Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
Глава 2. Материал и методы исследования 28
Глава 2.1. Характеристика материала, этапов и методов исследования 28
Глава 2.2. Обоснование выбора объекта исследования и методика его изучения 29
Глава 2.3. Методика забора материала и изучение объекта исследования 31
Глава 2.4, Методы обработки результатов исследования 37
Глава 3. Динамика оптической плотности стекловидного тела в постмортальном периоде 41
Глава 3.1. Изучение динамики изменения оптической плотности стекловидного тела в посмертном периоде 41
Глава 3.2. Сравнительный анализ влияния условия хранения образца на величину его оптической плотности 47
Глава 3.3. Сравнение величин оптической плотности стекловидного тела 1-й и 7-й день посмертного периода между собой 54
Глава 3.4. Определение давности наступления смерти по оптической плотности 56
Глава 3.5. Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн 57
Глава 4 Изучение влияния на изучаемые величины различных внешних и внутренних факторов 67
Глава 4.1. Сравнение величин оптической плотности стекловидного тела 67
Глава 4.1.1. Сравнение оптической плотности при различных вариантах хранения на I день 67
Глава 4.1.2. Сравнение оптической плотности при различных вариантах хранения на 7 день 71
4.2. Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн (индивидуальные особенности глаз по расчетным методам - предложенная логарифмическая модель) 75
Глава 4.3. Сравнение величин оптической плотности по половому признаку 79
Глава 4.4. Зависимость оптической плотности стекловидного тела от возраста 89
Глава 4.5. Сравнение величин оптической плотности при насильственной и ненасильственной смерти 93
Глава 4.6. Зависимость оптической плотности от концентрации алкоголя в крови 104
Глава 5. Проверка погрешности метода при проведении судебно-медицинских экспертиз 113
Заключение 130
Выводы 134
Практические рекомендации 135
Список литературы 137
Приложение №1 161
Приложение №2 162
Приложен не №3 177
Приложение №4 189
Приложение №5 200
Приложение №6 207
- Методика забора материала и изучение объекта исследования
- Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн
- Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн (индивидуальные особенности глаз по расчетным методам - предложенная логарифмическая модель)
- Зависимость оптической плотности от концентрации алкоголя в крови
Методика забора материала и изучение объекта исследования
Глазное яблоко извлекалось путем захвата и вытягивания с одновременным рассечением окружающих его структур. Данная методика была предложена А. Грефе (цит. Одинцова В.П., 1933; Гундорова Р.А, 1975) для энуклеации глазного яблока. Проводили круговой разрез конъюнктивы у лимба. Конъюнктиву и тенонову капсулу полностью отсепаровывали от склеры. Ножницами отсекали сначала прямые мышцы глаза у мест их прикрепления, затем - косые. Глазное яблоко фиксировали зажимом (пинцетом) за культю одной из прямых мышц и подтягивали кпереди. Ножницами, заведенными за глазное яблоко, пересекали зрительный нерв и извлекали глазное яблоко. Затем глазное яблоко помещали в стерильный пластиковый кон-тейне]Изъятые образцы были разделены на три группы, хранение которых осуществлялось при различных температурных режимах:
I группа — при температуре 0-10С (средняя температура 4-6С). Условное обозначение «холод».
II группа — при температуре от 11 до 20С (средняя -15-18С). Условное обозначение «норма».
III группа — при температуре от 21 до 30 С (средняя - 25-27С0).
Условное обозначение «тепло».
Относительная влажность, при которой хранились образцы, во всех случаях составляла 48-55%.
Исследование стекловидного тела проводилось каждые сутки. Его получали путем пункции глазного яблока. Пункцию осуществляли стерильным медицинским шприцем с иглой для внутримышечных инъекций. Вкол иглой производили через роговицу отступя от радужной оболочки на 0,2 см. Следует соблюдать определенное направление иглы -несколько кзади и к центру глаза, глубина проникновения не должна превышать 8-12 мм. После того как игла оказывалась в полости со стекловидным телом, его аспирировали в объеме 0,3 мл. Затем стекловидное тело помещали в стандартную заводскую кварцевую кювету за № 1,040 и исследовали на фото колориметре КФК - 3 при длинах волн от 315 до 555 нм с интервалом 10 нм.
