Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА I Обзор литератур CLASS ы
1.1. Особенности гетеротрофных организмов 9
1.1.1. Общие сведения о метаболизме гетеротрофных организмов 9
1.1.2. Циста как покоящаяся форма 10
1.1.3. Особенности биологии жаброногого рачка A.salina 17
1.2. Механизмы устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам 22
1.2.1. Проблема устойчивости 22
1.2.2. Адаптивное значение анабиоза 25
1.2.3. Особенности воздействия воды на биосистему 27
1.3. Влияние неблагоприятных факторов
на жизнедеятельность гетеротрофных организмов 31
1.3.1. Влияние низких температур и высушивания 31
1.3.2. Влияние высоких температур и аноксия 33
1.3.3. Влияние вторичных корпускулярных потоков 34
1.4. Некоторые методы изучения интегральных метаболических характеристик биосистемы 34
1.4.1. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 35
1.4.2. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса 38
1.5. Биоиндикаторы химических и физических факторов окружающей среды 40
1.5.1. Биоиндикаторы загрязнения воды 41
1.5.2. Биоиндикаторы ионизирующих излучений 43
1.6. Проблемы комплексного обеспечения жизнедеятельности человека вне биосферы Земли t 45
1.6.1. Космическое ионизирующее излучение 46
1.6.2. Особенности нейтронного потока атмосферы 47
CLASS ГЛАВА II Материалы и методы исследований 5 CLASS 0
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Определение подвижности протонов методом ядерного магнитного резонанса 51
2.3. Определение концентрации радикалов и ионов методом электронного парамагнитного резонанса 53
2.4. Метод рассеяния моноэнергетических нейтронов 57
2.5. Метод определения влияния высоких и низких температур на цисты A.salina 59
2.5.1. Влияние низких температур 59
2.5.2. Влияние высоких температур 59і
2.6. Определение влияния фонового радиационного воздействия в воздушном, водном и земном пространствах на цисты A.salina 61
CLASS ГЛАВА III Результаты исследований и их обсуждение 6 CLASS 6
3.1. Влияние низких температур на цисты A.salina 66
3.2. Влияние замораживания на подвижность фракции* протонов в цистах A.salina 71
3.3. Влияние высоких температур на цисты A.salina 75
3.4. Влияние нагревания на подвижность фракции протонов в цистах A.salina 80
3.5. Влияние искусственного нейтронного потока с экстремально высокой активностью на подвижность фракции протонов в цистах A.salina 82
3.5.1. Влияние природного (фонового) нейтронного потока, изменяющегося с высотой, на подвижность фракции протонов в цистах A.salina 86
Заключение 93
Выводы 96
Библиографический список 97
- Особенности гетеротрофных организмов
- Механизмы устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам
- Определение подвижности протонов методом ядерного магнитного резонанса
- Влияние низких температур на цисты A.salina
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для биосистемы, находящейся в неблагоприятных условиях, основной задачей становится поддержание жизнедеятельности с сохранением энергетического потенциала. Главным адаптационным механизмом к., неблагоприятным воздействиям считаеіся способность организма входить в состояние анабиоза или диапаузы. В связи с эгим< возникает вопрос о наличии действующих энергообразующих процессов в диапаузирующей системе в условиях истощения запасов органических веществ, снижения скорости окисли гельно-восстановительных реакций и синтеза АТФ ниже предела обнаружения [84]. Предполагается, что метаболические, в том числе мембраносвязанные процессы все же происходят, но они сильно замедленны [44, 53]. Замедленные мембраносвязанные процессы могут обеспечить поддержание жизни в диапаузирующей системе. Градиенты разности температур, перепады-давления, влажности, действие корпускулярных потоков, а также механохимическая генерация мембранного потенциала, подобно процессам в тельцах Пачини и дисках Мейснера, могут выступать поддержкой межфазных потенциалов по причине наличия эффектов Соре и Зеебека и счшаться второстепенным механизмом поддержания жизнеспособности [48, 117]. Значшельные трудности в проведении таких исследований і вносит огсуісгвие предсказательных теоретических моделей, поскольку биообъект является сложной системой. В ю же время задача изучения устойчивости организма к неблагоприятным условиям становится все более актуальной. Исследование общебиологических закономерностей адаптационных свойств биообъекта, а также влияния на него неблагоприятных температурных режимов и действия облучений различной интенсивности может способствовагь развитию фундаментальных представлений различий живого и мертвого. В то же время механизмы устойчивости биообъекта к неблагоприятным условиям изучены недостаточно.
