Содержание к диссертации
Введение
1. История создания пробиотиков 9
1.2. Молочнокислые бактерии, используемые для производства пробиотиков 13
1.2.1. Биология молочнокислых бактерий 13
1.2.2. Морфология молочнокислых бактерий 14
1.3. Общая характеристика пробиотиков 16
1.3.1. Классификация пробиотиков 16
1.3.2 Механизм действия пробиотиков 18
1.4. Желудочно-кишечные заболевания у поросят и пути их лечения ... 27
2. План и общие вопросы методики исследований 33
2.1. Цель и задачи исследования 33
2.2. Методика анализа кормов 34
2.3. Методика определения переваримости веществ и энергии рациона кормления 36
2.4. Условия и методика проведения исследований 37
2.5. Методика математической обработки результатов исследований 39
3. Результаты лабораторных исследований 41
3.1. Объект исследований 41
3.2. Подбор питательных сред 41
3.3. Определение антибиотике-чувствительности штамма Lacbacilhis acidophilus 42 : 46
3.5. Определение рН жидкой культуры : 53
3.6. Устойчивость L. acidophilus 42 к NaCI и желчи 56
4. Результаты научно-хозяйственного опыта 58
4.1. Цель научно-хозяйственных исследований 58
4.2. Определение оптимальной дозы применения пробиотика «Мультибактерин» 58
4.2.1. Характеристика подопытных животных 59
4.1.1. Характеристика кормления в опыте 62
4.1.2. Динамика живой массы поросят-отъемышей при использовании и пробиотика «Мультибактерин» 67
4.2. Результаты опыта по переваримости питательных веществ рациона 71
4.2.1. Характеристика подопытных животных 71
4.2.2. Характеристика кормления животных 72
4.2.3. Динамика живой массы поросят в возрасте 2,5 мес, при применении пробиотика «Мультибактерин» 76
4.2.4. Переваримость питательных веществ рациона 77
4.2.5. Распределение и обмен энергии в организме поросят 79
5. Производственная проверка результатов , 81
5.1. Характеристика подопытных животных 81
5.2. Условия кормления 84
Обсуждение результатов опытов 88
Выводы 98
Рекомендации по использованию научных выводов 99
Список литературы 101
Приложения 117
- Желудочно-кишечные заболевания у поросят и пути их лечения
- Методика определения переваримости веществ и энергии рациона кормления
- Определение антибиотике-чувствительности штамма Lacbacilhis acidophilus
- Определение оптимальной дозы применения пробиотика «Мультибактерин»
Введение к работе
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Одной из основных причин отхода молодняка свиней занимают заболевания, связанные с нарушениями деятельности желудочно-кишечного тракта, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора. Сложившаяся ситуация заставила пересмотреть многие методологические подходы к профилактике и лечению заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (С.Н. Александров, Е.В. Прокопенко, 2004; Л. М. Осина, 2005; Р.И. Шейко, 2004).
Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Принцип использования пробиотиков основан на заселении кишечника конкурентно-способными штаммами бактерий-пробионтов, осуществляющих неспецифический контроль над численностью условно-патогенной микрофлоры путем вытеснения их из состава кишечной популяции и сдерживания развития у них факторов патогенности. Помимо этого нормальная кишечная микрофлора обеспечивает физиологическую целостность- многих систем организма, связанных с формированием общей лимфоретикулярной системы и местного локального иммунитета слизистой кишечника, гормональной и эндокринной систем. Дефицит нормальной микрофлоры способствует развитию дисбактериозов, усилению' патогенных свойств у ассоциации энтеробактерий, нарушению морфо-функционального развития иммуно-компетентных органов, извращению процессов микробного кишечного
пищеварения, нарушению процессов метаболизма, всасывания и транспорта питательных веществ корма (СИ. Горбунов и др., 2004; Т.Н. Грезнева, 2005; В. Левахин, 2006; А.Н. Панин, Н.И. Малик, 2006; Е.А. Смирнова, 2007; Т. Удалова> 2007).
