Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
Процесс адаптации к пониженным температурам, гипоксии и в высокогорье. Роль мембранных и мессенджерных механизмов в организации приспособления...14
1.1. Общий адаптационный синдром и системные уровни адаптационного процесса 14
1.2. Мембранные и молекулярные компоненты адаптационного процесса 18
1.3. Характеристика фосфоинозитидной системы вторичных мес-сенджеров и ее вероятная роль в организации приспособительного процесса 28
1.3.1. Механизм мессенджерного опосредования эффекторного ответа клетки... .28
1.3.2. Ключевые элементы фосфоинозитидного мессенджерного каскада ... 34
1.3.3. Универсальность и обратные связи в системах вторичных мессенджеров. 45
1.3.4. Внешние факторы и фосфоинозитидный ответ. 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 56
2.1. План исследования 56
2.2. Метод выделения и определения фосфоинозитидов и ди~ ацилглицерола , 57
2.3. Метод разделения инозитолфосфатов 59
2.4. Определение жирнокислотной композиции фосфоинозитидов с использованием газожидкостной хроматографии 59
2.5. Методика воспроизведения нагрузки норадреналином 60
2.6. Определение физической работоспособности, высотоустойчивости и ориентировочной активности 60
ГЛАВА 3. Адаптационные изменения в фосфоинозитидной системе вторичных мессенджеров у крыс (результаты собственных исследований) 62
3.1. Изменения в фосфоинозитидной системе при острой баро-камерной гипоксии 62
3.2. Фосфоинозитидный ответ при адаптации крыс к пониженной температуре и барокамерной гипоксии 70
3.3. Влияние норадреналина на уровни фосфоинозитидов и диацилглицерола .. 81
3.4. Экспериментальная блокада фосфоинозитидной системы вторичных мессенджеров ионами лития при адаптации в высокогорье. 84
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных данных 91
Выводы.. 103
Литература
- Мембранные и молекулярные компоненты адаптационного процесса
- Ключевые элементы фосфоинозитидного мессенджерного каскада
- Метод разделения инозитолфосфатов
- Фосфоинозитидный ответ при адаптации крыс к пониженной температуре и барокамерной гипоксии
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема приспособления организма к экстремальным условиям среды приобретает все более важ-ное значение в связи с тем, что социальные и экономические потребности современного общества понуждают человека к освоению новых регионов обитания и деятельности (космос и глубины океана, Арктика и Антарктика, пустыни и высокогорье). Новая среда обитания предъявляет высокие требования к организму человека и животных, вызывая в нем глубокие функциональные, структурные, метаболические и энергетические сдвиги, вплоть до появления специфических форм патологии (Данияров СБ., 1979; МиррахимовМ.М., 1984 и многие другие).
Основным явлением, которое сопровождает человека и животных при подъеме в горы, является гипоксия, так как по мере увеличения высоты подъема, в атмосфере уменьшается парциальное давление жизненно необходимого газа - кислорода. С проблемой кислородной недостаточности организм сталкивается ив привычных для него условиях обитания: при тяжелых физических нагрузках, инфекционных болезнях, отравлении, радиационном поражении и т.д.. Поэтому познание сущности приспособления организма в высокогорье самым тесным образом смыкается с интересами повседневной практики.
Вторым не менее важным аспектом, выделяющим высокогорье из ряда других экстремальных условий среды, является сочетание многих неблагоприятных факторов действующих на адаптирующийся в горах организм. В него входят, помимо гипоксии, низкие температуры, высокие уровни радиации, УФ-излучения,
гидроаэроионизации и др., что вносит чрезвычайную сложность в формирование приспособления, в его познание и, естественно, в разработку действенных основ управления адаптацией.
За прошедшие три десятилетия формирование процесса адаптации в высокогорье достаточно глубоко изучено на уровне целостного организма и его физиологических систем (Френкель Г.Л., 1961; Турусбеков Б.Т., 1970; Алымкулов Д.А., 1971; За-рифьянА.Г., 1974; Тилис А.Ю. 1976; Алиев М.А. 1973; Кады-ралиев А.К., 1978; Данияров СБ., 1979; Закиров Д.З., 1979; Айдаралиев А.А., 1982; Исабаева В.А., 1983; Миррахимов М.М., 1984; Яковлев В.М.", 1988; Захаров Г.А., 1991; Нарбеков O.K., Шидаков Ю.М., 1991 и другие). В различные периоды адаптации и на различных высотах вскрыты закономерности нейро-эндокринной интеграции адаптационных сдвигов в физиологических системах, газотранспортного обеспечения, гемодинамики, микроциркуляции и окислительно-восстановительных процессов в тканях.