Для изучения устойчивости биообъекта к неблагоприятным абиотическим факторам необходим системный анализ, который основывается на изучении различных уровней организации биообъекта при его взаимодействии с окружающей средой. В настоящей работе проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию
организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном уровне, в частности, при взаимодействии с корпускулярным излучением, на молекулярном уровне, субклеточном (мембранном), клеточном и организменном уровне организации системы.
Важной проблемой является поиск биологических объектов, наиболее адекватно- реагирующих на неблагоприятные воздействия и имеющие простую организацию, позволяющую получать информацию о неблагоприятных воздействиях, независящую от таксономического положения организма. Кроме того, важен подбор специфичных и высокоинформативных методов исследования влияния различного рода воздействий на биообъект- с целью объективизации полученных результатов. При исследовании влияния неблагоприятных факторов на живой организм применение могут найти методы, основанные на оценке физических параметров биотестера.
В качестве биотсстера могут быть, использованы высокостойкие цисты жаброногих рачков Artemia salina. Известно, что цисты A.salina применяют для оценки степени загрязнения водной среды, так как толстая оболочка цисты обладает высокой степенью устойчивости [164, 37, 84]. Благодаря таким свойствам оболочки, циста A.salina способна переживать в течение многих лег неблагоприятные условия^ среды в состоянии анабиоза или диапаузы, когда метаболические процессы в ней сильно замедлены [113, 109]. При этом всегда имеется возможность вступления A.salina в цикл с помощью влияния адекватного стимула [54].
Нерешенной задачей является также отсутствие удачно подобранного комплекса высокоинформативных методов регистрации метаболических процессов в диапаузирующей системе при неблагоприятных условиях. Кроме того, в этих условиях остаются неизученными-физические пределы возможности покоящейся неметаболизирующей формы оставаться жизнеспособной в период диапаузы.
Целью настоящей работы явилось изучение механизмов устойчивости диапаузирующих цист A.salina к неблагоприятным температурным воздействиям и действию ультраслабых нейтронных потоков с различной интенсивностью.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние низких температур навсхожестьцист A.salina.
Оценить концентрацию свободных радикалов, парамагнитных ионов* и подвижность фракции протонов в цистах A.salina в условиях низких температур в течение длительного периода времени;
31' Изучить влияние высокихтемпературна всхожесть цист A.salina.
4- Оценить, влияние нагревания (от +25G до +110G) на подвижность-фракции?
протонов в цистах A saliha. 51 Оценить влияние: искусственного корпускулярного (нейтронного) потока на
подвижность фракции протонов в цистах A.salina, концентрацию?свободных.
радикалов и парамагнитных ионов. 6. Провести системный анализ реакции цист A.salina как биотестера на действие
радиационного излучения в условиях космического* полета на спутнике и
трансконтинентального авиаперелета:.
Научная новизна: Впервые был использован системный анализ при изучении механизмов устойчивости: цист A.salina к неблагоприятным; условиям. Модельный- объект изучали^ как. иерархическую систему: проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном: (при взаимодействии с корпускулярным излучением), молекулярному субклеточном (мембранном), клеточном и организменном уровнях организации системы. В работе впервые показано, что при воздействии на цисты A.salina высокой температуры (+110G) живые цисты.нагреваются медленнее, чем мертвые. Впервые отмечено, что в цистах, после лиофильного высушивания, остается 3 - 4% (от веса образца) подвижной фракции- протонов; которые принадлежат водной и липидной фракциям. Впервые для выяснения механизмов устойчивости цист изучались возможные механизмы выживания: протонной подвижности, концентрации свободных радикалов. Впервые изучена роль корпускулярных потоков с использованием высокоинформативных методов ядерного магнитного резонанса - спиновое эхо и электронного парамагнитного резонанса.