. Таким образом, аспекты использования пробиотиков затрагивают довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишечного биоценоза и распространяясь на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной системы, как молодняка, так и взрослых животных. В то же время использование пробиотиков имеет актуальное значение не только для животноводства, но и для здравоохранения как огромный потенциал по снижению риска заболеваемости людей и повышения экологической безопасности сельскохозяйственной продукции.
Поэтому изучение эффективности выращивания поросят с использованием пробиотика «Мультибактерин» на основе штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 42 является актуальным.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 42, входящего в состав пробиотика «Мультибактерин» на рост, развития и сохранность поросят-отъемышей, а также разработка метода раннего воздействия препарата на повышение продуктивности поросят, отстающих в росте при дисбактериозе ЖКТ.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить штамм Lactobacillus acidophilus 42, входящий в состав кормовой добавки «Мультибактерин»: подбор питательных сред, антибиотико-чувствительность, ферментативную активность, выделение С02, рН среды, влияние различных концентраций , NaCl, желчи;
определить оптимальную дозу ввода изучаемого препарата;
изучить влияние скармливания опытного пробиотика на поедаемость кормов животными, динамику живой массы, на переваримость питательных веществ комбикормов и сохранность животных;
по результатам комплексных исследований, определить эффективность пробиотика «Мультибактерин» для откармливаемого молодняка свиней;
определить экономическую эффективность использования пробиотика «Мультибактерин»;
разработать и предложить производству рекомендации по эффективному использованию пробиотика «Мультибактерин»..
Научная новизна работы заключается в том, что впервые нами изучены свойства штамма Lactobacillus acidophilus 42 и установлено, что культура обладает высокой ферментативной активностью и продуцирует бактериоцины, обуславливающие антагонистическое действие в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих желудочно-кишечные болезни у поросят-отъёмышей.
Впервые, на основе штамма Lactobacillus acidophilus 42 сконструирован пробиотик «Мультибактерин» и в условиях свиноводческого комплекса ЗАО «Заря» Республики Беларусь, изучено его влияние на организм поросят-отъемышей.' Установлено, что применение пробиотика «Мультибактерин» способствовало улучшению переваримости и эффективности использования организмом поросят на откорме питательных веществ комбикорма, увеличению энергии роста, развития и сохранности поросят.
Практическая значимость работы состоит в том, что нами разработан пробиотический препарат «Мультибактерин», применение которого в оптимальной дозе (4 мл/гол/сут) способствует повышению продуктивности поросят: среднесуточные приросты поросят увеличиваются на 50%. Обеспечивается повышение переваримости сухого вещества - на 5,2, сырого протеина - на 3,8, сырой клетчатки - на 2,3, сырого жира — на 0,2 и БЭВ - на 8,2% по сравнению с переваримостью этих веществ в контрольной группе. В результате скармливания кормовой добавки «Мультибактерин» в
составе комбикорма для откармливаемых поросят увеличивало сохранность животных до 96,8%.
Результаты исследований внедрены в ряде хозяйств Белгородской, Ленинградской областей и Республики Беларусь.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на международной научной конференции «Молодые ученые в научном обеспечении сельского хозяйства на современном этапе развития» (С.-Петербург, 2004 г); на научной конференции «Прогрессивные технологии в Аграрной Науке», (С.-Петербург, 2005 г); на научных конференциях профессорско- преподавательского состава и аспирантов Санкт-Петербургского государственного аграрного университета (С.Петербург; 2005-2008 г); на 5-й Республиканской научно-практической конференции "Витебская государственная академия ветеринарной медицины" (Витебск, 2006 г); расширенном заседании кафедры кормления и гигиены животных СПбГАУ (С.-Петербург, 2009). Основные положения, выносимые на защиту:
особенности воздействия пробиотика «Мультибактерин» на поросятах разновозрастных групп;
экономическая обоснованность выращивания поросят-отъемышей при скармливании пробиотика «Мультибактерин»;
-практические рекомендации по применению пробиотика в качестве кормового фактора для выращивания поросят.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано.7 работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Работа изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит. из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, выводов и предложения производству.' Содержит 26 таблиц, 5 рисунков. Библиографический список литературы состоит из 155 источников.
