Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Факторы, влияющие на мясную продуктивность и проявление мясных качеств скота 9
1.2 Методы комплексной оценки и ранней диагностики продуктивных качеств скота на основе использования ДНК-маркеров 13
1.2.1 Перспективы и информативность ДНК-маркеров ранней диагностики продуктивных качеств мясного скота по протеиназам 17
1.2.2 Прижизненная оценка продуктивности мясного скота по характеристике метаболизма мышечных белков. 23
2 Собственные исследования 25
2.1 Материалы и методы исследования 25
2.2 Результаты экспериментальных исследований 32
2.2.1 Распределение аллелей гена CAPN1 в микропопуляции подопытных животных 32
2.2.2 Содержание и кормление подопытного молодняка 32
2.2.3 Рост и развитие подопытных бычков калмыцкой породы 34
2.2.4 Гематологические показатели подопытных бычков 38
2.2.5 Характеристики неспецифического иммунитета подопытных животных 41
2.2.6 Этология подопытного молодняка 43
2.2.7 Мясная продуктивность подопытных животных 45
2.2.7.1 Результаты контрольного убоя 45
2.2.7.2 Химический состав, физико-химические и технологические свойства мяса 46
2.2.7.3 Биологическая полноценность мяса 50
2.2.7.4 Характеристика мяса подопытных животных при созревании 51
2.2.7.4.1 Физико-химические свойства мяса при созревании 51
2.2.7.4.2 Аминокислотный состав и биологическая ценность мяса подопытных бычков при созревании 53
2.2.7.4.3 Структурно-механические свойства 61
2.2.8 Конверсия протеина и энергии корма в организм подопытных животных 65
2.2.9 Экономическая эффективность 68
3 Обсуждение полученных результатов 69
4 Выводы 79
5 предЛожение производству 81
6. Список используемой литературы 82
7. Приложение 1
- Методы комплексной оценки и ранней диагностики продуктивных качеств скота на основе использования ДНК-маркеров
- Перспективы и информативность ДНК-маркеров ранней диагностики продуктивных качеств мясного скота по протеиназам
- Распределение аллелей гена CAPN1 в микропопуляции подопытных животных
- Аминокислотный состав и биологическая ценность мяса подопытных бычков при созревании
Методы комплексной оценки и ранней диагностики продуктивных качеств скота на основе использования ДНК-маркеров
Достижения в области молекулярной генетики в настоящее время расширили базу использования ДНК-маркеров и обусловили актуальность разработки стратегии и тактики выращивания и откорма скота в животноводстве с учетом индивидуальных особенностей (Костомахина, Н. М., 2006; Сибагатуллин, Ф. С., 2010). Внедрение ДНК-технологий в животноводство позволяет контролировать и прогнозировать хозяйственно-полезные признаки у животных, что является крайне важным для определения дальнейшего использования каждого животного (Mannen, H., 2011). Наибольшее развитие ДНК-маркерные технологии получили при комплексной оценке молочной продуктивности. Функциональными генами-кандидатами для оценки молочной продуктивности коров (уровня удоя, содержания молочного жира и белка) считаются гены каппа-казеина (СSN3), гормона роста (GH), диацилглицерол О-ацилтрансферазы (DGAT1) и тиреоглобулина (TG5) (E. Collis, M. R. Fortes, 2012; P. Nagy, J. A. Skidmore, J. Juhasz, 2012; P. Bartonova, I. Vrtkova, 2012; A. L. Zhang, 2012).