Научно-практическая значимость работы
Научная значимость работы заключается в том, что системный анализ механизмов выживаемости биообъекта при неблагоприятных воздействиях окружающей среды необходим для понимания и контролирования этих процессов, так как они являются .универсальными для всех гетеротрофов. Полученные данные о наиболее значимых механизмах устойчивости биотестера к неблагоприятным космогеофизическим воздействиям могут иметь определенное значение (для понимания и анализа этих процессов у человека. Практическая значимость работы заключается в расширении знаний о выживаемости цист A.salina в неблагоприятных условиях, поскольку цисты культивируются как основной белковый источник питания для многих гетеротрофных организмов, а также при глубокой переработке цист получают препараты и вещества, используемые в медицине, производстве высоко стимулирующих биопрепаратов, иммуномодуляторов, корректирующих обмен веществ у человека. Основные положения, выносимые на защиту:
Представлено комплексное системное исследование механизмов устойчивости диапаузирующих цист A.salina к различным неблагоприятным воздействиям -резким колебаниям температур и действию корпускулярных (нейтронных) потоков с различной интенсивностью при' сравнении реакций- организма на атомно-молекулярных и организменном уровнях. Одновременное определение подвижности протона в условиях ядерного магнитного резонанса - спинового эха, интегральной кинетики свободно радикальных реакций в клетках, неравновесной кинетики теплопереноса в биомассе могут служить новой совокупностью критериев различения живого и мертвого у организмов, находящихся в состоянии метаболического покоя, анабиоза.
С помощью метода ядерного магнитного резонанса (спиновое эхо) было показано, что движение фракции протонов в цистах A.salina составляет 3 - 4% (от веса образца) и принадлежит липидной и водной фракциям, и эта подвижность одинакова как в опытных, так и в контрольных образцах.
Выявленную способность цист A.salina охлаждаться при нагревании, можно отнести к защитно-приспособительным механизмам устойчивости при неблагоприятных воздействиях.
Способность цист, находящихся в неблагоприятных условиях низких температур и интенсивного корпускулярного (нейтронного) потока, сохранять концентрацию свободных радикалов в пределах физиологических значений свидетельствует об измеряемом протекании- метаболических процессов, связанных с антиоксидантний защитой.
Показано, что облучение цист A.salina корпускулярным (нейтронным) потоком, приводит к изменениям внутренней протонной подвижности в мертвых цистах A.salina при стабилизации этого показателя у живых цист.
Апробация работы:
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной гидробиологической конференции «Водные экосистемы и организмы - 6» (Москва, 2005); на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам' «Ломоносов - 2006» (Москва, 2006); на Международной гидробиологической конференции «Водные экосистемы и организмы - 7» (Москва, 2006); на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной и физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2007); на II научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Пегрозаводск, 2007); на международной конференции «Развитие идей А.Л. Чижевского» (Санкт-Петербург, 2007); на XV Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008). Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 112 страницах и состоит из следующих разделов: обзора литературы, методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка 167 источников, из них 125 на русском и 42 на иностранных языках и приложения. Работа содержит 4 таблицы, 20 рисунков.
Особенности гетеротрофных организмов
Предпосылки к изучению метаболизма покоящихся клеток появились в 70-х годах. В эго время усиливается интерес к изучению клеток в разных периодах цикла, а также в состоянии покоя [57].
Как известно, клеточная поверхность мембраны выполняет две основные функции, связанные с переходом покоящихся клеток в митотический цикл. Она воспринимает сигналы и обеспечивает транспорт в клетку. Мембраны состоят на 60 % из белков и на 40 % из липидов. Снижение текучести липидов способствует стабилизации мембраны при переходе клетки в состояние покоя. Кроме того, на поверхности покоящейся клетки наблюдается увеличение основных углеводных компонентов внеклеточного матрикса. В связи с такими изменениями поверхности покоящейся клетки снижается проницаемое іь ее наружной мембраны [53].
В покоящихся клетках избирательно активируются отдельные метаболические реакции - повышение скорости обновления макромолекул и активация ферментов энергетического обмена. Это обеспечивает устойчивость клетки к внешним воздействиям [54].