1. История создания пробиотиков
Развитие идеи И.И. Мечникова по целенаправленному изменению состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта путем энтерального введения культур молочно-кислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов оформилось в направление и привело к созданию нового класса бактериальных препаратов - пробиотиков.
В работе Б.А. Шендерова с соавторами (1997) прослежена история появления термина пробиотики и толкование этого термина различными исследователями. По их мнению, термин пробиотик ввели D.M. Lilly и R.H. Stillwell в 1965 г. для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост микроорганизмов. В 1970 г. М. Gros, G. Jhielin назвали пробиотиками биологические препараты, представляющие собой стабилизированные культуры симбионтных микроорганизмов или продукты их ферментации, которые способствуют росту последних.
В 1974 г. R.B. Parker назвал пробиотиками микробные препараты (микроорганизмы или их компоненты), регулирующие микрофлору кишечника.
В Дании Т. Riise (1981) предложил под названием пробиотик понимать «...увеличение количества полезных микроорганизмов в пищеварительном тракте животного-хозяина путем введения больших количеств желательных бактерий для переустановления и поддержания идеальной ситуации в кишечнике».
R. Fuller (1989) считает пробиотиками «живую микробную кормовую добавку, которая оказывает полезное действие на животное- хозяина путем улучшения его кишечного микробного баланса».
M.Vanbelle и др. (1990) определяют понятие пробиотик как антоним антибиотиков, т.е. продолжающий жизнь.
По мнению Е.В. Зинченко (2003), термин пробиотики был предложен Паркером для обозначения микроорганизмов и продуктов их ферментации,
обладающих антагонистической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.
По определению Simons D.C. (1990), пробиотики - это микробиологические пищевые добавки, которые благотворно влияют на хозяина путем улучшения микробиологического баланса его кишечника.
Рассматривая проблему дисбактериозов у животных, Ю.С. Алкин с соавт. (1997) называют биопрепараты из нормальной микрофлоры, используемые для профилактики и лечения этого заболевания, эубиотйками. К ним авторы относят препараты, содержащие бифидо- и лактобактерии, E.coli, споровые формы бактерий. Однако Б.А. Щендеров с соавт. (1997) считают, что эубиотики - термин, который используется в основном российскими исследователями и по своей сути охватывает лишь- часть пробиотиков.
По мнению Б.А. Шендерова, пробиотики - это препараты и продукты питания, в состав которых входят вещества микробного и немикробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса. Это определение предполагает, что любые живые или убитые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а также вещества другого происхождения, оказывающие позитивное влияние на функционирование, микрофлоры хозяина, способствующие лучшей адаптации его к окружающей среде в конкретной экологической нише, могут рассматриваться как пробиотики.
Отсутствие четкого определения препаратов этой группы, по-видимому, можно объяснить недостаточной изученностью их фармакодинамики (Квасников Е.И., 1995). Это стало возможным в связи с тем, что большинство авторов относили пробиотики к кормовым добавкам. На основании результатов многолетних исследований, пробиотики следует отнести к лекарственным средствам, которые предпочтительнее
использовать для превентивной терапии и в качестве эрготропиков (Анохин Б.М., 1987; Шендеров Б.А., 1997; Алкин Ю.С., 1997).
По их мнению, пробиотики - это стабилизированные культуры микроорганизмов и продукты их ферментации, обладающие свойством оптимизировать кишечные микробиоценозы, подавлять рост и развитие патогенной и условно-патогенной микрофлоры, повышать обменные процессы и защитные реакции организма, активизировать клеточный и гуморальный иммунитет.