Измерение оптической плотности стекловидного тела осуществлялось начиная с 1-х суток, согласно графику с фиксацией результатов в карте учета наблюдений, через 24 часа в течение 5-7 суток. Оптическую плотность оценивали по отношению к изотоническому раствору NaCI 0,9%. Учитывая количество объектов и диапазонов длин волн всего было сделано 9000 измерений оптической плотности стекловидного тела.
Используемый фото колориметр КФК - 3 позволяет проводить анализ как окрашенных, так и бесцветных соединений по избирательному поглощению монохроматического излучения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (Васильев В.П., 1979; Драго Р., 1981; Бобков Ю.Г. с соавт., 1987; Алесковский В.Б., 1988). Связано это с различными электронными переходами в поглощающих молекулах и ионах (электронные спектры), в инфракрасной области она связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества (колебательные спектры). Распространенная в настоящее время аппаратура позволяет измерять ультрафиолетовые спектры в области от 190 до 380 нм, видимые от 380 до 780 нм, инфракрасные спектры - от 780 до 40000 нм. В инфракрасном спектре исследования не проводились, т.к. применение инфракрасных спектров применяют для исследования строения веществ (Ремизов А.Н., 1987;ЛипуновИ.Н., ГуревичЛ.И., 1990).
Основными частями этого прибора является: источник излучения (лампа накаливания для видимой области, газоразрядная водородная или дейтериева лампа ультрафиолетовой области), монохроматор, диспирги-рующая система которого, основана на использовании кварцевой призмы или дифракционной решетки, кюветное отделение, в котором располагаются кюветы с исследуемыми веществами, приемное и фотометрическое устройство для сравнительной оценки интенсивности световых потоков, основанное на использовании фотоэлементов.
В процессе измерения на пути выходящего из монохроматора пучка излучения определенной длины волны поочередно устанавливают нулевой раствор (0,9% р-р NaCi), для которого пропускная способность равна 0. Для снижения величины ошибки толщина слоя должна быть минимальная, для этого использовалась стандартная наименьшая заводская кварцевая кювета 1,040, толщина слоя которой 10мм. Относительная ошибка индивидуальных фотометрических соединений обычно не превышает 2%.
Наиболее распространенными схемами для разведенных жидкостей являются:
1.схема прямого действия с одним фотоэлементом, предусматривающая измерение оптической плотности по силе фототока, регистрируемой гальванометром.
2. дифференциальная схема с двумя фотоэлементами, рассчитанная на попадание пучков света, проходящих соответственно через испытуемый и нулевой растворы, на два разных фотоэлемента. Фототоки уравнивают с помощью потенциометра (электрическая компенсация) или диафрагмы, уменьшающей интенсивность одного из световых пучков (оптическая компенсация).
По шкале потенциометра или диафрагмы отсчитывают оптическую плотность в момент равенства фототоков, когда стрелка регистрирующего гальванометра находится на нуле.
В нашем случае стекловидное тело не разбавлялось и исследовалось в 100% концентрации.
Для повышения точности фотометрических измерений высоких концентраций веществ (10-100%) используется дифференциальный метод. Сущность метода заключатся в измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, это приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной ошибки анализа до 0,5-1%.
Оптимальными условиями анализа является построение калибровочных графиков. Для анализа готовили раствор сравнения с известным количеством испытуемого вещества и при помощи двух кювет, заполненных раствором сравнения, устанавливали на нуль шкалу оптической плотности прибора. Затем одну из кювет заполняли анализируемым раствором и измеряли оптическую плотность по отношению к раствору сравнения. Интенсивность светового потока на фотоколориметре регулируют световым клином.