Избирательная активация метаболических процессов в состоянии покоя присуща всем организмам и рассматривается как единый принцип существования покоящихся клеток [113]. Исходя из этого в данной главе будут рассмотрены цисты покоя, взятые для исследования в настоящей работе: цисты, относящиеся к низшим животным. Класс - Crustacea (ракообразные); подкласс - Entomostraca; отряд - Phyllopoda; подотряд - Euphyllopoda; семейство - Branchipodidae; род -Artemia. В мировой литературе покоящиеся цисты A.salina изучены фрагментарно, так как они обладают прочной оболочкой, из-за которой большинство современных методов исследования являются неадекватными. а б в Рис. 1.1. Дробление цисты A.salina: а - целобластула; бив- целобластула и погружение мезодермы на вегетативном полюсе [129]. Известно, что у всех ракообразных дробление цисты (рис. 1.1) относится к полному и равномерному типу [58], в результате под яйцевыми оболочками формируется личинка - науплий. На брюшной стороне зародыша появляются три пары бугорков - зачатки науплиальных конечностей, на переднем конце выпячивается стомодеум, на заднем - протодиум.
Количество цист, продуцируемых A.salina, зависит от солености и обилия корма. В среднем одна особь может откладывать до 200 цист с интервалом от 3 до 11 дней. В состоянии диапаузы сухие цисты A.salina могут находиться в течение нескольких лет, попадая в воду, они становятся способными к дальнейшему развитию. При благоприятных условиях (температура +8С, соленость 10 - 13%о), эмбрионы, заключенные в толстую скорлупу [116], начинают развиваться, разрывают оболочки и переходят к свободной жизни (рис. 1.3).
Рачки A.salina раздельнополы. Среди существующих популяций одни размножаются половым путем, другие — партеногенетически. A.salina может размножаться живорождением и откладыванием яиц [139].
При этом A.salina откладывает два типа яиц: тонко- и толстоскорлуповые, из тонкоскорлуповых выклев науплий происходит после их вымета, из толстоскорлуповых - после выхода из состояния диапаузы [32].
Чередование живорождения и яйцекладки может происходить несколько раз в жизни одной и той же самки. При этом способ размножения A.salina обусловлен содержанием кислорода в воде, а также ее соленостью: при солености воды 12,86%о - яйца или живорождение; при солености воды 14,76%о -диапаузирующие цисты. При солености воды 5%о плодовитость A.salina составляет 176 цист или науплиусов, при солености 12,8%о - плодовитость 224
цисты или науплиусов, при 18,22%о - 108 цист или науплиусов. Обычно считается, что откладывание цист связано с неблагоприятными условиями -повышением солености, снижением содержания кислорода [93, 106, 108, 109].
A.salina является типичным галобионтом,- обитая в водах высокой солености, она почти избавлена от врагов и конкурентов, кроме птиц, что способствует образованию ее популяций с высокой численностью и биомассой [93]. Избирательная проницаемость оболочки позволяет цисте распространяться по территории суши, используя в качестве переносчиков животных. Цисты проходят через кишечник переносчика и остаются живыми, благодаря защитному свойству своей оболочки, поэтому цисты A.salina называют пропагулами. Оболочка пропагул задерживает яды, а необходимые для развития кислород и воду пропускает. Способность к избирательной проницаемости -общее свойство мембран. В тоже время мы сталкиваемся с появлением этой способности у организмов, находящихся в несовместимой с жизнью среде. Вероятно, это свойство оболочки цисты A.salina связано с затратами энергии, так как это работа по разделению смеси [84].
Выполняя- в организме цисты функции катализаторов и регуляторов метаболизма, структурные и энергетические функции;, липиды играют важную роль в адаптивных реакциях организма в ответ на изменения условий:.внешней среды. Одним из важнейших классов липидов являются фосфолипиды. Фосфолипиды входят в состав клеточных мембран и являются- составными элементами липопротеиновых комплексов, выполняя функции регуляторов II катализаторов клеточной активности и мембранного транспорта. Другим, не менее важным, классом липидов являются триацилглицерины, что связано не только с их физиологической ролью резерва энергии, но и источником глицерина, жирных кислот и холестерина, являющихся сходными продуктами при биосинтезе углеводов, желчных кислот, простагландинов и стероидных гормонов [78].