Запруднов A.M. (1999) назвал наше время «наступающей эпохой пробиотиков». Действительно, многочисленные исследования по разработке новых биопрепаратов и дальнейшее изучение механизма их лечебно-профилактического действия дают основание утверждать, что в XXI в. пробиотики в значительной степени потеснят на рынке традиционные и небезопасные для организма препараты, особенно те, которые применяются с профилактической' целью. В последний период наряду с пробиотиками в ветеринарной медицине применяют пребиотики и синбиотики.
По данным Л.Ф. Бакулина (2001), к пребиотикам относятся препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активности нормальной микрофлоры кишечника. Пребиотиками, в частности, являются олигосахариды, например фруктоолигосахариды, активно стимулирующие рост бифидобактерий. Полагают, что при рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков возможен максимальный позитивный эффект. Получаемые в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков препараты называю симбиотиками (Шендеров Б.А., 1997).
Для производства пробиотиков вначале использовали не спорообразующие бактерии, обладающие свойствами выделять при сбраживании углеводов молочную, уксусную, пропионовую и другие кислоты. Поскольку в нормальной микрофлоре теплокровных преобладает
ацидофильная палочка, то в качестве пробиотика стали использовать ацидофильную бульонную культуру (АБК) (Анохин Б.М., 1987).
В дальнейшем для обогащения препарата витаминами группы В к АБК стали добавлять пропионово-кислые бактерии, что, несомненно, улучшило качество препарата и расширило сферу его применения. Этот препарат стали выпускать под названием ПАБК. Применение АБК и ПАБК повышало общую устойчивость животных и улучшало пищеварение, профилактировало развитие инфекционных заболеваний, излечивало желудочно-кишечные заболевания, стимулировало рост молодняка, а также улучшало течение беременности (Анохин Б.М., 1987).
В нашей стране в начале 60-х годов XX в животноводстве широко применяли жидкие формы симбионтных микроорганизмов (АБК и ПАБК), которые изготовляли непосредственно во многих хозяйствах и ветеринарных лабораториях. Однако такие недостатки, как нестандартность продукции, неудобства хранения и транспортировки, быстрая потеря активности, способствовали сокращению их выпуска и применения. В настоящее время эти препараты выпускают лишь на отдельных предприятиях и в лабораториях, но эти количества не удовлетворяют спрос, и поэтому некоторые хозяйства, особенно птицефабрики, вновь наладили их производство.
В дальнейшем на основе живых бифидо- и лактобактерий были
созданы различные препаративные формы (лактобактерин,
бифидумбактерин, ацидофилин, колибактерин и др.), которые до настоящего времени широко используются для восстановления нормальной микрофлоры и лечения желудочно-кишечных заболеваний (Архипов, 1963; Бурделев, 1971). Бифидо- и лактобактерий, преобладающие в нормальной микрофлоре животных, подавляют размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов путем закислення среды обитания и наработки антибиотических веществ. Попадая в желудочно-кишечный тракт, присутствующие в этих препаратах микроорганизмы размножаются,
синтезируют многие биологически активные вещества (органические кислоты, липиды, витамины, антибиотики, иммуномодуляторы и т.п.) и повышают неспецифическую резистентность организма-хозяина.
Со временем расширялся спектр используемых для получения пробиотиков микроорганизмов. Развитие лиофилизационной техники позволило разрешить эти проблемы, теперь пробиотики выпускают в виде сухих препаратов лиофильно высушенных микроорганизмов в чистом виде или в технической форме с питательной средой. В качестве наполнителей для сухих препаратов используют сухое молоко, сахарозу, а для технической формы - кукурузную, рыбную или другую муку. Такие формы наиболее удобны (в отличие от жидких) при групповом назначении животным с кормом (Войчитина, Чаплинский, Вьюницкая, 1991).
