Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы по теме исследования 6
2.1. Исследование белка с помощью масс-спектрометрии 6
2.2. Основные методы ионообразования термолабильных веществ 8
2.2.1. Образование ионов при электрораспылении (Electrospray Ionization, ESI) 12
2.2.2. Ионизация лазерной десорбции в присутствии матрицы (Matrix assisted laser Desorbtion I Ionization, MALDI) 16
2.3 .Масс-анализаторы... 20
2.3.1 .Магнитные секторные масс-анализаторы. 20
2.3.2. Времяпролетные масс-анализаторы 23
2.4. Методики определения количества белка с использованием масс-спектрометрии 26
3. Основные результаты работы и их обсуждение 33
3.1. Получение аминокислотных стандартов 38
3.2. Количественный анализ аминокислот 42
3.2.1. Количественный анализ аминокислот с использованием ESI-MS 42
3.2.2. Количественное определение аминокислот с использованием MALDI-MS 46
3.3. Определение количества белков 49
3.3.1. Определение количества белка с помощью ESI-MS 50
3.3.2. Определение количества белков с помощью MALDI-MS 54
3.3.3. Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ 63
4. Материалы и методы 70
Выводы 78
Список литературы 79
- Образование ионов при электрораспылении (Electrospray Ionization, ESI)
- Методики определения количества белка с использованием масс-спектрометрии
- Количественный анализ аминокислот с использованием ESI-MS
- Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ
Введение к работе
В настоящее время масс-спектрометрия является ключевым инструментом в исследованиях в области химии белка. Особенно это относится к идентификации различных пептидов и белков, аминокислотная последовательность которых может быть взята из различных баз данных, либо предсказана на, основании генома. Однако для понимания физиологических процессов на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, но и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым и относятся белки, наиболее часто используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Electrospray Ionization Mass-Spectrometry, Y ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS). Оба этих масс-спектрометрических метода, по причине дискриминации новообразования и конкуренции за протон между отдельными компонентами смеси веществ, не позволяют определять количественные параметры. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются, однако все предлагаемые к настоящему времени подходы связанны с необходимостью дополнительных химических модификаций и созданием в каждом отдельном случае соответствующих стандартов. В связи с этим изучение дискриминации в ионообразовании и ее преодоления в мягких ионизационных методах, таких как ESI и MALDI с целью их адаптации к количественному анализу белков, имеет как теоретическую, так и практическую ценность.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение дискриминации новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI, и использование полученных данных для создания универсальной масс-спектрометрической методики количественного анализа белков и пептидов.
1. Изучить дискриминацию новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.
2. Разработать метод определения количества белков с помощью ESI-MS и MALDI-MS.
Апробировать разработанный подход на примере модельных белков в растворе и в геле. Научная новизна работы. Изучена дискриминация новообразования в мягких методах ионизации, таких как ESI и MALDI.
Предложена методика позволяющая обойти проблему дискриминации ценообразования и определить количество белков.
Практическая значимость работы. На основании полученных результатов была разработана методика, позволяющая количественно проанализировать белки на уровне 5 фмоль, без существенной доработки масс-спектрометрических приборов. Кроме того, продемонстрирована возможность определения количественных характеристик пептидов белков, не только предварительно выделенных, но и в смеси содержащей 2-3 компонента.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах в ИАнП РАН, на 6-й Пущинской школе-конференции "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" (г. Пущино, 2002г.), на III съезде биофизиков России (г. Воронеж, 2004), а так же на Desorption 2004. (S.- Petersburg).
Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи в журнале "Научное приборостроение", статья в журнале Analytical chemistry и материалы трех докладов на конференциях.
Образование ионов при электрораспылении (Electrospray Ionization, ESI)
Современное представление о механизме ионообразования в процессе распылении растворов при атмосферном давлении опирается на предположения, высказанные в конце 60-х годов М. Долом и на модель, предложенную в 1979г. Ирибарном и Томсоном [35-50].