Интенсивность света, распространяющегося в среде, может уменьшаться из-за поглощения и рассеяния его молекулами (атомами) вещества. Натуральный показатель поглощения зависит от длины волны света.
Фотометрические методы разработаны на основе закона Бугера-Ламберта-Бера. В этих методах непосредственно измеряют световые потоки, прошедшие через раствор, коэффициент пропускания или оптическую плотность.
Таким образом, поглощающая способность любого раствора может быть охарактеризована значением К. Коэффициент погашения К зависит от природы растворенного вещества и длины волны падающего света. Следовательно, первый закон поглощения справедлив только для монохроматического света, т.е. для света определенной длины волны.
Из закона Бугера - Ламберта следует, что:
А) отношение светового потока, прошедшего через слой раствора, к интенсивности падающего светового потока не зависит от абсолютной интенсивности светового потока;
Б) если толщина слоя раствора увеличивается в арифметической прогрессии, интенсивность светового потока, прошедшего через него, уменьшается в геометрической прогрессии.
Закон Бера. Второй закон светопоглощения был установлен в 1852 году. Изучая поглощение света растворами, Бер установил, что коэффициент погашения К пропорционален концентрациям поглощающего вещества, т.е. К = ЕхС, (2.3.4) где Е - коэффициент, не зависящий от концентрации; С - концентрация вещества.
Если концентрация С выражена в г моль/л, а толщина поглощенного слоя 1 - в см, то коэффициент Е называют полярным коэффициентом погашения. Он представляет собой постоянную величину, зависящую от длины волны падающего света, природы растворенного вещества, природы растворителя, температуры раствора и соответствует погашению молярного раствора анализируемого вещества.
Закон Бера рассматривает изменение поглощения светового потока слоем постоянной толщины при изменении концентрации, а закон Бу-гера - Ламберта - изменение поглощения светового потока раствором постоянной концентрации при изменении толщины при изменении толщины поглощающего слоя.
Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн
Коэффициент В - это начальное значение оптической плотности стекловидного тела до гнилостных изменений. Что бы выяснить это индивидуальный показатель или он общий для всех исследуемых случаев, сравнение проводилось по критерию Ньюмена-Кейлса (таблицах 3.5.1 -3.5.3).
Вычисленный критерий q сравнивается со значением из таблицы Harter H.L. (Гланц С, 1999), значение которого зависит от уровня значимости Л степени свободы v и интервала сравнения I определяемых, соответственно, по формулам.
Различий нет, следовательно, оптическая плотность стекловидного тела непосредственно после смерти (т.е. до начала гнилостных изменений) одинакова на всех длинах волн у каждого индивидуума.
Погрешность определения ДНС предлагаемым способом произведена на основе данных, изложенных в приложении №5. Как следует из представленных таблиц, в некоторых случаях, величина ошибки средней арифметической сопоставима по величине со значением собственно средней, что свидетельствует о малой достоверности определенного значения оптической плотности стекловидного тела. В таблицах данные строки выделены жирным шрифтом. Практически во всех наблюдениях, большие разбросы значений (ошибка средней) отмечена на длине волны 315 нм, в связи с чем, считаем нежелательным применение ее в диагностических целях из-за высокой погрешности получаемого результата.
Задавшись установлением величины ошибки определения ДНС, примем в качестве исходной величины значение ошибки средней арифметической величины (т) оптической плотности стекловидного тела глаза на различных частотах в соответствии с условиями хранения исходного образца.
Для этого произведем подстановку m в формулу 3.5 в соответствии со значением величин А и В.
Полученные значения максимальной ошибки определения ДНС представлены в таблицах 3.5.4-3.5.6 соответственно условиям хранения образца. Ошибка ОДНС представлена в сутках.
Вычисленные значения ошибки ОДНС рекомендуется учитывать при расчете следующим образом:
Пример: При исследовании величины оптической плотности стекловидного тела глаза на аппарате (КФК-3) установлено значение 0,203 на длине волны 505 нм. Образец до начала исследования пребывал при комнатных условиях хранения. По формуле 3.5 произведен расчет ДНС при рекомендованных для комнатной температуры значениях констант А и В 0.197 и 0.030 соответственно (табл. 5.8 и приложение №3).