Создание сухих форм пробиотических препаратов позволило расширить сферу их применения и выпускать более стандартизованные препараты, длительное время сохраняющие свои свойства. Твердые формы бифидобактерина (лиофилизированная биомасса активных бифидобактерий) и лактобактерина (смесь двух штаммов лактобактерий), применяемые для профилактики и лечения у телят желудочно-кишечных заболеваний, показали высокую эффективность (Квасников и соавт., 1995; Коне, 1997; Коршунов, 1985).
Желудочно-кишечные заболевания у поросят и пути их лечения
Желудочно-кишечные заболевания у поросят в первые дни жизни широко распространены в хозяйствах и регистрируются у 74,3 % заболевших поросят, а падеж от них достигает 61,4 % от общего числа павших (Абрамов С.С., Аристов И.Г., 1992 г.).
Нормальная микрофлора животного организма - совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп в организме хозяина. Суммарное количество бактериальных клеток всех микробиоценозов в сотни раз превышает общее число клеток всех тканей и органов макроорганизма (их общее число достигает 1014). Это огромное число микробных клеток и их видовое разнообразие (более 400 видов) обеспечивают участие нормальной микрофлоры в самых разнообразных физиологических функциях макроорганизма. .
В табл. 1. приведены лишь облигатно анаэробные микроорганизмы-представители кишечной флоры. В настоящее время установлено, что на долю строго анаэробных видов в кишечнике приходится 95—99%, а все аэробные и факультативно анаэробные виды составляют оставшиеся 1—5%.
У. новорожденных животных естественная неспецифическая защита осуществляется за счет клеточных факторов. Иммунная система формирует основные механизмы физиологической устойчивости постепенно (Абрамов С.С, Арестов И.Г.,1992 г.). Различают три периода и критических этапа в развитии поросят. 1-й период - до приема молозива. В этот период в сыворотке крови поросят отсутствуют антитела, поэтому очень важен своевременный прием. молозива, которое содержит высокий уровень иммуноглобулинов, клеточные факторы (Т- и В-лимфоциты, микрофаги, нейтрфилы) (Ноздрин Г.А., Наумкин И.В., 1992 г.), (Федоров Ю.Н., Горбунова М.Ю., 1983 г.). . Абсорбция иммуноглобулинов молозива происходит в первые часы жизни и продолжается (24-26) часов, постепенно достигая максимального уровня через (24-28) часов (Дворецкий Л.И., 1990 г.). 2-й период - (14-21) день жизни: В этот период антитела, полученные с молозивом, расходуются, а активное продуцирование собственных антител остаётся на нужном уровне. Характерно ослабление резистентности к неблагоприятным факторам внешней среды и воздействию патогенной и условно-патогенной микрофлоры. 3-й период связан с периодом отъема, сменой типа кормления. Изменяется состав пищи, кислотность и состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта (Кузин П.И.,1989 г.).
В первые дни жизни поросят их желудок не содержит соляной кислоты, без которой не могут нормально функционировать ферменты, переваривающие белки и жиры. Такой желудочный сок имеет низкую переваривающую способность и бактерицидные свойства (Коробов А., 1970 г.). При заболевании поросят отмечают нарушение секреторной функции желудка, снижение общей кислотности и отсутствие свободной соляной кислоты (Ковский А.Б., 1970 г.).
При нарушении метаболизма в организме беременных маток изменяются клеточные и гуморальные факторы естественной защиты и у поросят (Григорян О.И., Биол Е.А., Степина М.А., 1987 г.). Нарушение обмена веществ маточного поголовья влечет за собой отклонения в развитии плодов и рождение поросят с низкой живой массой и морфофункциональным недоразвитием (Федоров Ю.Н., 1982 г.). . Решающее значение имеет дисбактериоз, возникающий на фоне неправильного получения и выращивания поросят (Морозов В.Г., Кавинсон В.Ж., 1986 г.).