Дол предположил, что перевод исследуемых молекул из раствора в газовую фазу осуществляется путем распыления жидкости, вытекающей из капилляра в сильном неоднородном электрическом поле [35-38]. Такое электрогидродинамическое распыление проводится на воздухе, при атмосферном давлении. При испарении растворителя из заряженных капель будет увеличиваться плотность заряда вплоть до достижения Рэлеевского предела (2.2), при котором силы кулоновского расталкивания и поверхностного натяжения становятся сравнимы.
Результирующая нестабильность будет являться причиной разрыва исходной капли на дочерние, более малого размера капли, из которых будет также испаряться растворитель. Последовательность таких "кулоновских взрывов" в конечном счете, приведет к каплям столь малых размеров, что они будут содержать одну молекулу в виде иона данного соединения и несколько молекул растворителя [35-39].
Модель "испарения при атмосферном давлении" для образования ионов, предложенная Томсоном и Ирибарном, предполагала, что серия последовательных испарений и "кулоновских взрывов", как это описывал Дол, будет приводить к каплям радиус которых столь мал, а плотность заряда столь велика, что результирующее электрическое поле на поверхности капли станет достаточным, чтобы экстрагировать растворенные ионы в газовую фазу [39 -45]. Размер капли, при котором будет происходить этот процесс, достигается меньшей последовательностью кулоновских взрывов, чем требуется для образования окончательной капли, как это следовало из модели Дола. В действительности при практической реализации идеи электрогидродинамического формирования пучков для макроионов применительно к созданию источников для масс-спектрометрии биополимеров оказалось, что расстояние, на котором образуются ионы значительно меньше, чем показали расчеты исходя из теории Дола [39]. Таким образом, в процессе образования ионов принимают участия оба описанных процесса (рис. 2.5).
Разработкой источника ионов с электрогидродинамическим распылением при атмосферном давлении занимались две группы ученых - одна в СССР (группа Галль Л.Н) [33, 45-49], другая в США (группа Фена) [50]. Причем в СССР эти работы проходили с 1964 года. В 1984 году в работе [46] были продемонстрированы масс-спектры смеси 20 основных аминокислот, а также антибиотика эритромицина полученные с помощью масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением (экстракция растворенных ионов при атмосферном давлении). Кроме того, были продемонстрированы принципиальные схемы источника ионов, используемые также и в настоящее время [46,50].
Жидкость, содержащая анализируемое вещество, подается по капилляру, к которому подведено высокое напряжение [30-33, 45-52]. На конце капилляра образуется так называемый конус Тейлора, с которого под действием электрического поля происходит распыление жидкости с образованием микрокапель (рис. 2.6) [52].
Далее из этих капелек летящих в направлении, определяемом электрическим полем, т.е. по направлению к анализатору, после столкновения с молекулами воздуха испаряется растворитель [30-33, 45-52]. По причине того, что распыление происходит при атмосферном давлении на пути движения ионов должна существовать некоторая область с промежуточным давлением, которое обеспечивает переход в высоковакуумную область анализатора. В эту область источника отбирается лишь часть направлено движущихся ионов через сопло достаточно малого диаметра. Эта область характеризуется существенно меньшим давлением, поскольку в ней осуществляется дополнительная откачка. Заряженные ионы продолжают двигаться по направлению электрического поля к скимеру, имеющему также отверстие небольшого диаметра в высоковакуумную область масс-анализатора. Это сспособствует, при правильно выбранных параметрах, эффективной транспортировке ионов по направлению к масс-анализатору [30-33,45-52].
Необходимо отметить, что испарение растворителя при газокинетических столкновениях с молекулами спутного газа без термического воздействия на растворенные вещества обеспечивает переход термолабильных биоорганических соединений из жидкости в газовую фазу без их разрушения. Сохранению соединений также способствует тот факт, что при описанном способе перевода соединений в газовую фазу можно добиться условий фактически не разрушающих анализируемые вещества под действием электрического поля. Расчеты и эксперименты, описанные в работе, показали, что электрическое поле не может проникать внутрь капли (для идеально проводящей жидкости) более, чем на величину порядка атомных размеров ( 5 10 8 см), которые превышают размеры образующихся при распылении микрокапель. Практически при этом большая часть соединений находится внутри капли и поэтому не подвергается разрушению [30-33].