Были разработаны фундаментальные представления об адек-затных требованиям гипоксической среды изменениях в архитектонике тканей и клеточных структур, об адаптивной модификации путей метаболизма и биоэнергетики (Скулачев В.П., 1972; Мак Мюрей, 1980; Де Дюв К., 1983; Чотоев Ж.А., 1992).
К настоящему времени стало ясно, что проблема приспособления и поддержания жизни в сложных эко-социальных и геофизических условиях высокогорной среды требует изучения не только эволюционных, генетических, системных и межсистемных связей, но и исследования недостаточно разработанных субклеточных, мембранных и молекулярных основ адаптации.
В частности, показано, что молекулярные изменения струк-
туры мембран, активности их белково-ферментных комплексов, лк пид-белковые взаимодействия в бислое зачастую определяют регуляционные, энергетические, а следовательно и приспособительные возможности клетки, ткани, органа и организма в цело*/. (Сим Э., 1985; Мусил Я., 1985; Болдырев А.А., 1990).
Было установлено, что приспособление и простейшего и многоклеточного организмов к воздействию физического фактора на уровне клеточных и субклеточных мембран сводится к специфической модификации структуры и функций макромолекул, при
которой жизненные процессы в данных условиях протекали бы удовлетворительно (Саркисов Д.С, 1975; Крепе Е.М., 1981).
Но "биохимическая стратегия" адаптации, не говоря уже молекулярных основах приспособления, в высокогорье, где названные физические факторы среды действуют на организм в слож-. ном комплексе и часто сопровождаются и положительными и отрицательными эффектами перекрестной адаптации, до сих пор остается слабо разработанным аспектом проблемы. Адаптационные модификации структуры и активности мембранных липидов и белков в условиях высокогорья, только начинают изучаться.
В ряде последних работ по субклеточным и молекулярным основам адаптации в высокогорье показано, что в плазматических, эритроцитарных, микросомальных и митохондриальных мембранах происходят глубокие приспособительные изменения структуры липидного бислоя, конформации белков, содержания и молекулярного состава фосфолипидов (Яковлев В.М. с соавт., 1990; 1992; 1993; 1994; Погорелова Т.Н. с соавт., 1990; Терновой В.А. с соавт., 1989; 1990).
Однако, при адаптации в высокогорье отсутствует ин-
8 формация по фосфоинозитидному ответу клетки, который стал предметом интенсивного изучения в последнее десятилетие (Dawnes СР. et al., 1982; Berridge M.J., 1983; Irvin R.F. et al., 1984; Nishizuka Y., 1988; Lundberg G.A., 1989). Благодаря этим исследованиям стало ясным, что сущность тканевой адаптации и молекулярно-метаболические последовательности приспособительного процесса не могут быть раскрыты без изучения роли фосфоинозитидной системы вторичных мессендже-ров, поскольку она, наряду с аденилатциклазной системой, организует эффекторный ответ клетки (Берридж М.Д., 1985). Именно фосфоинозитиды и их производные ответственны за хранение информации, обеспечивают длительную потенциацию, активируют протеинкиназы, через которые меняют активность множества клеточных белков, наконец, они непосредственно регулируют процессы репликации, транскрипции и трансляции (Parker P.J. et al., 1989; Романчиков Ю.М., 1991). Небезинтересно и то, чтс фосфоинозитиды меняют свою активность в зависимости от изменений липидного состава мембраны (Miles G.M.M. et al., 1989)г что немаловажно для высокогорья, где этот состав, как отмечено выше , меняется (Яковлев В.М. с соавт., 1994).