Пищеварительная система поросят в эмбриональный период свободна от- микроорганизмов. Инфицирование начинается уже во время родов (Проходин С.Г., 1990 г.). Через сутки в фекалиях поросят обнаруживается много микроорганизмов (Ахмутзянов Ф.В., 1966 г.). Состав микрофлоры зависит от типа кормления. Холодная пища обуславливает резкое снижение числа молочнокислых бактерий и увеличивает уровень кишечной палочки и энтерококков (Тимоненко М.А., Холмецкая В.Г., Бусуп И.Ф., 1966 г.).
В составе микрофлоры желудочно-кишечного тракта поросят общее количество аэробов преобладает над анаэробами (Ахмутзянов Ф.В., Г966 г.). Из нормальной микрофлоры высевается молочнокислые бактерии, затем кишечная палочка, энтерококки, дрожжеподобные грибки и бациллы перфрингенс (Проходин С.Г., 1990 г.).
Методика определения переваримости веществ и энергии рациона кормления
Лабораторные исследования, по изучению штамма Lactobacillus acidophilus 42 входящего в состав пробиотика «Мультибактерин», проводили на кафедрах кормление и гигиены животных и микробиологии Санкт-Петербургского Государственного Аграрного Университета. Для определения чувствительности штамма L. acidophilus 42 к антибиотикам использовали диски (НИЦФ) пропитанные антибиотиком. Количественную оценку выделение L. acidophilus 42 углекислого газа определяли газовым хроматографом «Цвет 4». Активность ионов водорода (рН) в жидкой среде, для культивирования микроорганизмов пробиотика, определяли микропроцессорным прибором Иономер И-500. Для решения поставленных задач нами была проведена серия исследований на молодняке свиней, которая состояла из двух научно-хозяйственных опытов и производственной проверке, по влиянию кормовой добавки пробиотического действия «Мультибактерин», на сохранность, рост и развитие поросят разновозрастных групп. Исследования проводили на свиноводческом комплексе ЗАО «Заря» . Республики Беларусь, по следующей схеме (таблица 2): Общая численность поголовья свинокомплекса составляет 19500 голов. Основными критериями при формировании опытных групп аналогов в научно-хозяйственных опытах являлись: порода, возраст, живая масса, на .начало опыта. Характеристика животных в опыте, а также показатели достоверности разницы между контрольными и опытными группами представлены в приложении. I научно-хозяйственный опыт проведен на 80 поросятах-отъемышах в возрасте 30 суток. Продолжительность опыта составляла 15 дней.
В рацион кормления поросят входил комбикорм марки СК-11 и молочная сыворотка. В задачу опыта входило определить оптимальную дозу применения пробиотического препарата «Мультибактерин». II научно-хозяйственный опыт (переваримость питательных веществ рациона) проводили на 20 поросятах с живой массой 18....20 кг в возрасте 2,5 месяца. Опыт проведен в специально изготовленных спаренных обменных деревянных клетках, которые-устанавливали в помещении свинарника ЗАО «Заря». В этом свинарнике была отведена одна секция для проведения физиологических опытов с автономным водоснабжением, помещением для лаборатории, весовой, складом для кормов. В каждую клетку помещали три подсвинка соответствующих опытных групп. Для опыта по перевараримости питательных веществ рациона использовали комбикорм марки СК-21. Производственная проверка результатов исследований проведена в хозяйстве ЗАО «Заря», Витебская область, Республика Беларусь, на поголовье 2000 тыс. голов молодняка свиней в возрасте от 28 - 33 суток. Из них за контроль взято 1000 голов. В течение производственного опыта кормление и содержание животных было групповым, по 20 голов в клетке, со свободным доступом к питьевой воде. Необходимость доказательства достоверности того или иного фактора при постановке опытов невозможна без серьезного математического анализа. Поэтому, для определения надежности научных прогнозов и доказательности рекомендаций, касающихся новых методов кормления животных, необходимо определять достоверность тех результатов, на основании которых разработаны эти рекомендации. При выборе математико-статистических методов обработки материалов наших исследований исходили из целей и задач постановки опытов. При подборе животных в группы, а также при обработке результатов исследований рассчитывались: средняя арифметическая (М) и ее ошибка (±т); дисперсия или сумма квадратов центральных отклонений - С; среднеквадратическое отклонение - а; ошибка разности - md; достоверность разности - td; во многих случаях вычислялись коэффициенты корреляции (г) и уравнения регрессии (у). При этом в зависимости от целесообразности рассчитывались как частные, так и множественные уравнения регрессии. Цифровой материал опытов подвергнут статистической обработке с применением корреляционного, регрессионного и дисперсионного анализов по Н.А. Плохинскому, программе многофакторного регрессионного анализа и на ПК с применением программ Microsoft Excel.