Методики определения количества белка с использованием масс-спектрометрии
Для понимания физиологических процессов происходящих на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, или определить их модификации, но и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Как уже говорилось на стр. 14 главы 2.2.2 и на стр. 11 главы 2.2. L, определение количества белка с использованием масс-спектрометрических приборов оснащенных мягкими ионизационными источниками, является до конца не решенной физической проблемой.
Интенсивность масс-спектрометрического сигнала зависит от большого количества параметров. Причем учесть все эти параметры, к которым относится как давление в источнике ионов, температура в лаборатории, и прежде всего сродство молекулы анализируемого вещества к протону, не возможно. Таким образом, сама по себе интенсивность пика не является количественной величиной [10-14]. Кроме того, количество протонов в растворе или в матрице также ограниченно, что приводит к конкуренции за протон.
Необходимо либо использовать внутренний стандарт, имеющий одинаковое сродство к протону, как и контролируемое вещество, либо использовать другие количественные методы [10-14, 21, 57-72]. При использовании других аналитических методов, для получения количественных характеристик белков и их производных, исследователи сталкиваются с рядом проблем [8-11, 13-14, 57-59]. Так наиболее часто используемые хроматографические и электрофоретические методы уступают масс-спектрометрии в чувствительности. Так если при использовании гель -электрофореза предел чувствительности, в зависимости от метода окрашивания, находится в пределах 1 пмоль, что значительно уступает по чувствительности масс-спектрометрии [57, 59-60]. Кроме того, при решении типовых задач протеомики, необходима предварительная идентификация белка. То есть метод количественного анализа белка должен хорошо сочетаться с определением его аминокислотной последовательности [9-14, 61-72]. Таким образом, наиболее оптимальным является количественный анализ, как отдельных белков, так и их смесей при использовании масс-спектрометрии [61-72]. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются [8-13, 61-72].
При выборе внутреннего стандарта решающим становится его идентичность к анализируемому веществу [13]. Поэтому наиболее идеальным вариантом такого стандарта является использование изотопно-меченого аналога анализируемого белка [8-13, 61-72]. В современной лабораторной практике наибольшее распространение получили три схемы введения изотопных меток (рис. 2.11).
Прежде всего, это введение стабильных изотопов метаболическим путем, при выращивании на средах обогащенных стабильными изотопами (рис. 2.11а). Так питательная среда может содержать С-меченные аминокислоты (13C-Arg) или соли обогащенные I5N [11]. Недостатком такого подхода является не возможность оценить количественные параметры в граммах или молях, то есть данная методика является, прежде всего, сравнительной, а не абсолютной [11, 71-72]. Кроме того, процесс получения стандарта занимает много времени.
Другой подход позволяющий ввести стабильные изотопы в молекулу белка - химический. В случае химической модификации белков происходит обработка специфичных участков молекулы белка или пептида реагентами, содержащими стабильную изотопную метку (рис. 2.116). Примером таких реагентов может служить изотопно-кодирующая аффинная метка 1С AT (isotope-coded affinity tags) (рис. 2.12) [11, 64-67].
Метка содержит тиол-реагирующую группу для ковалентного присоединения только к аминокислоте цистеин, изотопно-меченную связку (линкер) и биотиновый "хвост" для аффинного выделения (рис. 2.12). Для дифференциации, то есть определения количественных характеристик двух линий клеток (например, между нормой и патологией) в лизаты обеих линий вводят метки с различным весом, отличающиеся числом дейтериевых замен протона в связке. Принято отличать легкую и тяжелую метку на 8 дейтериевых замен. Модификация стандарта и аналита протекает за счет ковалентного присоединения ІСАТ-реагента к сульфгидроксильной группе цистеина, входящего в состав молекулы белка или пептида [64-67].