Изменение характера фосфоинозитидного мессенджерного ответа, полученное при изолированном воздействии гипоксии на животных (Fakashi Т. et al., 1989; Huang Н.М. et al., 1989) позволяет предположить, что и в высокогорье ему будут присущи иные характеристики, очевидно влияющие на формирование приспособления. Чтобы разобраться в этом вопросе, мы исследовали особенности изменения спектра фосфоинозитидов при изолированном воздействии пониженной температуры и барокамер-
9 ной гипоксии в группах экспериментальных животных, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода, и затем в высокогорье, где эти факторы действуют комплексно. Для лучшего понимания роли фосфоинозитидного ответа в организации приспособления к комплексу факторов высокогорья мы применили его блокаду, используя ионы лития, к которым чувствительны ферменты фосфоинозитидного цикла (Маоems P.W. et al., 1986). С этой же целью изучения особенностей фосфоинозитидного ответа при воздействии факторов высокогорья, мы исследовали состояние фосфоинозитидной мессенджерной системы при хронических катехоламиновых нагрузках. Такую модель эксперимента мы выбрали по двум причинам: во-первых, потому, что в условиях высокогорья меняется гормональный фон в организме (ДанияровСБ., 1979; Закиров Дж.З., 1979), во-вторых - все эффекты катехоламинов опосредуются фосфоинозитидной мессенджерной системой (Кухарь В.П. с соавт., 1991).
Таким образом, факторы внешней среды, вызывают в многоклеточном организме сложную гамму нейрогуморальных сигналов, координирующих приспособительное взаимодействие физиологических систем, органов, тканей и отдельных клеток. В клетках восприятие внешних сигналов, их трансмембранное проведение, преобразование и реализация в форме адаптивных биохимических реакций является функцией трансдуцирующих сигнальных систем, в том числе фосфоинозитидной.
Очевидно, что процесс приспособления к недостатку кислорода и другим климато-геофизическим факторам высокогорья (холод, высокий уровень УФ-излучения, резкие перепады су-очных температур и другие), сопровождается дополнительны-
10 ми потоками информации, что связано с новыми требованиями к мессенджерам второго порядка - малоизученной области современной биологии. Представляется закономерным образование функциональных перестроек в фосфоинозитидной системе вторичных мессенджеров при действии внешних агентов. Выяснение деталей и метаболических последствий этих изменений предваряет создание эфективных методов коррекции приспособления на участке проведения сигналов в клетку.
Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института физиологии и экспериментальной патологии высокогорья Национальной Академии Кыргызской Республики и составляет часть общей программы "Изучение структурной и молекулярной организации клеточных мембран при адаптации к комплексу факторов высокогорья"^ Госрегистрации - 01890007783.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цель работы - изучить характер изменений в фосфоинозитидной системе вторичных мессенджеров в процессе приспособления организма к пониженной температуре, барокамерной гипо ксии и в высокогорье.
В ходе исследования решались следующие задачи:
1. Определить особенности изменений фосфоинозитидов, к жирнокислотной композиции, инозитолфосфатов и диацилглицерод в ткани мозга и печени крыс при адаптации животных к понижеі ной температуре (+3С X 30 суток), острой гипоксии (подьем барокамере на "высоту" 6000 м. X 6 часов) и хронической гипо
сии (6000 м. над у.м.Х б часов/сутки X 30 дней)
Оценить физиологические и биохимические последствия экспериментальной блокады фосфоинозитидной системы (хлористым литием), в условиях низкогорья (760 м. над у. м.) и высокогорья (3200 м. над у.м.).
Изучить динамику фосфоинозитидного ответа при длительном введении норадреналина (14 дней с суммарной дозой 35 мг/кг
Установить, имеются ли различия в приспособительной перестройке фосфоинозитидной мессенджерной системы у крыс с индивидуальной резистентностью к гипоксии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
Показано, что острая барокамерная гипоксия (6000 м над м.Х б час.) вызывает в. клеточных мембранах мозга крыс быстрое. 15-й и 30-й минутах экспозиции, снижение уровней всех'мембранну фосфоинозитидных фракций и повышение образования диацилглицерол и следовательно усиление зффекторной модуляции ферментов.
Впервые показано, что барокамерная гипоксия (6000 м над ур м. X б часов/сутки X 30 дней) ведет к устойчивой перестройке структуры фосфоинозитидного ответа в мозге и печени крыс, выражающейся в повышени содержания полифосфоинзитидов (фосфатидил-инозитол-4-фосфата и фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата), причем установлено, что эта структурная модификация более выражена у высокоустойчивых к гипоксии животных, чем у низкоустойчивых.
Установлено, что на протяжении 30 суток акклимации к пен женной температуре (+3С) снижается содержание инозитольных ме-сенджеров, т.е. продемонстрирована прямая зависимость фосфоикс зитидного ответа от температуры среды.
Впервые установлено, что адаптация в высокогорье и ее сочетание с блокадой мессенджерного ответа снижают ориентировочную активность и физическую работоспособность крыс, причем в группе с блокадой, это снижение более значительное, что свидетельствует об участии фосфоинозитидного ответа в формировании приспособления.