Определение антибиотике-чувствительности штамма Lacbacilhis acidophilus
Совместное применение пробиотиков с антибиотиками позволяет снизить риск ассоциированного с антибиотиками дисбактериоза или уменьшить его тяжесть.
Для оценки чувствительности штамма Lacbacillus acidophilus 42 к антибиотику используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
Выбранную питательную среду для определения чувствительности готовят из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при +4 - +8С в течение 5 суток.
При определении чувствительности штамма Lacbacillus acidophilus 42 к антибиотикам на поверхность, питательной среды, засеянного бактериальной культурой, помещали диски, пропитанные антибиотиками. Диски были произведены в научно-исследовательском центре фармакотерапии (НИЦФ, г.Санкт-Петербург) по ГОСТ 6722-65 из специального картона, пропитанного антибиотиками. Их диаметром составляет 6 мм. Всего было использовано 30 различных антибиотиков (приложение 2).
Необходимым условием получения достоверных и воспроизводимых результатов являлась максимальная стандартизация условий опыта. Каждое исследование проводилось в 3-х кратной повторности.
Жидкую среду разливали по 20 мл в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на строго горизонтальной поверхности. Перед заражением поверхность застывшей среды подсушивали в течение 30-40 мин. в термостате. Выбор питательной среды являлся одной из наиболее важных проблем при определении чувствительности микробов к антибиотикам, поскольку ее состав существенно отражается на результатах исследований. Трудно поддаются стандартизации такие компоненты питательных сред, как пептон разных видов, мясной гидролизат.
Суточную бактериальную культуру равномерно распределяли. шпателем по поверхности застывшей питательной среды, после чего с помощью стерильно пинцета помещали диски с антибиотиком на одинаковом расстоянии один от другого и на расстоянии 2 см от края чашки Петри. На одну чашку помещали .не более 3 дисков. Чашки Петри инкубировали в течение 18 ч при температуре 42С.
Для получения результатов измеряли диаметр зон задержки роста штамма вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с помощью циркуля и линейки (рисунок 3).
Метод определения чувствительности с помощью дисков является качественным, позволяющим установить лишь факт чувствительности или устойчивости объекта исследований к данному антибиотику. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска свидетельствовало о том, что штамм устойчив к данному антибиотику.
Наличие единичных колоний или тонкой бактериальной пленки внутри зоны задержки роста не свидетельствовали о резистентности штамма к данному антибиотику. Размер зон зависел от толщины слоя агар-агара, густоты микробного газона и состава среды. Однако в стандартных условиях опыта по величине зон можно было судить о степени антибиотикорезистентности исследуемого штамма.
Результаты (табл. 7) показали положительное действие штамма Lacbacillus acidophilus 42, к ряду антибиотиков используемых в работе. Положительное действие обуславливалось отсутствием зон задержки роста культуры с применение антибиотиков: азтреонам, карбенициллин, левомицетин, ломефлоксацин, налидиксовая к-та, норфлоксацин, пефлоксацин, цефтазидим, ципрофлоксацин, цефуроксим, цефепим, цефоперазон, цефотаксим, цефалотин, канамицин.