Введение изотопных меток ICAT вызвало прорыв в количественном анализе с использованием масс-спектрометрии в качестве аналитического метода, и в настоящий момент, данный подход наиболее часто используется в лабораторной практике [11, 64-67]. Основным недостатком этой методики является необходимость в объекте исследования цистеина (Cys). Кроме того, данный подход также не позволяет определить абсолютное количество вещества [64-67].
Стабильные изотопы в молекулу белка так же вводят за счет ферментативного гидролиза (рис. 2.11 в) [11-13, 69-72]. Сущность подхода состоит в количественном анализе не исходных соединений, а продуктов их ферментативного гидролиза. Причем, ферментативный гидролиз стандарта проводится в среде Н2180. Таким образом, происходит изотопный обмен О = О [69-72].
Особенностью метода является то, что обменивается только часть атомов 160 на 180. Таким образом, присутствующие на спектре пики, относятся как к молекулам, у которых все атомы кислорода имеют массу 16, так и к молекулам у которых один или два атома заместились на О. (рис. 2.13).
При использовании этого подхода значительно упрощается процедура подготовки проб. Кроме того, так как описанный метод предполагает гидролиз исходных продуктов, то молекулярный вес объекта анализа и характеристики масс-спектрометрического прибора, а именно его разрешающая способность, не оказывают решающего значения на сам анализ. Тем не менее, методика так же предполагает создание индивидуального стандарта, а также не позволяет анализировать смесь белков.
Количественный анализ аминокислот с использованием ESI-MS
Съемка велась непрерывно в течение ЗОмин., с проверкой результатов каждые 60 сек. Было показано, что изменения соотношения между пиками не превышают 1%. Так как задачей исследования было создание удобной и универсальной методики масс-спектрометрического количественного анализа белков и пептидов, возник вопрос выбора внутреннего стандарта. Так как пептиды и белки представляют из (себя аминокислотную последовательность, причем основной набор аминокислот, кодируемый человеческим геномом, содержит всего 20 компонентов, то в качестве объекта исследования были выбраны аминокислоты.
Кроме того, количество аминокислот прямо пропорционально количеству белка и, тем самым нет необходимости использовать набор из всех 20 аминокислот. Удобство предложенного подхода также заключается, в том, что белок может содержать десятки тех или иных аминокислот, что приводит к увеличению чувствительности методики.
Таким образом, существенным отличием предложенного подхода от ранее существующих является использование в качестве объекта исследования не самого белка, а аминокислот, входящих в его состав. Это приводит к тому, что:
Во-первых, учитывая ограниченное количество аминокислот, входящих в состав белков живых организмов (всего их 20), можно создать универсальный набор внутренних стандартов для анализа. К Во-вторых, сравнение концентраций анализируемых и изотопномеченных аминокислот позволяет определить абсолютное количество исследуемого белка. В-третьих, если объектом исследования является аминокислота, а не белок, то молекулярная масса последнего не имеет значения. Разработанная методика количественного анализа белков основывается на определении концентрации отдельных аминокислот, входящих в состав исследуемого белка, после его кислотного гидролиза путем измерения относительных интенсивностей ионов аминокислоты и ее стандарта.
Гидролиз белков осуществляли в твердом состоянии в парах концентрированных соляной и ТФУ кислот. Полученную смесь аминокислот высушивали на вакуумной центрифуге с целью удаления следов кислот, смешивали с стандартом и анализировали масс-спектрометрически (рис 3.3). В экспериментах были использованы как коммерческие изотопные аналоги аминокислот, так и полученные в лабораторных условиях стандарты, промодифицированные с помощью изотопного обмена в 1 О. 3.1. Получение аминокислотных стандартов.