В частности, диагностика уровня белка в молоке возможна еще до рождения или в раннем возрасте через использование маркера CSN2_67, связанного с заменой в кодоне 67 гена бета-казеина пролина на гистидин. Этот полиморфизм определяет варианты белка A1/B (CSN2_67) и A2/A3 (CSN2_67). При этом выбраковка животных варианта A1/B позволяет снизить риск диабета и болезней сердца у человека, потребляющего молоко этих животных. Учеными была проведена оценка встречаемости полиморфизмов гена CSN3 среди различных пород крупного рогатого скота (Sulimova G. E., 2007; Robitaille G., 2005; Rohallah A., Mohammadreza M. A., Shahin M. B., 2007; Prinzenberg E. M., 2007; Nilsen H., Olsen H. G., Hayes B., 2009). На сегодняшний день описано семь аллелей каппа-казеина: A, B, C, E, F, G, H. По результатам исследований выявлено, что более высокое содержание белка в молоке и высокий выход сыра, а также лучшие коагуляционные свойства молока могут быть спрогнозированы по наличию аллеля В. Анализ данных показал, что из молока коров, группы каппа-казеин ВВ, получается больший выход сыра, чем из молока коров, несущих аллели АА или АВ (Исламова С. Г., Долматова И. Ю., 2006; Немцов А. А., Зиновьева Н. А., 2007; Dogre U., Ozdemir M., 2009; Moller K., Rattray F. P., 2012; Ahrens B., Lopes de Oliveira L. C., 2012).
Установлена тесная взаимосвязь между технологическими свойствами и биохимическим полиморфизмом белков молока. Была продемонстрирована связь -LG с ретинолом и жирными кислотами, что свидетельствует о возможной роли -LG в транспорте и метаболизме этих компонентов (G. Kontopidis, 2004; A. M. Tsiaras, 2005; N. Peiulaitien, 2007; S. Zlatarev, P. Hristov, 2008; M. Caroli, S. Chessa, 2009; J. M. L. Heck, A. Schennink, H. J. F. van Valenberg, 2009; P. Hristov, D. Teofanova, 2011; Е. В. Шапошникова, 2011). В молочном скотоводстве дальнейшее развитие получили коммерческие методы диагностики продуктивных качеств скота по ДНК-маркерам уровень удоя, процентное соотношение жира и белка в молоке, количества молочного жира и белка. В частности, была разработана модифицированная тест-система определения аллелей для гена BGH. (Ельчанов В. В., 2009). Несмотря на большие достижения в области ранней диагностики продуктивности в молочном скотоводстве, аналогичные научные работы в мясном скотоводстве пока единичны. Между тем они получают все большее распространение. Так, с 2009 года на ряде откормочных предприятий провинции Альберта (Канада) (совокупное поголовье около 100 тысяч голов) осуществляется отбор скота для откорма по наличию маркера лептина. Обоснованием к этому стали исследования, по которым гомозиготные и гетерозиготные носители характеризуются более высокой энергией роста и лучшими откормочными качествами в сравнении со скотом, не имеющим этого признака.
Собственники откормочных предприятий в настоящее время предлагают фермам «корова-теленок» телят, полученных от спаривания, быков, гомозиготных по маркеру лептина, за большую цену.
В настоящее время в литературе имеются сообщения о возможном предсказании особенностей липидного метаболизма по наличию маркеров мясных качеств крупного рогатого скота: тиреоглобулин (TG5), диацилглицерол О-ацилтрансфераза (DGAT), миостатин, калпаин и калпастатин. Наибольшее количество информации имеется о тиреоглобулине, который отмечен в качестве позиционального и функционального гена-кандидата QTL мраморности мяса. Ген тиреоглобулина КРС был секвенирован на наличие различных аллелей. Ассоциативная связь мраморности с маркером CSSM66, расположенным на хромосоме 14 КРС, показана R. Barendse et al. (2010). Точный механизм влияния полиморфности гена на формирование качественных признаков мясной продуктивности еще неизвестен, но установлена связь его вариантов, обусловленных SNP в 5 - нетранслируемой области гена TG5 с мраморностью, в частности, показателем IMF в длиннейшей мышце спины (Wood I. A., Moser G., 2006; Van Eenennaam A. L., Li J., Thallman R. M., 2007).
На рынке представлен коммерческий тест мраморности GeneSTAR, основанный на полиморфизме гена тиреоглобулина. Апробация проведена на поголовье более 3500 голов КРС с учетом породы и системы кормления. Самой высокой частотой встречаемости желательного аллеля характеризуется японская порода КРС Wagyu (76%), которая, как известно, отличается чрезвычайно высокой мраморностью мяса. Разница по степени мраморности при откорме групп скота между альтернативными гомозиготами изменилась от 3,5% IMF (СС-генотип) до 11% (TT-генотип). Достоверного влияния на другие признаки мясной продуктивности выявлено не было (Rincker C. B., Pyatt N. A., Berger L. L., 2006).
