Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние вопроса по исследованию следов крови и сывороточной системы гаптоглобина, как объектов судебно-медицинской экспертизы
I.1. Следы крови, как объект судебно-медицинского исследования; система гаптоглобина, как одно из перспективных направлений при исследовании следов крови 9
I.2. Действие различных физических и химических факторов на пятна крови 31
I. 3. Определение давности образования пятен крови 33
Глава II. Материалы и методы исследования
II. 1. Особенности и техника забора жидкой крови живых лиц для исследования по системе гаптоглобина, нанесение на изучаемые виды предметов-носителей. 35
II. 2. Особенности и техника исследования образцов высушенной крови по системе гаптоглобина 38
II. 3. Особенности и техника исследования образцов жидкой крови по системе гаптоглобина 40
Глава III. Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей 41
Глава IV. Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, хранившихся во влажном состоянии 57
Глава V. Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови, на предметах-носителях, хранившихся в земле 86
Глава VI. Обсуждение полученных результатов 98
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Список литературы 107
- Следы крови, как объект судебно-медицинского исследования; система гаптоглобина, как одно из перспективных направлений при исследовании следов крови
- Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей
- Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, хранившихся во влажном состоянии
- Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови, на предметах-носителях, хранившихся в земле
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из основных задач судебной медицины на современном этапе является быстрейшее внедрение в практику научных достижений, оказание всемерной помощи правоохранительным органам в профилактике и борьбе с определенными категориями преступлений, совершенных против личности человека и его здоровья.
Судебно-медицинское исследование крови человека и ее следов на вещественных доказательствах нередко имеет решающее значение при расследовании преступлений, в том числе таких тяжких, как убийство. При производстве судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств первое место занимают экспертизы, связанные с исследованием крови (Информационное письмо «О работе судебно-биологических отделений бюро СМЭ РФ» за 2004-2008 год) - около 70 % экспертиз.
Несомненный интерес для судебно-медицинских экспертов представляет
возможность использования в своей практике иммунологических, серологических,
цитологических, хроматографических и электрофоретических методов
исследования при решении целого ряда вопросов, возникающих как у работников правоохранительных органов, так и у самих экспертов в процессе работы с исследуемых материалом. Для исследования объектов биологического происхождения используются достижения современной медицины, биологии, иммунологии, генетики, химии (Барсегянц Л.О., 2004).
Основной системой, применяемой для определения групповой принадлежности крови является система АВ0, однако, в ряде случаев, только одной этой системы бывает недостаточно. В этих случаях эксперт прибегает к исследованию иных систем, среди которых важное место занимает система гаптоглобина (Туманов А.К., 1975; Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С., 1989).
Исследование следов крови по системе гаптоглобина в судебно-медицинских целях достаточно широко применяется в нашей стране с начала 80-х годов прошлого века, этой проблеме были посвящены работы ряда авторов
(Николенко О.В., 1971; Свирский М.С., 1981; Алешо Н.А., 1988; Бураго Ю.И., 1998; Барсегянц Л.О., 1999).
Сывороточный белок гаптоглобин (Нр), относится к а2-глобулинам сыворотки крови, его средняя концентрация в сыворотке крови составляет около 1 г/л, она подвержена значительным колебаниям, что связано с его генетически детерминированным фенотипом.
Исследование системы гаптоглобина при производстве судебно-биологических экспертиз существенно повышает информационную значимость экспертных выводов. Определение фенотипов гаптоглобина в пятнах крови широко применяется при производстве экспертиз спорного отцовства, материнства, замены детей, при одногруппности проходящих по делу лиц по системе АВО, сомнительных (нечетких) результатах при определении групповой принадлежности крови по системе АВО, для борьбы с влиянием предмета-носителя, при отсутствии контроля предмета-носителя, при работе со смешанными пятнами человека и животных, со смешанными пятнами крови человека и каких-либо выделений и т.д.
При производстве судебно-биологических экспертиз в ряде случаев возникает необходимость исследования фенотипов гаптоглобина в образцах крови проходящих по уголовным делам лиц и в пятнах крови на вещественных доказательствах. Иногда выявление фенотипов гаптоглобина не представляет никаких затруднений, в других же случаях в практической деятельности возникают определенные трудности, связанные с отсутствием разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах, не только в пятнах крови на вещественных доказательствах, но и в образцах крови проходящих по делу лиц. Это может быть связано как с условиями забора и хранения образцов крови и вещественных доказательствах, так и с различными сроками поступления вещественных доказательств в судебно-биологическое отделение.