Расчетное значение ДНС 2,4 сут. Погрешность определения ДНС из таблицы 5.8 равна (2-й день+3-й день)/2=(1,13+1,16)/2=1,14 сут. Таким образом, искомая ДНС равна 2,4±1,14 сут.
В стекловидном теле изъятых глазных яблок осуществлялось измерение величины оптической плотности на фотоколориметре КФК - 3. Исследования проводились на волновом диапазоне: 315 нм, 325 нм, 335 нм, 345 нм, 355 нм, 365 нм, 375 нм, 385 нм, 395 нм, 405 нм, 415 нм, 425 нм, 435 нм, 445 нм, 455 нм, 465 нм, 475 нм, 485 нм, 495 нм, 505 нм, 515 нм, 525 нм, 535 нм, 545 нм, 555 нм. Глазные яблоки хранили в различных температурных режимах.
При проведенном исследовании подтверждена зависимость величины оптической плотности стекловидного тела от времени наступления смерти - по мере увеличения последнего величина оптической плотности достоверно повышалась по логарифмическому закону. Данное наблюдение получило статистическое подтверждение при множественном сравнении с использованием критерия Ньюмена-Кейлса. Сравнение проводилось для каждой величины оптической плотности на каждой длине волны для всех случаев, составляющих группу. Во всех трех исследуемых группах с различными вариантами хранения материала было обнаружено достоверное отличие (рг95) величин оптической плотности при разных длинах волн, что позволяет рассматривать каждую длину волны в качестве самостоятельной при проведении исследования.
Одним ю основных исследуемых параметров было определение особенностей распределения величины оптической плотности в динамике посмертного периода. Для этого нами также было проведено множественное сравнение по критерию Ньюмена-Кейлса. Полученные результаты свидетельствуют о достоверных различиях, как между ближайшими, так и между отстоящими друг от друга парами значений. Это расценивалось нами, как свидетельство инертности признака, требующего определенные промежутки времени (24 часа) для образования достоверных интервалов между измерениями.
Оценивая динамику изменения величины оптической плотности стекловидного тела при хранении глазных яблок в холоде, в тепле и при нормальной температуре, можно отметить последовательное увеличение показателя величины оптической плотности стекловидного тела на всех исследуемых длинах волн. Это связано с тем, что стекловидное тело в процессе гниения претерпевает ряд изменений своей структуры: изменяется рН среда, уменьшается его вязкость, изменяется состав вещества со временем. Эти изменения доказаны с точки зрения физики, в главе 2 освещено ряд факторов, которые влияют на изменение оптической плотности.
В приложении № 5 представлены средние значения оптической плотности, соотнесенные с ошибкой средней арифметической для каждого дня исследования и варианта температурного хранения образца.
Как следует из представленных таблиц, в некоторых случаях, величина ошибки средней арифметической сопоставима по величине со значением собственно средней, что свидетельствует о малой достоверности определенного значения оптической плотности стекловидного тела. В таблицах данные строки выделены жирным шрифтом. Практически во всех наблюдениях, большие разбросы значений (ошибка средней) отмечена на длине волны 315 нм, в связи с чем, считаем нежелательным применение ее в диагностических целях из-за высокой погрешности получаемого результата. При определении ДНС рекомендуемым методом, наименьшая погрешность была получена, с учетом хранения образцов, на следующих длинах волн «холод»: 1 сутки - 405 нм, 415 нм, 2-4 сутки - 415 нм, 5-7 сутки - 405 нм, 415 нм; «норма»: сі по 7 сутки - 405 нм; «тепло»: с 1 по 5 сутки - 405 нм, 6 и 7 сутки - 435 нм,445 нм, 455 нм, 465 нм, 475 нм. 485 нм, 495 нм, 505 нм, 515 нм.