Изменение структуры жирнокислотного состава (количества непредельных связей, доли кислот с нечетным количеством атомов углерода и соотношение кислот с различной длиной цепи) приводит к изменению активности ферментов, проницаемости мембран и вязкости внутренней среды клеток, что влечет за собой изменение рождаемости, выживаемости и скорости роста организма.
Среди жирных кислот наибольшее влияние на физиологию организма оказывают эссенциальные жирные кислоты, которые либо не синтезируются организмом, либо синтезируются в крайне недостаточном количестве. Так, для пресноводных организмов наибольшее значение имеют линолевая и линоленовая кислоты, а эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты являются эссенциальными для галобионтов [126, 162, 166].
Таким образом, механизм формирования жирнокислотного состава липидов - это один из главных механизмов, через который осуществляется адаптация организма к изменяющимся условиям внешней среды [70, 71]. Состав липидов тесно связан с абиотическими факторами: температурой, соленостью и кислородным режимом водоемов. Изменение этих факторов приводит к перестройке общего метаболизма веществ, переходу на разные способы размножения и получения энергии.
Механизмы устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам
Показано, что среди примитивных форм жизни многие организмы были способны в любом состоянии быть анаэробами и переносить большие дозы ультрафиолетовой и ионизирующей радиации, а также вакуум [81]. По происхождению можно различать два вида устойчивости: физико-химическую и биологическую (адаптивную). Физико-химическая - это устойчивость молекулярных органических соединений, ставших основой первых живых систем. Благодаря устойчивым соединениям первичные организмы (бактерии, сине-зеленые водоросли) переходили в состояние покоя. Явления первичной устойчивости реализовались и в клетках более высокоорганизованных животных [86].
В Мировом океане прогрессировали регуляторные механизмы, необходимые для активной жизни в океанической среде, но при- этом редуцировались способы защиты от колебаний внешних факторов системного характера, такие, как способность переходить в состояние покоя, анабиоза, переносить замерзание и высушивание.
Первичная устойчивость возникла, как результат способности химических веществ вступать во взаимодействие. Под действием коротковолнового УФ-излучения образуются молекулы аминокислот и азотистых оснований нуклеиновых кислот, которые, в свою очередь, поглощают длинноволновое УФ-излучение, что вызывает цепную реакцию [82].
Вторичная устойчивость формировалась на основе первичной под влиянием адаптации, к новым факторам среды и естественного отбора. Существует точка зрения, что под первичной теплоустойчивостью нужно понимать устойчивость, препятствующую- или сводящую к минимуму роль деструктивного последействия в гомеостатических процессах [16].
Следует отметить, что многие исследователи под первичной устойчивостью понимают устойчивость живой клетки или организма. Интересно привести распространенное определение устойчивости живых систем как свойства жизни и необходимого условия постоянного поддержания состояния жизнедеятельности [105, 113] или сохранения «устойчивого неравновесия» [22]. В первом определении не учитывается устойчивость живых систем в неактивном состоянии и при анабиозе.
Необходимо различать устойчивость организмов к неблагоприятным факторам в их естественном состоянии, например пойкилогидридных - по отношению к влажности и криоустойчивых - к замораживанию, и такую же устойчивость, достигаемую искусственно, с помощью обработки клеток криопротекторами. Последней обладают живые системы, неспособные переносить высушивание и переходить в состояние покоя.
Между этими двумя группами может быть выделена группа организмов, которая становится устойчивой к неблагоприятным факторам за счет процедур, проводимых с определенной скоростью высушивания и охлаждения в определенной последовательности. К таким организмам относится A.salina. Подобную устойчивость показывает циста A.salina имеющая диапаузу, она становится устойчива к экстремальным факторам на время от двух месяцев до тысячелетий [65, 114, 121].
Таким образом, анабиоз определяется устойчивым неравновесием живой системы, когда изменение среды выводит систему из состояния покоя, и только смерть приводит ее в состояние необратимого равновесия. Устойчивость представляет собой сопротивляемость системы по отношению к изменению внешних условий и действию неблагоприятных факторов. Первичная устойчивость.зависит от изменения прочности макромолекулярных соединений, конформации клеточных белков и нуклеиновых кислот, которые зависят от состояния ауторегуляторных механизмов, организма и его функций. Поэтому первичная устойчивость макромолекулярных соединений всегда выше устойчивости вторичной, организменной. Например, к ионизирующей радиации и коротковолновым УФ-лучам наиболее устойчив дегидратированный организм -циста A.salina, которая выдерживает большие дозы облучения в состоянии анабиоза. Напротив, гомойотермные животные повреждаются и погибают даже при малых дозах облучения [55, 87].
