Введение к работе
Мта&Шіеть.ЖСЛт<йШ1ій. Аяенозин-5'-тр«фосфат (АТР) служит универсальным источником энергии во всех организмах. Кроме этого, АТР необходим для каталитическое активности целого ряда ферментов в качестве кофактора или аллостерического эффектора. Определение общих структурных элементов, ответственных за распознавание АТР в различных белках, представляет фундаментальный интерес для современной молекулярной химии. В общем случае, задача "распознавания" кофактора не оіраипчива-тся только АТР и обобщаете! на все широко распространённые лигянды, такие как, например, пиридоксадь-5'-фосфат (РІ.Р), производная витамина %.
Существует почти бесконечное количество способов сворачивания нолішеїпилноК цепи в компактную глобулу. Тем не менее, доминирование двух основных элементов вторичной структуры (о-спираль и Р-цепь) оіраничивает типы наблюдаемых укладок. Кроме этого, существуют также различные физические мранпчения на упаковку элементов шоричыой структуры в супервгоричішн мотив. Это приводит к тому, что в структурах многих белков содержатся похожие, наиболее выгодные, распределения вторичной структуры.
Эволюпионно связанные белки могут быть выявлены сравнением их аминокислотных последовательностей. В некоторых случаях, однако, последовательности могут разойтись настолько, что структурные сходства - это всё, что остаётся в результате эволюции. И наоборот, если число упаковок лимитировано физически, белки могут случайно иметь похожие упаковки при абсолютно различных последовательностях.
Такії?»! образоы, для определения общих локальных структурных элементов, структуры должны быть сравнены непосредственно. Ранее, подходи для сравнения бел ко» основывались в основной на визуальном выявлении общих остатков и последующей суперпозиции структур. В случае АТР-зависимых, PLP-зависимых и других белков, не списанных зволюшшино и имеющих различные типы укладок, необходим метод, не ислользуюший a priori информации об общих остатках и способный выявить локальные сходства используя только структуры белков в качестве исходных данных.
Циклический АМР-зависимая протеннкиназа (сАРК), D-Ala: D-Ala лигаэа (DD-лигаза) и гиспшил-тРНК-синтетаза (KisRS) катализируют три независимые химические реакции к принадлежат к неродственным семействам ферментов. Эти белки связывает то, что они используют в качестве кофактора молекулу АТР, необходимого для их каталитической активности. Недавно было показано, что в структурах DD-лигазы и сАРК существует коиформационно-подобный тетрапептил. находяшкйся в районе аденияового кольца коферменте ATP (Kobayashi и Go, 1997). Тетрапепткды образовывали по две водородные связи с адекипамн коферментов и были названы АТР-связываюишм мотивом.
Аспартат аминотрансфераза (AspAT), (3-субьедиінша
триптофан синтстазы (TrpSp), D-аминокнслотная
аминотрансфераза (D-AAT), аланин рацемаза (AlaR) и гликоіен фосфорнлаза (GP) используют для катализа воих реакции в качестве коферменте другую, не менее распространенную в природе, молекулу PLP. Эти белки имеют различные укладки PLP-сшізьизающих доменов. Тем не менее использование одинакового кофактора проя&тлется в определенных структурных сходствах при
построении их PLP-связывающих центров. Оказывается, эти центры всегда локализованы в районе между амино-концом "якорной" спирали и ближайшим краем р-слоя.
Анализируя эти локальные сходства, встал вопрос о том, являются ли они частью общих мотивов, ответственных за опознавание белками АТР и PLP и, если да, то каковы эти мотивы. Для ответа на этот вопрос необходим дальнейший детальный сравнительный конфсрмационный анализ рахтичных АТР- и PLP-зависикых белков в связи с потенциальной возможностью: а) эквивалентного расположения ключевых аминокислот, катионов металлов н молекул соды, ответственных за специфические взаимодействия с коферментами и обеспечизаюших их аналогичное размещение в центрах связывания; б) существования других, топологически общих к в ряде случаев гораздо боле« длинных, фрагментов полипеггтшшых цепей; и в) формирования этими фрагментами полипептидных цепей идентичных вторичных структур, упакованных о эквивалентные супервторичнкс структуры.
Цель работы. В настояшеп работе, исходя из вышеизложенного, были поставлены следующие задачи:.
1. Разработать автоматизированный компьютерный мел од,
позволяющий определять и сравнивать сегменты локальной
сгрухтурной гомолоши в различных белках независимо от их
расположения я структурах, топологии укладки и направления
полипентлдной цепи.
2. Определить топологически обшна фрагменты голнпептидных
пеней DD-лигазы и сАРК. В пределах этик фрагментов установить
аминокислоты, ответственные за структурно эквивалентные
взаимодействии с коферментами, катионами металлов и водой в двух белках.
3. Найти и проанализировать общий набор атомов (структурный
мотив), ответственный за эквивалентное связывание АГР в
комплексах АТР-зависимых белков с кофактором.
4. Провести сравнительный конформационный анализ
представителей пяти неродственных семейств PLP-зависимих
белков с целью поиска важных структурных сходств вблизи
кофермента.
Научная новизна. В панной работе описывается новый
компьютерный метод GENF1T, позволяющий как
автоматизированное определение районов локального структурного сходства эволюнионно несвязанных белков, имеющих различные упаковки, так и разрешающий проведение глобального сравнительного конформаиионного ана.иза таких белков. С помощью метода сравнительною конформаиионного анализа было впервые: 1) показано существование аналогичных супервторичных струюур у DO-лигазы и сАРК, и вынчлено 17 эквивалентных аминокислог, взаимодействующих с коферментом; 2) найдены общие наборы из пяти ключевых атомов у трех АТР-зависимых белков с различной третичной структурой, зквивалеіггно взаимодействующие с кофактором (АТР-связывлюший мотив); и 3) установлено существование обшей суперзторичнон структуры, важной для формирования РЬР-свишвагоаюго центра в пяти различных топологиях PLP-зависимых ферментов .Практическая Ц1Ш01Ь- По;гученные в работе результаты с одной стороны позволят приблизиться к пониманию природы конвергентной эволюции белков к одному и тому же структурному мотиву, обеспечивающему коферменту комплемен і арность к белку, і! с другой стороны представляют интерес с практической точки
зрения их использования в медицине и биотехнологии при структурных модификациях АТР- и PLP-зависимых белков с целью изменения их ферментативной активности для разработки новых медицинских препаратов.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены на VII ежегодном симпозиуме "Структура и Сворачивание" (Турху, Финляндия, 1997). Всего по теме диссертации опубликовано четыре работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 99 наименований. Работу иллюстрируют 33 рисунка, 6 схем и 4 таблицы, обший объем диссертации 114 страниц.
Похожие диссертации на Исследование кофермент-связывающих центров АТР- и PLP-зависимых белков методом сравнительного конформационного анализа