В ходе практической деятельности, особенно при малом количестве материала для исследования, в первую очередь решается вопрос о предпочтительном выборе системы для дифференцирования, который зависит от
состояния пятен крови, в частности: размеры, насыщенность пятна и т.д.. При этом выявление фенотипов гаптоглобина может зависеть не только от вида предмета-носителя, на котором находится пятно, но и от воздействия на него каких-либо физических или химических факторов.
Однако, до настоящего времени, в доступной нам литературе мы не встретили работ о том, на каких предметах-носителях пятна крови следует исследовать по системе гаптоглобина в первую очередь, целесообразно ли брать для данного исследования вещественные доказательства, на которых имеются гнилостные изменения, или после длительного нахождения в различных условиях, например, при сокрытии следов преступления путем захоронения.
Все это и послужило основанием для проведения исследования по установлению влияния на возможность определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови следующих факторов: вида предмета-носителя, сроков и условий хранения вещественных доказательств с пятнами крови, влияния некоторых конкретных факторов внешней среды, которым наиболее часто подвергаются вещественные доказательства до изъятия их следственными органами и поступления в судебно-биологическое отделение.
Цель исследования:
Оценить эффективность определения фенотипов гаптоглобина в следах крови человека на предметах-носителях в зависимости от характера условий окружающей среды и давности образования следов крови.
Задачи исследования:
-
Оценить эффективность исследования системы гаптоглобина в пятнах крови, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей.
-
Оценить эффективность исследования системы гаптоглобина в пятнах крови, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани, хранившихся во влажном состоянии и в почве в течение различных периодов времени.
3. Разработать рекомендации по применению результатов исследования для
наиболее рационального использования системы гаптоглобина при
проведении экспертизы вещественных доказательств и конкретизации
вопроса о давности образования пятен крови.
Научная новизна. Впервые установлена зависимость между возможностью
определения фенотипов гаптоглобина, видом предмета-носителя, и сроком
воздействия на вещественные доказательства факторов внешней среды и
предложено использовать полученные результаты для установления давности
образования пятен крови, что имеет существенное значение при производстве
судебно-медицинских экспертиз.
Практическая значимость. Результаты проведенной научно-исследовательской работы позволят наиболее рационально подходить к выбору системы гаптоглобина, как основной, так и дифференцирующей при производстве судебно-медицинских экспертиз следов крови на вещественных доказательствах. Наиболее рационально проводить отбор пятен крови на вещественных доказательствах для производства экспертиз, что позволит сократить время производства экспертиз и наиболее экономно подходить к расходованию исследуемого материала, необходимого для проведения исследований. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Вид предмета-носителя, на котором находится пятно крови, оказывает влияние на возможность определения фенотипов гаптоглобина при исследовании следов крови на вещественных доказательствах.
-
Факторы внешней среды, которым зачастую подвергаются вещественные доказательства, а также условия хранения вещественных доказательств оказывают существенное влияние на возможность определения фенотипов гаптоглобина при исследовании следов крови на вещественных доказательствах, что в ряде случаев может быть использовано для установления сроков образования кровяного пятна.
3. Установлены временные сроки определения фенотипов гаптоглобина в следах крови человека на предметах-носителях, позволяющие решать вопрос о давности образования следов крови.
Апробация материалов диссертации проходила: на итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов Новосибирского государственного медицинского университета (2006, 2007, 2010 год); на Российском совещании судебно-медицинских экспертов судебно-биологических отделений (г. Новосибирск, 2006 год); на заседании совета межрегионального общественного объединения «Судебные медики Сибири» (г. Новосибирск, 2006 год; г. Томск, 2008 год).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Личный вклад автора заключается в самостоятельном заборе крови и нанесении его на исследуемые виды предметов-носителей; подготовке и проведении электрофореза в вертикальных пластинах двухслойного полиакриламидного геля; учете, фотографировании и анализе результатов проведенных реакций.
Внедрение результатов исследования в практику. Данные научного исследования используются в практической работе экспертами судебно-биологического отделения Новосибирского областного и Алтайского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы; внедрены в учебные процессы на кафедрах судебной медицины Новосибирского и Алтайского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающей 168 источников, в том числе 72 зарубежных. Диссертация содержит 22 фотографии, 23 таблицы.
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава» г. Новосибирск) по проблеме: «Изучение патофизиологических механизмов влияния света и других факторов экзогенной природы на организм» (№ государственной регистрации 01200959105).