Способность к криоанабиозу исследователи связывают со структурой клеточных мембран и их проницаемостью для солей и воды, которая зависит от вязкости протоплазмы и гидрофильности белков [31].
При большой вязкости в клетке цисты сохраняется незамерзающая вода и для возникновения устойчивости к кристаллизации необходимы быстрая дегидратация, высокая скорость и поэтапное охлаждение. Повышение устойчивости к охлаждению и криоанабиоз возникают при условиях, находящихся в оптимальном взаимоотношении [77].
Ученые исследовали иммунные свойства клетки и влияние высоких энергий - коротковолновой ультрафиолетовой и ионизирующей радиации на клетку и ее компоненты при низких температурах. Оказалось, что при низких температурах радиация действует иначе, чем при температурах выше 0С, непропорционально глубине охлаждения, но соответственно — дегидратации. Устойчивость при ангидробиозе увеличивается благодаря уменьшению образования свободных радикалов [119, 125].
Из этого следует, что при анабиотических температурах в макромолекулярных соединениях и организме цисты A.salina происходят структурные перестройки, отличающиеся от процессов, протекающих у клетки в активном состоянии. Проблема устойчивости как важнейшее свойство жизни неразрывно связана с анабиозом.
Определение подвижности протонов методом ядерного магнитного резонанса
В работе было использовано две ЯМР-установки низкого и высокого разрешений: ЯМР-XL-IOO отечественного производства и Avance 600 фирмы «Вгикег».
ЯМР - установка включает блоки: 1) компьютер служащий в качестве командного устройства, а также для визуального наблюдения сигналов, накопления и усреднения амплитуд эхо-сигналов, разделения многокомпонентной кривой спада амплитуд эхо-сигналов на отдельные экспоненты и определения Т; и Т2 для каждой компоненты спада; 2) программный блок, который вырабатывает определенную последовательность 90 и 180 импульсов для определения Ті, Т2 И D; 3) генератор радиочастотных импульсов, которые создают высокочастотное магнитное поле (Н0) для поворота магнитных моментов ядер; 4) измерительная головка в качестве которой служит катушка индуктивности колебательного контура, ось которой перпендикулярна силовым линиям Я0, создаваемого постоянным магнитом- (около 0,4 Т); 5) осциллограф, который предназначен для визуального наблюдения сигналов спинового эха и сигналов передатчика, прошедших через тракт приемника. Для измерений при различных температурах использовалась специальная приставка с резервуаром для жидкого азота. Точность работы приставки ±1С. Суммирование и накопление результатов отдельных измерений, разделение многокомпонентной кривой спада сигналов на отдельные компоненты и определение Г/, Т2 для каждой компоненты осуществлялось программой, созданной специально для данной установки. Ядерный магнитный резонанс дает широкий набор параметров (форма, ширина, площадь и положение резонансной линии; времена спин-решеточной Г/ и спин-спиновой релаксации Т2, коэффициент диффузии ядер D), в которых отражается динамика молекул [8, 115, 123].
Принцип этого метода состоит в том, что система спинов, ориентированных в постоянном внешнем магнитном поле, возбуждается импульсом радиочастотного поля и тем самым выводится из равновесия. В методе используется два или более импульсов, один из которых выводит спиновую систему из состояния равновесия, а другие устраняют нарушения когерентности в движении спинов из-за различия локальных полей, связанных с отличием химических сдвигов для разных групп или с неоднородностью постоянного магнитного поля в пределах образца. Применяя различные последовательности импульсов, регистрировали, с одной стороны, процесс возвращения спинов к исходной ориентации с восстановлением продольной намагниченности с характерным временем, а с другой - спад поперечной намагниченности с характерным временем. Для исключения влияния диффузии протонов при измерении времени спин-спиновой релаксации использовали метод Carr-Purcell-Meibooom-Gill (90 - п - 180). Амплитуда сигнала равна числу ядер, дающих вклад в резонанс. Частота работы установки около 20 МГц. Точность измерений- не выше 7%. Линейность работы установки постоянно контролировалась по водному эталонному раствору медного купороса [12].