Перспективы и информативность ДНК-маркеров ранней диагностики продуктивных качеств мясного скота по протеиназам
Альбумины и глобулины являются основными видами белков, принимающими участие в обмене веществ в организме животного. Оценка фракции альбуминов определяет интенсивность роста. Отмечено, что при более высоком уровне альбуминов выше и среднесуточный прирост живой массы. Наибольшее количество альбуминов содержалось в сыворотке крови животных III группы. Их преимущество по изучаемому показателю над сверстниками I и III групп составило 2,76 % и 2,70 %, соответственно. Повышенное содержание альбуминов у животных III группы является биохимическим подтверждением более высоких среднесуточных приростов живой массы.
Фракция глобулинов принимает участие в переносе железа, кальция, холестерина, лецитина, витамина А, токоферола и ряда других биологически активных веществ.
Максимальным содержанием глобулинов характеризовались животные III группы. Так, их превосходство составило 4,43-4,58 %, соответственно, над сверстниками I и II групп. В процессах белкового обмена, которые протекают в организме, важная роль принадлежит ферментам переаминирования – аспартат-аминотрансферазе (АСТ) и аланин-аминотрансферазе (АЛТ), катализирующих обратный перенос аминногрупп с аминокислот на кетокислоту.
Выявленные различия по активности этих ферментов можно определить характером обменных процессов, которые протекают с различной скоростью у бычков разных групп (таблица 9).
Аланин-аминотрасфераза, мкмоль/чл 0,96±0,307 0,98±0,011 0,99±0, Установлено, что наибольшая активность ферментов переаминирования оказалась в III группе. По АСТ различие составило 0,015 мкмоль/чл по сравнению с I, 0,004 мкмоль/чл, во II группе; по АЛТ – 0,01-0,03 ммоль/чл, соответственно. Однако установленное преимущество статистически недостоверно.
Необходимость детального изучения всех возможных связей, перспективных для хозяйственного использования, генетических маркеров с показателями здоровья животных, их иммунитетом, продиктована негативным опытом, накопленным наукой по проблеме. Наиболее детально это изучено для голштинского скота. Так, для этой породы выявлен комплексный порок позвоночника (CMV), определяющий высокую эмбриональную смертность скота (Nagahata H., Oota H., 2002). В 80-х годах прошлого века описано заболевание Такахаши-Хагемозера или дефицит лейкоцитарной адгезии BLAD (Zhang Y., Fan X., 2012). Дальнейшее развитие получили исследования по связи ранее выявленных генетических маркеров хозяйственно-полезных признаков со здоровьем животного. На основании анализа этого материала нами были предприняты работы по оценке характеристики неспецифического иммунитета подопытных животных в связи с наличием мутации CAPN1. Как следует из полученного нами материала значительных расхождений по величине оцениваемых характеристик выявлено не было.
В частности, при относительно большой бактерицидной активности сыворотки крови во II и III группах, которая, в среднем, на 4,3 и 2,8 % выше, чем в I группе. Эти различия были статистически недостоверными (таблица 10).
Помимо БАСК нами была оценена лизоцимная активность сыворотки крови. Исследования продемонстрировали тенденцию к повышению активности лизоцима в группе-носителей мутации. Так, во II группе величина этого показателя составила 2,65 мкг/мл, в III группе – 2,68 мкг/мл, что на 9,9 % и 11,2 % превышало аналогичный уровень в I группе. Между тем, ввиду значительных расхождений между значениями показателя внутри групп, межгрупповые различия оказались недостоверными. Оценка термостабильной составляющей антимикробного начала сыворотки крови по величине -лизина также не выявило сколько-нибудь значимых различий.
Таким образом, проведенные исследования не выявили достоверных различий в характеристиках неспецифического иммунитета молодняка крупного рогатого скота калмыцкой породы-носителя различных аллелей CAPN1.
Этология подопытного молодняка Поведение животных является одной из интеграционных характеристик организма животного, обобщающего весь комплекс специфических черт организма в условиях внешней среды.