Стандартами в проводимых нами экспериментах были выбраны изотопно-меченые аминокислоты: лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), фенилаланин (Phe), тирозин (Туг). Использованные нами в качестве стандартов аминокислоты широко встречаются в белках и дают не перекрывающиеся с другими аминокислотами значение отношения массы аминокислоты к ее заряду (m/z), a Lys и Arg, кроме того, обладают высоким выходом положительно заряженных ионов.
В качестве коммерческих стандартов использовали дейтерированный лизин (D4-Lys), модифицированный по N15 аргинин (,5N2-Arg) и дейтерированный Leu (D3-Leu) приобретенные в Cambridge Isotope Laboratories inc., CILIA. 018-изотопные стандарты ряда аминокислот получали по разработанной нами методике путем изотопного обменом при инкубации нативных аминокислот в среде 11 в присутствии 20% трифторуксусной кислоты (ТФУ) при 20 или 100С в течение 5 дней или 8 часов соответственно. Изотопный обмен осуществлялся как при получении стандартов для отдельных аминокислот (стандарты S1 и S2), так и смеси, состоящие из двух (стандарты S3 и S4) или трех аминокислот (стандарт S5).
Контроль процесса изотопного обмена осуществляли масс-спектрометрически (рис. 3.4). Масс-спектрометрический анализ реакционной смеси (рис. 3.4) показал, что аминокислоты присутствуют в виде серий пиков соответствующих включению одного изотопа О, или двух [ Oi и (] в результате изотопного обмена. Также во всех спектрах отмечается наличие пика, соответствующего исходной аминокислоте без О [ О0]. Кроме того, было обнаружено, что при длительном хранении стандарта в растворе происходит обратный обмен 0= О. Серия экспериментов показала, что в случае лиофилизации раствора стандарта обратный обмен отсутствует. Это вызвано прежде всего тем, что наряду с водой испаряется ТФУ, наличие которой является необходимым условием изотопного обмена. Кроме того, предварительный масс-спектрометрический анализ стандарта также позволяет решить эту проблему.
Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ
Экспериментальные работы по отработке методик количественного анализа белков и пептидов проводились на масс-спектрометре Finnigan МАТ95 ("TermoQuestM, Времен, Германия), оборудованном электрораспылительным источником ионизации (electrospray ionization, ESI) и масс-анализатором с двойной фокусировкой. Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов суммированием 100-150 импульсов. Объем анализируемой пробы 20 мкл. Скорость подачи раствора образца 1 мкл/мин. Кроме того, масс-спектрометрический анализ проводили на приборе MX 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионизации (electrospray ionization, ESI) и время пролетным масс-анализатором (TOF), разработанном в лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН. Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов. Объем анализируемой пробы 10 мкл. Скорость подачи раствора образца? 1 -2 мкл/мин. Нативные и модифицированные пептиды растворяли в 50% ацетонитриле в присутствии 0.1% уксусной кислоты в концентрации от 1-20 пмоль/мкл. MALDI-MS анализ осуществляли на времяпролетных масс-спектрометрах Applied Biosystems Voyager System 4270 (Perseptive Biosystems Inc., Framingam, MA, США) и Voyager-DE STR (ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург), с источниками ионов с замедленной экстракцией, в режиме отражения. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (25 г/л) и а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (20 г/л) в смеси с ацетонитрилом, содержащим 0.1%-ную трифторуксусную кислоту в объемном соотношении 70:30. Образцы приготовляли методом высушивания капли. Трифторуксусную кислоту (2 %, 0.3 мкл) смешивали с 0.3 мкл образца (0.5-2 пмоль на I мишень) и с 0.3 мкл раствора матрицы. В тексте и на рисунках приведены значения моноизотопных масс, если не оговорено особо. ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром-1" (ПО "Научприбор") в колонке из нержавеющей стали (2 х 62 мм) с сорбентом Proteins С4 (Vydac, США). Элюцию осуществляли градиентом концентрации ацетонитрила от 10 до 50 % (по объему) в растворе 0.1 % трифторуксусной кислоты со скоростью 0.1 мл/мин. Кроме того» хроматографию проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "МилиХром А-02" ("Эконова", Новосибирск). Хроматографическая колонка размером 2 х 75 мм, заполнена сорбентом Prontosil AQC18 (Bisnof, ФРГ). Элюцию осуществляли градиентом концентрации ацетонитрила от 10 до 50 % (по объему) в растворе 0.1 % трифторуксусной кислоты, 0.5 % муравьиной кислоты, 1% уксусной кислоты, в зависимости от эксперимента, со скоростью 100 мкл/мин. Концентрации исходного субстрата и продуктов его гидролиза оценивали по площадям хроматографических пиков с учетом молярных коэффициентов поглощения, рассчитанных по аддитивной схеме. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли в 5%-ном полиакриламидном. Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов. Объем анализируемой пробы 10 мкл. Скорость подачи раствора образца 1-2 мкл/мин. Объекты анализа растворяли в 50% ацетонитриле в присутствии 1% уксусной кислоты в концентрации 0.1-10 пмоль/мкл. MALDI-MS анализ осуществляли на времяпролетном масс-спектрометре Applied Biosystems Voyager System 4270 (Perseptive Biosystems Inc., Framingam, MA, США) с источником ионов замедленной экстракции в режиме отражения. Съемку осуществляли в виде положительно заряженных ионов в рефлекторном моде. Пробы в объеме 0.3 мкл помещали на мишень с предварительно нанесенной в таком же объеме матрицей. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB, Aldrich). Взвешивание образцов для анализа осуществляли на аналитических весая ВЛР 200 г 2 класса точности. Синтез пептидов осуществляли на твердофазном синтезаторе (Intavis AG, Германия). Трипсинолитическую и химотрипсинолитическую активность определяли спектрофотометрически на приборе СЕ 2020 (CECIL, Англия) и СФ-26. рН определяли с помощью лабораторного иономера И-160. Термостатирование осуществляли с помощью термостата Вакуум создавали с помощью вакуумного насоса Mohelnice (Чехия). Пробы высушивали с помощью установки Speedvac. В работе были использованы следующие ферменты, белки пептиды: протеиназа из гриба Trichoderma viride, трипсин ("Spofa"), карбоксипептидазу В ("Serva", Германия), химотрипсин, трипсиноген и химотрипсиноген из поджелудочной железы быка ("Sigma1 , США), сурфагон (SPN, НПО "Биолар", Олайнский завод химреактивов, Латвия), инсулин человека и свиньи ("Sigma", США), протегрин-1 (PG-1), любезно предоставленный профессором В.Н. Кокряковым, бычий сывороточный альбумин (BSA), р-лактоглобулин, овальбумин ("Sigma", США), рекомбинантный проинсулин человека, полученный в лабораторных условиях в ИБХ РАН. Также использовались следующие аминокислоты: гистидин, фенилаланин, тирозин ("Spofa", Чехия), аргинин, лизин, лейцин, изолейцин ("Sigma", США). Для получения О-изотопных стандартов использовали тяжелую воду Н2180 с 95-98% содержанием изотопа I80 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., США). В качестве изотопно-меченных аминокислот были использованы дейтерированный лизин 4,4,5}5-D nmHH (D4-Lys) 98% чистоты по D и L-аргинин-гуанидо-15 (15N2-Arg) 98% чистоты по ,5N2, L-аргинин модифицированный 6 атомами 13С и 4-я атомами 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, США), дейтерированный лейцин - D3-Leu (Aldrich, USA). В работе использовали метанол, метиламин (NH2CH3), аммиак (NH3), пентафтормасляную кислоту (PFPA), дитиотреит (DTT), иодацетамид (JAcNH2), трифторуксусную кислоту (TFA), уксусную кислоту, муравьиную кислоту и ацетонитрил (MeCN) производства фирмы "Merck", (Merk, Германия). В качестве матрицы для MALDI-MS использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) и а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (НССА) производства фирм "Serva" и "Aldrich", соответственно. Остальные реактивы имели квалификацию ч.д.а. и "для спектрального анализа".