Метод ядерного магнитного резонанса позволяет получать информацию о подвижных протонах, конформационной подвижности белков и их отдельных групп, частотные и энергетические характеристики таких движений. По амплитуде сигнала можно определить количество воды в образце и, в общем, оценить количество подвижных водородсодержащих молекул. Регистрируемые с помощью метода «ЯМР - спиновое эхо» частоты внутреннего движения лежат в пределах от 10"4 до 104 Гц, то есть, начиная от частот, характерных для твердого тела и заканчивая частотами, характерными для невязких жидкостей. Характерные кривые спада сигнала спинового эха от протонов высушенных образцов имеют сложный многокомпонентный характер. При их разложении на составляющие можно получить до трех компонент, которые подчиняются экспоненциальному закону [4]. Спад эхо-сигналов пропорционален кубу времени и квадрату градиента магнитного поля. Суммарный спад намагниченности рассчитывали по формуле: А ос ехр - [-(2 т/Т2, Ті) - 2/3 Y2G2Dv2K] (1), где G - градиент магнитного поля; D - коэффициент диффузии протонов; Y -гидромагнитное отношение, постоянное для каждого типа ядер; т расстояние между импульсами; К - числовой множитель; Ті - время спин-реше точной релаксации ядер; Ті- время спин-спиновой релаксации ядер. Определение времени спин-спиновой релаксации протонов в цистах A.salina проводили на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Образцы цист A.salina высушивались в установке для лиофилизации. На последних этапах сушки образец нагревался до комнатной температуры. Для измерений в стеклянную ампулу с пробкой помещали сыпучую навеску около 0,5 г цист, затем ампулу помещали между полюсами магнита. После воздействия на образец высокочастотных импульсов система ядерных спинов возвращается к равновесию, то есть ядро передает свою энергию аналогичным ядрам в результате спинового обмена, такой процесс обмена энергией между ядрами идет по механизму спин-спиновой релаксации ядер (7. Пределы изменения Г? варьируют от 10"5 до 104 с. В наших экспериментах компоненты неподвижных и малоподвижных молекул не регистрировались.
Существенным преимуществом метода ЯМР является то, что метод позволяет изучать объекты (в том числе живые) без нарушения их целостности и состояния. Для определения содержания общей фракции липидов в образцах использовали метод Фолча [137].
Влияние низких температур на цисты A.salina
Нами была поставлена задача оценить всхожесть цист A.salina при их промораживании при -10С в течение 70-и суток. Была определена всхожесть на 17-е, 32-е, 40-е, 47-е и 70-е сутки. Максимальный. срок определялся временем низкотемпературной активации, цист A.salina в естественных условиях, пройдя которую, цисты имеют высокий процент всхожести даже после переживания состояния замедленного метаболизма (анабиоза) неопределенно долгое время при любых температурных режимах.
Неактивированные живые цисты помещали в холодильник при постоянной температуре -10С, где они находились в течение всего 70-и дневного срока. Поэтапно на 17-е, 32-е, 40-е, 47-е и 70-е сутки их доставали порциями по 5 г, промывали от солей водопроводной водой и осаждали центрифугированием. Вылупившихся науплиев подсчитывали с помощью бинокулярного микроскопа, и определяли их всхожесть путем проращивания 100 штук цист в искусственной морской воде. Оставшаяся от 5 г часть цист, отобранная для проращивания, хранилась в сухом состоянии при комнатной температуре. Другие порции проб оставались в холодильнике на определенные сроки до завершения эксперимента. В качестве контроля служили неактивированные цисты A.salina, которые не подвергались воздействию низких температур, при помещении в морскую воду через 24 часа и далее они имели всхожесть равную 5 - 10%.
В результате проведения эксперимента опытные образцы цист A.salina, промороженные в течение 17-и суток в отличие от контроля, при помещении их в морскую воду не имели всхожесть; на 32-е сутки промораживания цисты имели 3% всхожесть; на 40-е - не имели; на 47-е сутки - имели 2% всхожесть и только, в противоположность этому, промороженные цисты, находившиеся при -10С в течение 70-и суток выявили 92% всхожесть (рис. 3.2).