Безусловно, что поведение определяется генотипом животного. Гены определяют «физические» признаки, которые могут развиваться. Животные, обладающие крыльями, ведут себя отлично от гетеротрофов, не имеющих их. Между тем, формирование поведения как такового идет куда более сложным путем в непосредственном взаимодействии генотипа и внешней среды.
Рассматриваемая нами особенность генотипа-наличие мутаций гена CAPN1, куда менее значимый генетический фактор, чем у группы генов, определяющих, например, формирование крыла или других морфологически значимых характеристик тела. Однако, в начале своих исследований мы предположили, что возможно более высокая интенсивность обмена, по причине изменения ресинтеза белков у опытных животных, приведет к изменению потребностей организма и возможно отразится на поведении животных. В конечном итоге, мы ожидали, что такие генетические особенности могли повлиять на поведение через недостаток пищи для покрытия затрат энергии на поддержание жизни.
Оценивая полученные данные, следует отметить, что при показателе уровня кормления подопытных особей в 1,6-1,7, значительных изменений в поведении животных нами выявлено не было (таблица 11).
Степень активности, ед шагомера, мин 3,28 3,4 3, Действительно, во II и III группах имело место несколько более продолжительное активное состояние животных – 523 и 544 минуты в среднем за сутки. Это на 5,7 и 9,9 % превышало аналогичный показатель в I группе. Однако, эти различия были статистически недостоверны. Исходя из полученного материала, животные I группы более продолжительное время, чем сверстники, отдыхали – 945 минут за сутки, это на 28 и 48 минут больше, чем во II и III группах, соответственно.
Двигательная активность животных во II и III группах, различалась незначительно, составив 181 и 188 минуту, что на 11 и 13 минут было больше, чем в I группе. Различия были статистически недостоверными. Большая двигательная активность животных II и III групп сопровождалась увеличением степени активности до 3,41-3,50 ед.шагомера в минуту. Таким образом, рассматриваемые мутационные различия в CAPN1 не сопровождаются изменениями в поведении животных калмыцкой породы при показателе уровня кормления в 1,6-1,7.
Распределение аллелей гена CAPN1 в микропопуляции подопытных животных
Для изучения мясной продуктивности подопытных животных был проведен контрольный убой в возрасте 14 месяцев. Были установлены межгрупповые различия в значениях живой массы. На момент окончания эксперимента у животных I группы данный показатель составил 377 кг; во II группе – 386,7 кг; в III – 399,7 кг. Исходя из полученных данных, наибольшая живая масса была зафиксирована для животных, имеющих генотип СС.
Выход мяса был выше в группе животных с желательным генотипом, он составил 81,9%, что в среднем, больше чем в остальных группах на 2%.
Анализ химического состава мяса показал, что животные-носители аллеля C откладывали меньше жира в мышцах. Так, содержание жира в мясе-фарше, полученном от особей III группы, составило 10,2%, в длиннейшей мышце спины – 0,64%, это на 1,6% и 0,05% было меньше, чем в I группе. Большее содержание жира в мышечной ткани животных I группы закономерно было связано с большей массой внутреннего жира в среднем на 2,9 кг или на 20,7% превышающим аналогичный показатель в III группе. Эти обстоятельства, в конечном итоге, предопределили превосходство особей I группы по совокупному содержании жира в съедобной части тела животных III и II групп. В частности, при массе жира в этих частях тела 32,05 кг/ккал в I группе, этот показатель в двух других группах оказался меньше на 11,5 и 13,9%, соответственно. В тоже время выход белка в съедобной части тела животных-носителей оцениваемого признака, был выше. Это, в конечном итоге, и определило более высокие значения показателя конверсии сырого протеина корма в продукцию во II и III группах – 10,9 и 11,3%, что на 1,5-1,9% превосходило уровень I группы.
Различия по степени конверсии обменной энергии корма были в пользу I группы: животные этой группы 6,4% всей доступной энергии корма трансформировали в вещества съедобной части тела. Это на 0,8% превосходило значения аналогичного показателя в II и на 0,5% в III группе.