Показано, что нагрузка норадреналином, наряду с известными изменениями в миокарде, вызывает в ткани мозга крыс стойкое снижение уровней фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, главного источника вторичных мессенджеров.
Полученные временные и количественные характеристики фосфо-инозитидной мессенджерной системы при изолированном воздействии физических факторов высокогорья,', расширяют имеющиеся в литературе данные как по теории адаптации, так и по клеточным транс-дуцирующим системам. Работа позволяет более глубоко понять мо-лекулярно-метаболические последовательности приспособления.
Фактический данные, в прикладном аспекте, могут быть использованы при выработке оптимальных методов коррекции, приспособления к экстремальным воздействиям. Материал диссертации может быть использован при чтении общих и специальных курсов по физиологии и биохимии в медицинских институтах и университетах.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Процесс адаптации к пониженной темпратуре (+3С), острой и хронической барокамерной гипоксии (6000 м. над У.м.) обеспечивается, помимо общего адаптационного синдрома, модуляцией содержания и жирнокислотного состава компонентов фосфоинозитидной мессенджерной системы, приводящей
к адекватному, для новых условий, эффекторному ответу клетки.
Процесс приспособления к изменившимся условиям среды, вызывает более выраженную структурную модификацию фосфоинози-тидного ответа у крыс с высокой устойчивостью к гипоксии, по сравнению с низкоустойчивыми.
Блокада фосфоинозитидной мессенджерной системы хлористым литием снижает приспособительные возможности организма к воздействию физических факторов высокогорья (3200 м. над у.м.).
АПРОБАЦИЯ И ПУБЛИКАЦИИ.
Материалы исследования были доложены и обсуждены на 2-м Съезде физиологов Туркменистана (Ашхабад., Ылым, 1991); на Международном Симпозиуме "Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма". (Чолпон-Ата, 1993); на 2-й Всероссийской конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза". (Сыктывкар, 1994); на Международной конференции "Гипоксия в медицине". (Москва, 1994).
По основным положениям диссертации опубликовано и принято в печать 9 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.
Диссертация изложена на 131-й странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы.
Работа иллюстрирована 16-ю рисунками, содержит б таблиц. Литературный указатель включает 218 работ, из них 118 иностранные.
Мембранные и молекулярные компоненты адаптационного процесса
При воздействии физических факторов высокогорья (гипоксия, холод, радиация и др.) первые изменения в организме связаны с включением реакций, направленных на сохранение гомеостаза - "реакция тревоги". Эта реакция представляет собой соматическое выражение общего "призыва к оружию" защитных сил организма. Однако эта реакция тревоги явно не исчерпывает весь ответ. В ходе длительного воздействия внешнего повреждающего агента, в рассматриваемом случае - факторов высокогорья, вызывающих эту реакцию, наступает стадия адаптации, или резистентности (Селье Г., 1972).
При экстремальном воздействии физических факторов среды (в том числе, и комплекса факторов высокогорья) организм переходит в третью фазу - "стадия истощения", симтомы которой очень схожи с симтомами реакции тревоги. Все эти стадии имеют название "общего, или генерализованного адаптационного синдрома" (Селье Г., 1972).
Жизнь в горах обычно рассматривается физиологами в аспекте адаптации к гипоксии, поскольку именно недостаток кислорода в воздухе является основным повреждающим агентом (Ага джанян Н.А. с соавт., 1986). Возникающие при этом приспособительные и компенсаторные реакции координирование осуществляются на всех уровнях интеграции организма и лишь условно могут быть рассмотрены раздельно. Важное место среди приспособительных механизмов принадлежит системам транспорта кислорода: дыхательной, сердечно-сосудистой и крови, а также тканевым системам утилизации кислорода (Варбашова З.И., 1970; Данияров С.Б., 1979; Меерсон Ф.З., 1981; Чотоев Ж.А., 1992). Реакции системы дыхания на гипоксию выражаются в увеличении альвеолярной вентиляции за счет углубления и учащения дыхания, мобилизации резервных альвеол. Эти реакции возникают рефлекторно, вследствии раздражения, главным образом, хеморецепторов аортально-каротидной зоны и ствола мозга изменившимся составом крови (Агаджанян Н.А. с соавт., 1977). Увеличение вентиляции сопровождается усилением легочного кровообращения. При повторяющейся или хронической гипоксии в процессе адаптации организма, корреляция между легочной вентиляцией и перфузией может становиться более совершенной. Компенсаторная гипервентиляция может вызвать гипокапнию, которая в свою очередь компенсируется обменом ионов между плазмой и эритроцитами, усиленным выведением бикарбонатов и основных Фосфатов (Сиротинин Н.Н., 1966).