Следы крови, как объект судебно-медицинского исследования; система гаптоглобина, как одно из перспективных направлений при исследовании следов крови
Следы крови играют большую роль при расследовании дел об убийствах, изнасилованиях, причинении вреда здоровью человека и других преступлениях. Кровь может оставаться на теле и одежде убийцы, орудиях преступления, различных предметах на месте происшествия. Следы крови могут быть весьма разнообразны. Вид следов зависит от способа их образования, состояния крови, состояния предмета-носителя. Чем более гладкой является поверхность, тем лучше сохраняется форма следа. Исследование следов, подозрительных на кровь, обычно производится в судебно-биологических отделениях Бюро судебно-медицинских экспертиз с целью решения вопросов определения наличия крови, установления ее видовой и групповой принадлежности. Объекты для исследования представляются в различные сроки после совершения преступления и нередко находятся в неблагоприятных условиях, подвергаясь воздействию различных физических и химических факторов, микроорганизмов, поэтому их исследование может вызвать у экспертов затруднение.
В настоящее время существует огромное количество публикаций, посвященных изучению групп крови человека. В данном разделе своей работы мы не ставили перед собой задачу полного, всеобъемлющего обзора многочисленных литературных источников. Нами была предпринята попытка анализа наиболее оригинальных фундаментальных разработок, направленных на идентификацию следов крови по различным системам, с акцентом на классическую систему АВО и сывороточную систему гаптоглобина (Нр).
На современном этапе развития науки, определение понятия групповой принадлежности крови постоянно пополняется, расширяется и становится все более затруднительным. С открытием классических групп крови (АВО) в начале нынешнего столетия были определены первые изосерологические различия в пределах одного вида. Эти различия основывались на реакции агглютинации, т.е. склеивания эритроцитов одного человека под влиянием сыворотки другого [23].
Начиная со второй четверти XX столетия были выявлены новые изосерологические свойства М, N, Р. В 1940 г. был открыт резус-фактор, который сыграл большую роль в клинике и послужил отправным моментом к последующим открытиям ряда других групповых свойств, связанных с групповыми антигенами, находящимися в строме эритроцитов крови человека. С открытием генетической полиморфпости гаптоглобина в 1955 году началась эра сывороточных групп. Возникли понятия группы крови и сывороточные группы.
Далее в 1958 году были открыты лейкоцитарные, а в 1959 году - тром-боцитарные группы и, наконец, с 1963 года началось выявление в эритроцитах человеческой крови групп целого ряда ферментов. Все групповые факторы крови можно подразделить по целому ряду признаков: локализации, способам выявления, биохимической характеристике, а так же по биологической функции [60].
Приступая к обзору литературы, касающейся изучению групп крови человека, следует сказать, что наука об изоантигенах и изоаитителах возникла на рубеже XX столетия благодаря классическим исследованиям приват-доцента Венского университета Карла Ландштайпера [66]. В одном из своих трудов, он сообщил об открытии в сыворотке крови людей нормальных изогемагглютининов. Вместе с этим, была установлена антигенная дифференциация эритроцитов человека. Далее, благодаря работам И.И. Мечникова и его учеников (D. Bordet, Ф.Я. Чистовича, A.M. Безредки, СИ. Метелышкова, Л.А. Тарасевича и др., определены основные варианты иммунитета, которые способствовали развитию одного из важных разделов иммунологии [45]. И.И. Мечников показал, что иммунологические закономерности носят общебиологический характер. Этот момент является чрезвычайно важным в понимании филогенеза развития в природе изоантигенов и изоаитител, присущих не только человеку, но и представителям животного и растительного миров. Доказана первичность существования антигенов и вторичпость происхождения антител. Антигены обладают первичным качеством, характерным каждому виду животных и растений [43J.
Исследование крови человека в судебно-медицинском аспекте можно сгруппировать по следующим направлениям: определение наличия, видовой принадлежности крови, изучение групповой характеристики, ферментных систем крови, исследование разнообразных биологических, биохимических, биофизических, иммунологических и молекулярио-гепетических факторов крови для нужд судебной медицины.
В повседневной практике судебно-медицинских экспертов судебно-биологических отделений, следует отметить проведение разнообразных поисковых реакций на вещественных доказательствах, среди которых около 70% занимают исследования по установлению наличия крови. В настоящее время, для определения наличия крови на орудиях преступления и других вещественных доказательствах, в большинстве лабораторий страны применяют три основных доказательных метода (по возрастанию чувствительности): микроспектроскопия, хроматография в тонком слое, микролюминесценция. Любой из указанных методов является методом выбора, однако если использование наименее чувствительного метода дало отрицательный результат, применение более чувствительного обязательно [6, 10, 11, 23, 41, 83, 87].