Основной нашей задачей явилась оценка влияния генотипа на биологические особенности бычков калмыцкой породы. В начале исследования был проведен обширный обзор литературы по характеристике гена CAPN1, его полиморфизмов, методов оценке их влияния. Как следует из анализа накопленных наукой фактов, имеется достаточное количество данных по оценке качества мясной продукции при наличии данного полиморфизма. Наиболее важным показателем является оценка структурно-механических свойств мяса. В подобных исследованиях не затрагивались вопросы степени влияния созревания мяса на силу сдвига, а также оценка изменения биологической ценности мяса с течением времени при влиянии генотипических особенностей.
При планировании хода эксперимента мы основывались на том, что важными показателями при осуществлении созревания мяса является оценка функционально-технологических, физико-химических и структурно-механических свойств. Исследования функционально-технологических свойств в процессе созревания выявил ряд различий между группами. Анализ уровня pH свидетельствуют об оптимальной норме рН, в процессе созревания до 18 суток, не превышающее по уровню предельно допустимой концентрации. Наблюдается уменьшение данного уровня во всех опытных группах в период от 4 до 11 суток при созревании мяса. На 11 и 4-х суточное созревание мяса в I опытной группе увеличился на 1,06% (р0,05), в III группе на 0,52% (р0,05). Уровень рН по созреванию мяса во II опытной группе был не достоверным, но не превышал предельно допустимую концентрацию. Изменение уровня pH связано с активизацией процесса гликолиза в первые сутки после убоя. Происходит распад гликогена и накопление молочной кислоты в мышцах, поэтому уровень pH снижается. В дальнейшем наблюдается увеличение. Критическим значением pH является 6,2, дальнейшее увеличение оказывает негативное влияние на качество мяса. Поскольку в I и III группах наблюдается увеличение pH, то можно говорить об оптимальном протекании гликолитических процессов.
Другим определяющим показателем является влагоемкость (удерживание влаги). Данный показатель указывает на количество белкового вещества, а также само состояние последнего. Высокой влагоудерживающей способностью обладают мясопродукты бычков всех генотипов. Однако, в результате созревания мяса, следует отметить, что исследуемый показатель несколько превышается у бычков III группы. С увеличением созревания до 18 суток во всех групп этот показатель повысился на 5,31%; 7,97% и 8,52% в I, II и III группах, соответственно.
По интенсивности окраски определяется товарный вид мясной продукции. Анализ полученных данных свидетельствуют о том, что в процессе созревания мяса величина данного показателя уменьшалась на 36,56 % (Р 0,99) – в I, во II – на 35,42% (Р 0,99), а в III – на 33,60% (Р 0,999).
Оценка качества мяса учитывает также биологическую ценность, которая характеризуется концентрацией аминокислот. Они выполняют в организме ряд важных функций. Незаменимые аминокислоты не синтезируются в организме, поэтому поступают с пищей. Так, например, валин, который входит в состав практически всех белков, участвует в синтезе протеина, выполняет защитную функцию, участвует в поддержании нормального обмена азота в организме.
Лейцин необходим для построения и развития мышечной ткани, синтеза протеина организмом, для укрепления иммунной системы. Изолейцин участвует в получении энергии за счет расщепления гликогена мышц. Лизин, также как цистин, участвует в образовании коллагена, активно используется при выработке антител, гормонов и ферментов. Наличие и соотношение аминокислот свидетельствуют о полноценности белковой составляющей мяса. В проведенных исследованиях установлена определенная динамика содержания заменимых и незаменимых аминокислот в процессе созревания мяса.
О содержании полноценных белков судят по концентрации в мясе незаменимой аминокислоты триптофана, входящего во все мышечные белки и отсутствующего в соединительной ткани. О количестве неполноценных белков свидетельствует наличие и количество заменимой аминокислоты оксипролина.
Аминокислотный состав и биологическая ценность мяса подопытных бычков при созревании
Было установлено, что образцы сырого мяса, полученные от животных с генотипом СС характеризовались наименьшим усилием при разрезании во все периоды созревания. Так, при созревании до 4 суток они на 0,17 кг/см2 (28,33%) имели меньшее сопротивление при разрезании, по сравнению с образцами, полученными от генотипов GG и на 0,12 кг/см2 (21,82%), по сравнению с гетерозиготами, которые, в свою очередь, превосходили нежелательные генотипы на 0,05 кг/см2 (8,33%). С увеличением срока созревания до 11 суток у всех образцов мяса улучшались показатели сопротивления при резании, однако более интенсивно эти процессы проходили у желательных генотипов. Они на 0,07 кг/см2 (28,00%,) (Р 0,95) превосходили образцы с генотипом GG. При этом отсутствовала разница между генотипами СС и CG.