Сравнение величин коэффициента В на разных длинах волн (индивидуальные особенности глаз по расчетным методам - предложенная логарифмическая модель)
Как было отмечено ранее (Глава 3), коэффициент В отражает индивидуальные особенности оптической плотности стекловидного тела.
Предположив факт существования отличий его значения для различных длин волн, произведен сравнительный анализ средних его величин по критерию Ньюмена-Кейлса (Таблицы 4.2.1-4.2.3).
Вычисленный критерий q сравнивается со значением из таблицы Harter H.L. (Гланц С, 1999), значение которого зависит от уровня значимости Р, степени свободы v и интервала сравнения / определяемых, соответственно, по формулам:
v = N-m; и l = j-i + I
где N— сумма численностей всех групп; т — число групп;
j и J — места в упорядоченном ряду значений х
При Р 95, v - 29x25-25=700, / = 3, критическое значение равно 2,772.
Во всех исследованных случаях, наличие значимых достоверных отличий не установлено, следовательно, оптическая плотность стекловидного тела непосредственно после смерти (т.е. до начала гнилостных изменений) одинакова на всех длинах волн.
Зависимость оптической плотности от концентрации алкоголя в крови
Ранее проведенные исследования стекловидного тела, не учитывали наличие алкоголя в крови. В задачу нашего исследования входило изучить влияние данного фактора. Оценка проводилась линейной корреляцией Пирсона. Изучалась только на 1-й день, т.к. при наличии различий. таковые будут и на другие сутки исследований.
Результаты исследования для условий хранения образца «норма» представлены в таблице 4.6.1.
Аналогично произведено таковое же исследование для условий хранения образца «тепло», что представлено в таблице 4.6.2.
Установление наличия корреляционной зависимости для условий хранения образца «холод», представлено в таблице 4.6.3.
Во всех исследованных случаях корреляционных зависимостей не выявлено, что подтверждается малой величиной коэффициента корреляции Пирсона и большим значением величины его ошибки.
Т.е. оптическая плотность от концентрации алкоголя в крови не зависит.
Предположив наличие зависимости темпа изменения оптической плотности стекловидного тела с течением времени от величины алко-гольэмии, произведен расчет линейной корреляции Пирсона между значением коэффицента А и концентрацией алкоголя в крови трупа (Таблицы 4.6.4-4.6.6).
Результаты такового исследования для варианта хранения «норма« представлены в таблице 4.6.4.
Результаты исследования для варианта хранения «тепло« представлены в таблице 4.6.5.
Результаты исследования для варианта хранения «норма« представлены в таблице 4.6.6.
Во всех исследованных случаях зависимостей темпа изменения оптической плотности от концентрации алкоголя в крови не выявлено, что подтверждается малым значением коэффициента корреляции Пирсона при значительной величине его ошибки.
Наряду с выявлением внутри групповых особенностей динамики временных рядов, для нас представляло интерес и их межгрупповое сравнение. Все исследованные случаи, помимо изначального распределения на группы с различными температурными режимами, были последовательно распределены по категориям смерти (насильственная и ненасильственная смерть), содержание алкоголя в крови (с наличием и отсутствием этилового спирта), пол (женский и мужской), возраст.
При исследовании, зависимости величин оптической плотности от категории смерти не выявлено. Следовательно, данный фактор при определении давности наступления смерти учитывать не нужно.
Зависимость оптической плотности от возраста и концентрации алкоголя в крови оценивалась линейной корреляцией Пирсона. При исследовании таковых зависимостей не установлено, следовательно, оптическая плотность и темп ее изменения от возраста и концентрации алкоголя в крови не зависит.
При сравнении величин оптической плотности по половому признаку по критерию Стьюдента, различий не обнаружено, т.е. оптическая плотность у мужчин и женщин не отличается, следовательно, половой признак не влияет на величину оптической плотности стекловидного тела при установлении давности наступления смерти.