Метод микроспектроскопии основан на свойстве большинства красителей, в том числе и красящего вещества крови (гемоглобина и его производных), поглощать свет с определенной длиной волны, образуя на сплошном солнечном спектре темные полосы поглощения. Такой спектр называется спектром поглощения (полосатый спектр) Данный метод давно известен, в недалеком прошлом очень широко применялся в практике, Однако, в настоящее время, метод микроспектроскопии применяется гораздо реже. Это связано с отсутствием в лабораториях микроспектральных насадок и ряда необходимых реагентов.
В настоящее время наиболее широко в нашей стране применяется метод тонкослойной хроматографии на силуфоле или хроматографической бумаге. Данный метод имеет ряд модификаций: восходящая хроматография [29], непосредственная радиарная микрохроматография [30]. Для повышения чувствительности и разрешающей способности анализа, ряд исследователей рекомендуют использование экспрессного метода горизонтальной хроматографии [96].
Предложенная ими модификация горизонтальной хроматографии значительно повышает чувствительность метода, что позволяет применять его при исследовании кровяных следов крайне малой величины. А.З. Павлова, совместно с Л.Т. Тишиповой (1984), для выявления наличия крови, предложили применять новый, трехкомпоиентныи хромоген, в состав которого входит амидопирин, дифениламин, 5,6-диметилбензимидазол, а также азопирам [49]. По чувствительности оба хромогена не уступают бензидину и достаточно специфичны.
В последнее десятилетие в практику были внедрены некоторые тест-системы, применяемые в практической медицине, например, проба на скрытую кровь в кале с помощью тест-системы «КРИПТО-ГЕМ» [25J. Применение данного теста, упростило работу по выявлению крови в изучаемых экспертом следах, так как «КРИПТО-ГЕМ» оказался чрезвычайно чувствительным тестом, и при его использовании для исследования, требовалось микроскопическое количество материала. К сожалению, использование этой методики в настоящее время, чрезвычайно ограничено в связи с прекращением поставок в Россию тест - системы «КРИПТО-ГЕМ».
Учитывая, что использование в судебной биологии различных тестов, разработанных для клинических лабораторий, очень хорошо себя зарекомендовало, в- последнее время, была предпринята попытка провести испытание диагностических полосок «ГЕМОФАН» фирмы «Лахема» (Чешская Республика), предназначенных для определения присутствия крови в моче. Результаты проведенного исследования показали, что использование тест-полосок «ГЕМОФАН» для установления наличия крови на вещественных доказательствах, является очень эффективной, строго специфичной и высокочувствительной методикой, значительно повышающей экспертные возможности при поисках крови [26].
Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей
Нами изучено 50 образцов крови от живых лиц, с заведомо известными фенотипами гаптоглобина (по двадцать образцов фенотипа 2-1 и 2-2, и десять образцов фенотипа 1-1), которые наносили на следующие предметы-носители: бумага, хлопчатобумажная, шерстяная и смесовая ткань. Образцы высушивали при комнатной температуре, и исследовали с целью определения фенотипов гаптоглобина в неизмененном виде (см. фото 2). Полученные результаты представлены в таблице № 3.
Затем носители с пятнами крови помещали на открытую солнечную площадку в жаркий летний период при температуре +25 - +30 градусов по Цельсию, на весь световой день. Вечером каждого дня из каждого из пятен крови вырезали кусочек ткани (сектор от центра пятна к периферии) размером 1,5x1см, который измельчали ножницами, заливали 15% раствором сахарозы на электродном буфере с добавлением 5 капель 1% раствора трипсина. На следующий день во всех образцах определяли фенотип гаптоглобина.
Результаты исследования, полученные после одного дня пребывания образцов под воздействием прямых солнечных лучей, представлены на фото 3 и в таблице № 4.
Результаты исследования, полученные после трех дней пребывания образцов под воздействием прямых солнечных лучей, представлены на фото 5 и в таблице № 6.
Результаты исследования, полученные после четырех дней пребывания образцов под воздействием прямых солнечных лучей, представлены на фото бив таблице № 7.
После четырех дней нахождения на открытой солнечной площадке в цвет пятен крови на носителях изменился до коричневато-сероватого.