Компенсаторные реакции системы кровообращения выражаются в учащении сердечных сокращений, увеличении массы циркулирующей крови за счет выброса ее из кровяных депо, увеличении венозного притока, минутного объема крови и перераспределит ельными реакциями, обеспечивающими преимущественное кровоснабжение мозга, сердца и других жизненно важных органов. Эти реакции обусловленны рефлекторными влияниями с баро-рецепторов сосудистого русла и общими нейрогуморальными сдвигами, свойственными гипоксии (Миррахимов М.М., 1978; Данияров СБ., 1979).
Региональные сосудистые реакции в значительной мере определяются также сосудорасширяющим действием продуктов распада АТФ (АДФ, АМФ, аденин, аденозин и неорганического фосфора), которые накапливаются в испытывающих гипоксию тканях. При адаптации к более длительной гипоксии может происходить образование новых капилляров, что приводит наряду со стабильным улучшением кровоснабжения органа, к уменьшению диффузного расстояния между капиллярной стенкой и митохондриями клеток.(Бар-башоваЗ.Х, 1970; Меерсон Ф.З., 1981; Щукина М. Я., 1983) .
Реакции системы крови проявляются повышением кислородной емкости за счет усиленного вымывания эритроцитов из костного мозга и активации эритропоэза, обусловленной усиленным образованием эритропоэтических факторов. Большое значение имеют свойства гемоглобина, позволяющие связывать почти нормальное количество кислорода даже при значительном снижении парциального давления кислорода в альвеолярном воздухе и в крови легочных сосудов (Бабский Е.Б. с соавт., 1985).
Ключевые элементы фосфоинозитидного мессенджерного каскада
Универсальность рецепторов клеточной поверхности, воспринимающих воздействие гормонов и нейромедиаторов (Enjalbert A. et al., 1986; Lefkowitz R.J., et al., 1988; Yip C.C., 1988; Schofl С et al., 1991; Morgan P.J. et al., 1991; Талако С.A., 1993), а также возможность разно- и однонаправленных эффектов фосфоинозитидной и АдЦ-ной систем (Kikkawa F. et al., 1986; Tonkin M. et al., 1987; Ивашкин В.Т. с соавт., 1987) затрудняют определение принадлежности их к различным мессенджерным системам, если основываться на характере изменений клеточной активности и природе аго-ниста.
В настоящее время признается, что основным критерием, позволяющим отнести рецептор к фосфоинозитидной системе ВМ, является способность его агонистов стимулировать, а антагонистов - блокировать распад фосфоинозитидов, хотя физиологические рецепторы, ингибирующие фосфоинозитидную систему пока -не описаны. Очевидно, в клетке существует канал только непосредственной активации фосфоинозитидной системы с внешне-"Иембранных рецепторов, в отличие от двойной рецепторной регу--Ляции АдЦ-ной системы.
К основным типам рецепторов, активирующих фосфоинози-тидную систему ВМ относятся: М1-холинорецепторы (ацетилхолин) 1-адренорецептор (адреналин, норадреналин), Н1-гистаминоре-цептор (гистамин), 5-НТ2- и 5-НТ1с-серотониновые рецепторы (серотонин), глутаминоэргические рецепторы типа НМДА (глута-мат), Vl-рецепторы вазопрессина, рецепторы ангиотензина II холецистокинина, брадикинина, гастрина, панкреозимина, субстанции Р, тиреотропного гормона, рецепторы тромбина (Кухарь В.П., с соавт., 1991).
В ряде последних работ, методами клонирования кодирующих участков ДНК и последующей трансфекции рецепторов на поверхность мембран показана способность различных агонистов стимулировать активацию фосфоинозитидной системы. В частности Henderson А.К. etal., (1990), трансфицировали рецепторы, ней-рокина (NK2) на мышинные фибробласты, способные при добавлении NK2 стимулировать гидролиз PI. Levs G.D., et al., (1992) обнаружили эффективное сопряжение продуктов гена Kit (рецепторов) с фосфатидилинозит-3-киназой. Cotecchia S. et al., (1992) сконструировал химерный j 2/ лі - адренорецептор, который после трансфекции -на плазматическую мембрану, при стимуляции вызывал активацию АдЦ, и сохранял способность к гидролизу фосфоинозитидов.