Следовательно, изучение активации цист A.salina выявило следующие закономерности: промораживание цист в течение 47-и суток практически не выявило всхожести, а на 47-е сутки - только 2% выявили всхожесть. В тоже время содержание цист при -10С способствовало их максимальной всхожести, равной 92% к 70-м суткам.
Таким образом, на основании экспериментальных данных, мы можем заключить, что оптимальным сроком для максимальной всхожести цист A.salina является их содержание в течение 70-и суток при отрицательной температуре, исходя из того, что активация цист происходит после 70 дней промораживания. Наши данные согласуются с литературными данными, где отмечается, что в природе активация цист A.salina происходит в зимний период времени, когда у береговой линии соленых озер цисты находятся в диапаузе на протяжении 70-и дней. Стимулирующим фактором при продуцировании диапаузирующих (зимних) цист A.salina обычно становится температурный фактор при сочетании с повышением концентрации солей [109]. В тоже время наши данные имеют определенную новизну. Нами впервые было показано, что нахождение цист при температуре -10С в течение длительного срока приводит к их максимальной всхожести на 70-е сутки.
В следующем фрагменте экспериментальных исследований мы изучали концентрации свободных радикалов и парамагнитных ионов (Мп ;Си ; Fe ; Fe3+) в контрольных и опытных образцах цист A.salina, которые измерялись с помощью ЭПР-спектрометрии. ЭПР-спектрометрия - основной метод анализа количественных и качественных закономерностей образования свободных радикалов и парамагнитных ионов. Для этих измерений цисты в объеме 0,5 г переносили в стеклянный капилляр прибора, который устанавливали в постоянное магнитное поле, создаваемое электромагнитом установки ЭПР спектрометра. Концентрация парамагнитных ионов у активированных в течение 70-и суток цист A.salina при -10С выявила следующие закономерности. На рисунке 3.3 представлена амплитуда ЭПР-спектра, характеризующая концентрации парамагнитных ионов в неактивированных (контрольных), рис. 3.3.а, и активированных (опытных), рис. 3.3.б, образцах цист A.salina.
Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что амплитуда концентрации парамагнитных ионов в неактивированном (контрольном) образце цист на 70-е сутки промораживания в 2,5 раза ниже, чем в контрольном, что свидетельствует о снижении концентрации парамагнитных ионов в активированных цистах, подвергнутых низкотемпературной 70-и дневной активации. Эти данные представлены на рисунке 3.4 в виде концентрационной зависимости парамагнитных ионов от длительности промораживания цист A.salina. В контрольных (неактивированных) цистах концентрация парамагнитных ионов составила 0,4% на г образца. Концентрация парамагнитных ионов, измеренная в опытном (активированном) образце цист на 70-е сутки составила 0,3% на г образца, что на 0,1% ниже концентрации парамагнитных ионов в контрольном образце.
Следовательно, содержание цист в течение 70-и суток при -10С приводит к значительному снижению концентрации парамагнитных ионов в образце. При этом в процессе длительной активации в диапазоне от 17 до 47 суток концентрация парамагнитных ионов не превышает контрольных значений, то есть в этом диапазоне активация не происходит, а на 70-е сутки резко возрастает всхожесть, то есть активация наступает и, в случае воздействия адекватного стимула, вылупляются науплии.
Таким образом, достоверно зафиксирован ход метаболических процессов в цисте в период низкотемпературной активации. Протекание метаболических реакций в цисте при низкотемпературной активации приводит к изменениям степени окисления элементов, в результате исчезает их парамагнетизм, что и регистрируется спектрометром.
В следующем фрагменте экспериментальных исследований мы измеряли концентрацию свободных радикалов в контрольной и опытной пробе цист. Результаты этого измерения свидетельствуют о том, что концентрация свободных радикалов в опытном образце не отличается от контрольных значений. Следовательно, в активированных цистах, подвергнутых промораживанию при -10С в течение 70-и суток не происходит повышения концентрации свободных радикалов, что свидетельсівует о сбалансировании свободнорадикальных процессов в этих экспериментальных условиях. Возможно, это связано с мощной защитной эндогенной антиоксидантной системой и устойчивостью мембранных образований цист A.salina.