На следующий день проводилось исследование контрольных образцов. Результаты представлены на фото 7 и в таблице № 8.
Во всех образцах контрольной группы фенотип гаптоглобина определялся беспрепятственно.
Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах-носителях, хранившихся во влажном состоянии
При проведении исследования было изучено 50 образцов крови от живых лиц, с заведомо известными фенотипами гаптоглобина (по двадцать образцов фенотипа 2-1 и 2-2, и десять образцов фенотипа 1-1), которые наносили на следующие предметы-носители: бумага, хлопчатобумажная, шерстяная и смесовая ткань. Образцы высушивали при комнатной температуре, и исследовали с целью определения фенотипов гаптоглобина в неизмененном виде. Полученные результаты представлены на фото 8 и в таблице № 9. Фото 8.
Затем пятна крови помещали в чашки Петри, слегка смачивали проточной водой и оставляли для хранения в прохладном помещении (температура от +15 до +20 градусов). Через определенные промежутки времени образцы извлекали, от каждого пятна крови отрезали кусочек ткани, расположенный сектором от центра к периферии размером 1x1,5см, и исследовали с целью определения фенотипа гаптоглобина.
Результаты исследования, полученные после пребывания исследуемых образцов во влажных камерах в течение одной недели представлены на фото 9 и в таблице № 10.
В конце второй недели исследования практически на всех исследуемых образцах появились участки, покрытые плесенью. Цвет части пятен изменился с яркого красно-бурого цвета на зеленовато-буроватый. Для проведения следования из пятен брались участки, свободные от наложений плесени, имеющие наиболее выраженный красно-бурый цвет.
Результаты исследования, полученные после пребывания исследуемых образцов во влажных камерах в течение двух недель представлены на фото 10 и в таблице 11.
Результаты исследования, полученные в середине третьей недели исследования (19-ый день) после пребывания исследуемых образцов во влажных камерах представлены на фото 11 и в таблице № 12.
Результаты исследования, полученные в начале четвертой неделе исследования (22-ый день) после пребывания исследуемых образцов во влажных камерах представлены на фото 12, и в таблице № 13.
Результаты исследования, полученные в конце четвертой неделе исследования (26-ый день) после пребывания исследуемых образцов во влажных камерах представлены на фото 13 и в таблице № 14.
На следующий день было проведено исследование контрольной группы образцов. Результаты исследования представлены на фото 14 и в таблице № 15. Во всех образцах контрольной группы фракции гаптоглобина определяются беспрепятственно.
Исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови, на предметах-носителях, хранившихся в земле
На следующем этапе исследования оценили воздействие, которое оказывает хранение предметов-носителей с пятнами крови в земле на возможность определения фенотипов гаптоглобина в следах крови. Были изучены 50 образцов крови от живых лиц, с заведомо известными фенотипами гаптоглобина (по двадцать образцов фенотипа 2-1 и 2-2 и десять образцов фенотипа 1-1), которые наносили на следующие предметы-носители: бумага, хлопчатобумажная, шерстяная и смесовая ткань. Образцы высушивали при комнатной температуре, и исследовали с целью определения фенотипов гаптоглобина в неизмененном виде. Полученные результаты представлены на фото 15 и в таблице № 16.
Затем исследуемые образцы помещали в почву (чернозем, так как именно этот вид почвы наиболее распространен на территории Новосибирской области), на глубину около 20см, и оставляли в темном прохладном помещении (температура от +10 до +15 градусов). Первое исследование проводили через две недели, затем через четыре недели от начала исследования. Полученные фореграммы практически не отличилась от первоначальных, лишь несколько снизилась интенсивность фракций.
Через шесть недель от начала работы также была проведена диагностика фенотипов гаптоглобина. Результаты, полученные в ходе исследования, представлены на фото 16 и в таблице 17.
Через девять недель (начало третьего месяца исследования) от начала работы также была проведена диагностика фенотипов гаптоглобина. Результаты, полученные в ходе исследования, представлены на фото 17 и в таблице 18.
В дальнейшем исследование проводили в конце 12-ой недели (через три месяца) от начала исследования. Полученные результаты представлены на фото 18 и в таблице 19.
Результаты, полученные в середине четвертого месяца исследования (16-я неделя), представлены на фото 19 и в таблице 20.
Результаты, полученные на 20-ой неделе исследования (середина пятого месяца исследования) представлены на фото 21 и в таблице 22.
На следующий день было проведено исследование контрольной группы образцов. Результаты представлены на фото 22 и в таблице № 23. Фото 22.