Любопытный факт о новом сигнальном пути, связанном с рецепторами, но не влияющим на процесс гидролиза фосфоинозити-Дв, сообщил Stephan S. et al., (1992), который с коллегами Ч:;; ИсслеДовал механизмы фосфорилирования по тирозину белка рр72, . социированного с агрегацией высокоафинных рецепторов в клет-базофильного лейкоза крыс. Авторы показали, что активи рующий фактор FcERl индувдровал фосфорилирование по тирозину рецепторного белка рр72, не влияя на активность G-белков, в тоже время фтористый натрий и гуанозин-5 -0-3-тиотрифосфат вызывали гидролиз фосфоинозитидов, но не влияли на фосфорилирование белка рр?2, сделан вывод о новом сигнальном пути в клетку, использующим механизм фосфорилирования рецепторного белка рр72, и не связанного с активацией G-белков и с гидролизом фосфоинозитидов.
Таким образом, мессенджерные и молекулярные последовательности событий в клетке зависят от типа внешного воздействия. Следовательно, выяснение "биохимических событий", в том числе, мессенджерного ответа при конкретном внешнем стимулировании (гипоксические, температурные, световые, и другие) поможет в управлении приспособительного процесса. При этом, используя методы клонирования кодирующих участков ДНК, возможно моделирование рецепторной активности клеток. G-белки и фосфолипаза С.
Идентифицировано несколько типов G-белков (Cockroft S. et al., 1988; Gilman G.A., 1987), в частности помимо Gi-белка, имеющего оі-субьединицу с молекулярной массой около 41 кДа, идентифицированы также Go- и Gi2 с молекулярными массами ol-субь единиц по 39 и 40 кДа соответственно. Все эти белки являются гетеротримерами типа со структурой, очень сходной - с G-белками системы АдЦ. Их / и у субьединицы идентичны или
В мембране клетки на уровне G-белков существует опреде-Ленная система регуляции фосфоинозитидной системы. Наблюда ется сложная картина взаимоотношений между различными G-белками, а также их конкуренция за связи с рецепторами и ФЛ-С. При этом механизм сопряжения растворимой-ФЛ-С с рецепторами через G-белки остается малоизученным.
В фосфоинозитидной системе на уровне ФЛ-С завершается трансмембранный этап передачи гормонально-медиаторного сигнала с поверхности клетки и начинается образование вторичных мессенджеров. В отличие от АдЦ и ГуЦ, в реакциях, катализируемых ФЛ-С, в качестве субстрата используются компоненты клеточной мембраны. Расщепляемые ФЛ-С фосфоинозитиды - одна из минорных фракций мембранных фосфолипидов. Как и у других фосфолипидов, основу структуры фосфоинозитидов составляет глицерин с присоединенными к нему через сложную диэфирную связь в 1-м и 2-м положениях остатками жирных кислот. В третьем положении фосфодиэфирной связью к нему присоединен остаток мио-инозита, который способен к различной степени фосфорилирования.
Метод разделения инозитолфосфатов
Как известно, время распространения регуляционных и информационных потоков извне в клетку занимает доли секунды (Ленинджер А.Л., 1985; Шмидт Р. с соавт., 1986). Модуляция липид-белковых структур в плазматических мембранах, после ВОБ действия какого-либо физического фактора внешней среды, также начинается очень быстро; в течение первых 30 минут (Яковлев В.М. с соавт., 1994). Внутриклеточный эффекторный ответ занимает время от нескольких долей секунды до 2-8 суток (Саркисов Д.С. с соавт., 1975). А формирование адаптации продолжается недели, месяцы, и даже годы (Миррахимов М.М., Бейкер П. ред., 1981).
В связи с этим, нас интересовали сдвиги в фосфоинозитидной системе ВМ как в короткие промежутки времени после воз-Действия физического фактора (секунды, минуты, часы), так и в более длительные периоды приспособительного процесса.
В частности, различные группы крыс экспонировали в баро-г камере на "высоте" 6000 м. над у.м. в течение 15, 30 секунд.. г 1» 3, 15, 30 минут, 1, 3, б часов. В этих группах, после экс-;х позиции, в ткани мозга животных определяли содержание компонентов фосфоинозитидной системы - PI, PIP, PIP о, DAG, а также ы ирнокислотный состав фосфоинозитидов.
