на уровне заболеваемости бешенством среди диких животных.
Данные по заболеваемости бешенством диких животных на фоне проведенной антирабической вакцинопрофилактики в дикой фауне на территории Калининградской области за 2008-2013 гг. представлены в таблице 11.
Из данных таблицы 11 следует, что эффективность антирабической вакцинации зависит от штамма применяемой вакцины, кратности и способа е раскладки. Так, поедаемость вакцин при двукратном применении и их раскладки с применением малой авиации отличалась и составила 70,3% при использовании в 2011 г. вакцины «Оралрабивак» из штамма «РВ-97» и 62–, 63% – при использовании вакцины «Рабивак» из штамма «ERA 0/333» соответственно в 2012 и 2013 гг. Таблица 11 – Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на фоне применения различных антирабических вакцин на территории Калининградской области за 2007-2013 гг.
Наименованиевакцины Год применения вакцины Способ раскладкивакцины, кратностьвакцинации Выбор ка Поедаемость Уровень серокон версии Обнаружение вирусабешенства вмозге Количествовакцинированных дикихживотных, Заболеваемость бешенством среди диких животных:
Показано, что заболеваемость бешенством животных в целом в Калининградской области имеет обратную зависимость от объема вакцинации и кратности применения антирабической вакцины с r = – 0,66.
Анализ результатов исследований проб мозга на обнаружение антигена вируса бешенства целевых животных, проведенных в 2008, 2010-2013 гг. показали отрицательные результаты. По данным ветслужбы Калининградской области, исключение составили положительные результаты исследований 4-х проб головного мозга лисиц, отстрелянных на территории проведения вакцинации в 2009 г., что составило 2,6%. При этом использовалась антирабическая вакцина «Оралрабивак» из штамма «РВ-97».
Кроме того, поедаемость антирабической вакцины при одинаковых условиях раскладки и кратности ее применения зависела также от штамма вакцины. Так, поедаемость вакцин при двукратном применении и их раскладки с применением малой авиации отличалась и составила 70,3% при использовании вакцины «Оралрабивак» из штамма «РВ-97» в 2011 г. и 62-, 63%- при использовании вакцины «Рабивак» из штамма «ERA 0/333», которая использовалась в 2012 и 2013 гг. Однако, несмотря на это, заболеваемость бешенством среди диких животных в 2012 г. снизилась в два раза и составила 7 случаев, а в 2013 г. бешенство не отмечалось, что свидетельствовало о большей эффективности антирабической вакцины «Рабивак» из штамма «ERA 0/333».