К 18-суточному созреванию образцов мясо всех генотипов имело минимальные различия – 6,67%. Динамика структурно-механических свойств длиннейшей мышцы спины в процессе ее созревания представлена на рисунке 5. Рисунок 5 – Динамика структурно-механических свойств длиннейшей мышцы спины в процессе ее созревания
Дисперсионным анализом однофакторного комплекса установлена сила влияния генотипа на физико-механические показатели нежности мяса (таблица 27).
Установлено достоверное влияние генотипа на физико-механические показатели нежности мяса при созревании до 11 суток, составившее 68,8%, на долю других факторов приходилось 31,2% (Р 0,95). Таблица 27 - Влияние генотипа на структурно-механические свойства длиннейшей мышцы спины в процессе созревания
Таким образом, при изучении бычков калмыцкой породы выявлены генотипы с желательными аллельными формами гена CAPN1 C316. В кодирующей части этого гена обнаружены замены цитозина на гуанин, которые приводили к изменениям в аминокислотной последовательности в положениях 316 (глицин на аланин), обеспечивающие получение мяса повышенной нежности. Животные, гомозиготные и гетерозиготные по этим аллелям, представляют интерес для селекции на качественные показатели мяса.
Изначально рассматривая рабочую гипотезу выполняемых исследований, мы исходили из предположения, что более высокая удельная активность эндогенных протеаз должна быть связана с интенсивностью ресинтеза в тканях тела, а следовательно, и коррелировать с синтезом новых тканей.
Действительно, вновь поступающие питательные вещества пищи используются не только для формирования тканей «de novo», но и для обновления «старых». Причем процесс обновления «старых» тканей в организме крайне интенсивен. Так, белки печени обновляются за 3-4, белки мышц за 10-15 суток (Газдаров В.М., Решетова Л.В., Черепанов Г.Г., 1974).
В этой связи исследование генотипа животных по CAPN1 способно пролить свет на потенциальные возможности животного к конверсии корма.
Подтверждением этого являются данные, полученные нами при изучении эффективности использования протеина и энергии корма на уровне кормления – УК=1,6-1,7.
Как следует из полученного материала полиморфизм по CAPN1 был связан с различным отложением жира и протеина в тканях тела. В тканях тела животных I группы содержалось в среднем больше жира, что определило общую массу жира в съедобной части тела на уровне 32,05 кг/гол. Это величина на 4,45 кг превосходила аналогичный уровень во II и на 3,7 кг – в III группе (таблица 28). В тоже время, совокупное содержание протеина в съедобной части тела животных II и III групп оказалось наибольшим – 37,9 и 39,6 кг/гол, что на 8,5 и 13,5% соответственно превышало аналогичный показатель в I группе.
Столь значительная разница была обусловлена расхождением по живой массе между группами и большим удельным содержанием протеина и меньшим жира в тканях животных-носителей CAPN1. Причем наибольшие различия по данным показателям имели место в мякоти туши. В частности, содержание протеина в мякоти туши животных I группы составило 29,2 кг/гол, во II и III данный показатель оказался больше на 9,5 и 14,4 %, соответственно. Тогда как различия по содержанию жира были в пользу I группы и составили 19,2 и 7,1%, соответственно. В конечном итоге, эти различия определили неодинаковый выход протеина и энергии в расчете на единицу предубойной живой массы подопытных животных (таблица 29).
Так, при удельном содержании протеина в 1 кг предубойной живой массы – 34,9 г в I группе, этот показатель во II и III группах достиг 37,9 и 39,6 г. В тоже время калорийность единицы живой массы в I группе оказалась выше уровня II группы на 8,1%, III – на 7,9%. Закономерно, что большее жироотложение наблюдалось в I группе, и на фоне примерно одинакового потребления кормов, было сопряжено с повышением коэффициента конверсии обменной энергии корма до 6,4%, против 5,6% - во II и 5,9% – и в III группах.