Модуляция всех мембранных фосфоинозитидов при воздействии барокамернои гипоксии была однотипной: происходило снижение их базального уровня, причем для РІ этот процесс проходил интенсивнее (рис.1), очевидно, недостаток кислорода ведет к инициации фосфорилирования РІ до полифосфоинозитидов - PIP и Р1Р . Но не исключена возможность прямого гидролиза PI (Alexander S.H. et al., 1991), о чем можно судить по высокому содержанию DAG (рис.2).
Содержание PIP после 15-ти минутной экспозиции снижалось с 9,5+1,0 до 6,5+0,7 мкг фосфата на грамм ткани (мкгР/г), а Р1Р2 с 21,9+3,3 до 18,0+0,5 мкгР/г (р 0,05). В другие сроки барокамернои экспозиции падение уровней полифосфоинозитидов было менее значительным (рис.3 и рис.4).
Во все сроки экспозиции повышено содержание DAG - непосредственного мессенджера, служащего сигналом для активации ПК-С (рис. 2). В течение 15-ти и 30-ти минутной экспозиции его уровень составлял 146,6+12,8% (р 0,05) и 137,9+14,9% (р 0,05) соответственно. Высокий уровень DAG свидетельствует об устойчивой адаптивной модификации внутриклеточных ферментов - "мишеней" этого мессенджера.
Выяснилось, что исходная (фоновая) жирнокислотная композиция фосфоинозитидов мозга - PI, PIP, PIPg- в контрольной группе имеет некоторые различия, обнаруживаемые при последовательном фосфорилировании фосфоинозитидных фракций (рис.5), рисунка видно что, жирнокислотный состав PIP и PIP2 пичается по содержанию основных насыщенных кислот, вровень которых в PIP выше чем в Р1Р : пальмитиновой С16:0) -33,2+1,6% против 21,1+3,9%; стеариновой (С16:0) 46,1+3,3% против 39,6+6,0%, в PIP и Р1Р2 соответственно. Дг ненасыщенных кислот наблюдалась противоположная картина: олеиновая (С18:1) кислота в PIP 2составляет 11,0+1,6%, а в PIP -. 4,9+0,3%; арахидоновая кислота (020:4) - 21,3+4,1% в PIF против 13,9+4,2% в PIP. Любопытно, что процентное содержание перечисленных ЖК в PI занимало среднее, по отношению к PIP и PIP2 , значение. Различие жирнокислотного состава в фосфо-инозитидах, возможно, имеет свое значение для проявления фуни циональных свойств их дериватов - DAG, АК и зйкозаноидої Кроме того, качество липидного микроокружения, зачастую определяет и уровень активности белков-ферментов на мембране (Крепе Е.М., 1981; Болдырев А.А., 1990).
При определении жирнокислотной композиции мембранных фос фолипидов мозга крыс при длительной (до 60 суток) адаптациі в высокогорье (3200 м.над у.м.) в мажорной фосфоинозитидне фракции, (в РІ) обнаружена общая тенденция к повышению долі полиненасыщенных ЖК (главным образом С20:4), во все сроки наблюдений (рис. 6 часть А, Б, В ). Подобная картина повышения доли ненасыщенных кислот имела место и в други: минорных фракциях фосфолипидов - в фосфатидилсерине и сфинго-миелине. В тоже время, в мажорных фосфолипидах - фосфатидилх . лине и фосфатидилэтаноламине, наоборот, повышалась доля С16:0 и 018:0 (Яковлев В.М. с соавт., 1994). Очевидно, что такие перестройки жирнокислотной композиции фосфолипидов, Е том числе в РІ, играют свою приспособительную роль, обеспечивая необходимую в данных условиях микровязкость мембраны, - Совместная работа с к.б.н. Терновым В.А. следовательно и соответствующую новым условиям активность мембранных ферментов (Болдырев А.А., 1990).
Однако, при б-ти часовой гипоксической экспозиции (6000 м. над у. м. в барокамере) не обнаружено достоверных изменений жирнокислотного состава полифосфоинозитидов в ткани мозга (таблица 1). Правда, в РІ прослеживается тенденция понижения доли ненасыщенных и, следовательно, повышение доли насыщенных ЖК.