Отрицательное действие к антибиотикам таким как: ампициллин, гентамицин, меропенем, офлоксацин, бензилпенициллин, пиперациллин, полимиксин, стрептомицин, тетрациклин, тилозин, тобрамицин, фурадонин, цефаклором, цефазолин, цефтриаксон, цефалексин, цефиксим.
Среднюю чувствительность штамм Lacbacillus acidophilus 42 проявил к следующим антибиотикам: амикацин, линкомицин, энрофлоксацин.
Определение оптимальной дозы применения пробиотика «Мультибактерин»
В качестве формы кормовой добавки пробиотического действия «Мультибактерйн» была выбрана жидкая не случайно. Многие производители пробиотиков. предпочитают выпускать сухие или лиофильные форма-микроорганизмов. Но в процессе высушивания часть бактерий гибнет и слабеет. При прохождении через желудочно-кишечный. тракт животного 90% микроорганизмов сухого пробиотика погибает. Бактерии в составе жидкого пробиотика сохраняют свою активность в конкуренции с патогенной флорой сразу после попадания в энтеральную среду. Активность пробиотика «Мультибактерин» составляет 109 КОЕ в 1 мл, пробиотик «Мультибактерин» хорошо смешивается с комбикормом, не требуя особых условий при его использовании, хорошо сохраняется в составе корма, не теряя своих активных биологических свойств. Выживаемость бактериальных-клеток в комбикорме достаточно высокая: при температуре 18С активность через 10 дней снижается до 107КОЕ/мл, при этом поддерживается высокая биологическая активность за счет продуктов жизнедеятельности бактерий. Кормление животных в научно-хозяйственном опыте с использованием рациона, в состав которого включен комбикорм СК-11, молочная сыворотка и пробиотик «Мультибактерин», проводили по методу обособленных групп. Животных в группу подбирали по методу пар-аналогов. Основными показателями аналогичности в опыте являются возраст, порода, среднесуточный прирост, живая масса.
Порода свиней, используемая в опыте: Крупная белая По праву считается одной из ведущих мировых пород. В России Порода представлена двумя основными типами: Мясным Мясо-сальным (большинство животных). тные гармонично сложены, крепкой конституции, хорошо приспособлены к различным климатическим условиям, скороспелы. Взрослые хряки весят 320-350кг, матки - 220-250кг. Плодовитость маток 11-12 и более поросят за опорос. Крупная белая порода используется для откорма до мясных, беконных и жирных кондиций. Основная маточная порода - в промышленных комплексах. При интенсивном мясном откорме молодняк к 6-ти мес. весит 100кг; затраты корма на 1 кг прироста - 3,9-4 к.ед. Благодаря гибкой генетической структуре и хорошей акклиматизации эта порода разводится почти во всех странах Европы, в США, Канаде, Китае, Корее, Японии, Новой Зеландии. Используется при создании многих пород. В России Крупная белая порода является объектом экспорта. Для решения поставленной задачи нами был проведен научно-хозяйственный опыт в ЗАО «Заря» Витебская обл., Республика Беларусь, с 1 апреля 2007г по 16 апреля 2007г. Характеристика поросят в научно-хозяйственном опыте представлена в таблице 8. Научно-хозяйственный опыт по определению оптимальной дозы биологически активной добавки пробиотического действия «Мультибактерин» представлен .на схеме (табл. 9). Взвешивание поросят осуществляли в начале и в конце опыта. Кормление животных осуществляли по запланиронной структуре. Отклонений от структуры кормления не наблюдалось (табл.10). В последние годы из-за высокой стоимости в рационы свиней корма животного происхождения включаются в ограниченных количествах или вообще не используются.