Фосфоинозитидный ответ при адаптации крыс к пониженной температуре и барокамерной гипоксии
При длительном воздействии барокамерннсй гипоксии, пониженной температуры и комплекса факторов высокогорья, а также при нагрузке норадреналином и хлористым литием обнаружены различные векторные и количественные изменения в фосфоинози-тидной системе ВМ. Если придерживаться триггерной модели функционирования фосфоинозитидной системы, то при подобных воздействиях или при изменении внутреннего гомеостаза, что может происходить при патологии или старении организма, возможен переход системы ВМ в альтернативное устойчивое состояние (Романчиков Ю.М., 1991). Например, Xu Cai-Min et. al., (1993) в эритоцитах обнаружили более низкий уровень DAQ у пожилых людей по сравнению с молодыми. Fruen B.R. et. al., (1991) нашли более высокую скорость поглощения инозита в фибробластах У больных синдромом Дауна, чем у здоровых людей. Тканеспеци-фичные изменения в содержании мембранного PI (в плазматических, митохондриальных и микросомальных мембранах мозга, печени, скелетных мышц и легких) при длительной адаптации к факторам высокогорья (3200 м. над у.м.), барокамерной гипоксии (6000 м над у.м.) и пониженным температурам (+3С и +10С) обнаружили Яковлев В.М. с соавт., (1994). Эти же авторы наш-: ли и индивидуальные (в зависимости от устойчивости к гипоксии) различия в содержании PI - предшественника полифосфоино-,3итидов (poly-PI). В наших опытах, при 30-ти дневной барока мерной гипоксии, в низкоустойчивой группе не наблюдалось существенных колебаний содержания poly-PI во все сроки тренировки, в то время как у высокоустойчивых животных уровень poly-PI к 3-м и 30-м суткам повышался. Это позволяет говорить о более интенсивном фосфоинозитидном ответе высокоустойчивых крыс. Очевидно, что эти различия в модуляции уровней предшественников ВМ сказываются на формировании эффекторного ответа клеток и, следовательно, на индивидуальных (типовых) клеточных приспособительных возможностях. Гипоксия, судя по морфологическим и гистохимическим изменениям в мозгу подопытных животных, является мощным стрессирующим агентом. Анализ данных кариометрии, по которым можно судить об интенсивности процессов транскрипции и трансляции, показывает что у низкоустойчивых животных к 30-м суткам тренировки процессы приспособительной экспрессии генома носят значительно более глубокий характер, иными словами, наши данные позволяют предполагать, что организм низкоустойчивых крыс "нуждается" в более радикальных перестройках.внутриклеточного метаболизма для обеспечения приспособительного гомеостаза.
Таким образом, изменение активности фосфоинозитидной мес-сенджерной и супраоптико-нейрогипофизарной систем при адаптации к гипоксии свидетельствует о многоплановом характере перестроек: нейроэндокринного, клеточного и субклеточного звеньев регуляции. При этом характер адаптациноных перестроек на Участке передачи сигнала в клетку, т.е. в фосфоинозитидной системе ВМ заключается в повышении доли полифосфоинозитидов (сдвиг PI — poly-PI) в общей мембранной фракции инозитол-содержащих фосфолипидов. Этот сдвиг обеспечивает адекватную новым условиям среды трансдукцию сигналов в клетку.
Механизм корреляционных и регуляторных взаимодействий этих систем нуждается в дальнейшем изучении. Полученные факты свидетельствуют о различной стратегии приспособительных модификаций супраоптико-нейрогипофизарной системы и фосфоинозити-дных источников ВМ клетки у крыс с неодинаковой устойчивостью к гипоксии, что подтверждает известное положение о возможности формирования индивидуальных адаптационных моделей, в ответ на идентичное возмущающее действие (Медведев В.И., 1981).
При воздействии пониженной температуры (+3С) на организм животных не обнаружено значительных изменений в содержании PIP 2 мембран мозга. На 3-й сутки уровень PIP снизился, у низко- и высокоустойчивых крыс. Такое снижение PIP можно объяснить ускоренным фосфорилированием данного фосфоинозитида до PIP 2 либо его мобилизацией. Оба пути приводят к снижению его уровня в первые сутки адаптации, когда изменяется гормональный фон в организме (Закиров Дж.З., 1983). Снижение уровня PIP к 3-м суткам, возможно, вызванно необходимостью регуляторных изменений в содержании IPg - производного PIP, который участвует в репликации ДНК, активируя ДНК-полимеразу об (Романчиков Ю.М., 1991).
