Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 12
1.1. Методы определения спектральных свойств компонент смеси для двухкомпонентных систем 13
1.2. Обобщение метода АГК-СМ на случай трехкомпонентных систем 19
1.3. Методы, учитывающие только положительность спектров 23
1.4. Заключение по главе 1 24
Глава 2. Разработка метода "последовательных исключений" (ПИ), основанного на пошаговых попарных линейных преобразованиях спектров люминесценции 28
2.1. Аналитические возможности и ограничения метода 28
2.2. Основные определения терминов и понятий, используемых в методе последовательных исключений 29
2.3. Условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент 30
2.4. Определение числа компонент анализируемой смеси 34
2.4.1 .Процедура ортогонализации спектров смеси 34
2.4.2. Критерий определения числа компонент смеси 35
2.5. Определение спектров люминесценции компонент 36
2.6. Методы определения множителей попарных линейных преобразований спектров смеси 40
2.6.1. Определение множителя с использованием кусочного усреднения отношения спектров 41
2.6.2. Определение множителя с использованием полного усреднения отношения спектров 44
2.6.3. Интерактивный метод определения множителей 47
2.7. Определение спектров возбуждения люминесценции компонент 47
2.8. Обобщение метода ПИ для случая нарушения условия неполного попарного перекрывания пары спектров люминесценции компонент смеси 49
2.8.1. Возможности и ограничения модифицированного метода ПИ 49
2.8.2. Определение спектров люминесценции компонент в модифицированном методе ПИ 50
2.8.3. Способы определения множителей линейных преобразований спектров в модифицированном методе ПИ 53
2.8.4. Определение спектров возбуждения люминесценции компонент в модифицированном методе ПИ 55
2.8.5. О возможности расширенного применения модифицированного метода ПИ при дальнейшем ослаблении условия неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент 55 2.9. Применимость метода в случае переноса энергии между
компонентами смеси и высоких концентраций компонент 56
2.10. Сравнение метода ПИ с существующими подходами 57
2.11. Заключение по главе 2 60
Глава 3. Применение метода ПИ для исследования гомогенных растворов 63
3.1. Аналитическое исследование смоделированной шестикомпонентной смеси (при отсутствии шумов) 63
3.1.1. Моделирование двумерного спектра люминесценции смеси 63
3.1.2. Определение числа люминесцирующих компонент 64
3.1.3. Определение спектров люминесценции компонент 65
3.1.4. Определение спектров возбуждения люминесценции компонент 65
3.2. Аппаратура, методика подготовки объектов и экспериментальные измерения двумерных спектров люминесценции растворов многокомпонентных смесей органических красителей 70
3.3. Аналитическое исследование трехкомпонентной смеси 73
3.3.1. Условия регистрации двумерного спектра люминесценции смеси 73
3.3.2. Определение числа люминесцирующих компонент 73
3.3.3. Определение спектров люминесценции компонент 74
3.3.4. Определение спектров возбуждения люминесценции компонент 74
3.4. Аналитическое исследование четырехкомпонентных смесей 77
3.4.1. Условия регистрации двумерных спектров люминесценции...77
3.4.2. Определение числа люминесцирующих компонент 80
3.4.3. Определение спектров люминесценции компонент 84
3.4.3.1. Четырехкомпонентная смесь №1 84
3.4.3.2. Четырехкомпонентная смесь №2 88
3.4.3.3. Четырехкомпонентная смесь №3 91
3.4.4. Определение спектров возбуждения люминесценции компонент 92
3.5. Анализ влияния шумов в методе последовательных исключений 96
3.5.1. Влияние шумов на результат процедуры ортогонализации спектров люминесценции смеси 98
3.5.2. Влияние шумов на точность вычисления множителя линейного преобразования в процедуре определения спектров люминесценции компонент 104
3.5.3. Исследование процессов накопления шумов и увеличения дисперсии множителя в процедуре определения спектров люминесценции компонент смеси 109
3.6. Заключение по главе 3 117
Глава 4. Применение метода ПИ для исследования дисперсных систем, на основе фотосинтезирующих объектов 120
4.1. Люминесцентные свойства фотосинтезирующих объектов (по литературным данным) 120
4.1.1. Пигментный состав и структурная организация 120
4.1.2. Люминесцентные свойства объектов с ненарушенным фотосинтетическим аппаратом 122
4.1.3. Люминесцентные свойства объектов с нарушенным фотосинтетическим аппаратом 123
4.2. Методика подготовки образцов и измерения спектров люминесценции 124
4.2.1. Подготовка образцов 124
4.2.2. Экспериментальный режим измерений спектров люминесценции 124
4.3. Спектрально-люминесцентные свойства мутантных штаммов хламидомонады 126
4.3.1. Ацетат-зависимые мутантные штаммы хламидомонады 128
4.3.2. Мутантные штаммы с нарушенным синтезом каротиноидов 132
4.3.3. Мутантные штаммы с нарушенным синтезом хлорофилла а 134
4.4. Применение метода последовательных исключений для анализа люминесцентных свойств мутантного штамма хламидомонады chl-1-19 137
4.4.1. Предварительная обработка спектров люминесценции 138
4.4.2. Определение числа люминесцирующих пигментов 139
4.4.3. Определение спектров люминесценции пигментов 140
4.4.4. Идентификация люминесцирующих пигментов по спектрам люминесценции выявленных компонент 144
4.4.5. Определение спектров возбуждения люминесценции пигментов 144
4.5. Применение метода последовательных исключений для анализа люминесцентных свойств объектов с ненарушенным фотосинтетическим аппаратом 146
4.5.1. Определение числа люминесцирующих пигментов штамма ее-124 147
4.6. Заключение по главе 4 149
Заключение 151
Список литературы
- Методы, учитывающие только положительность спектров
- Методы определения множителей попарных линейных преобразований спектров смеси
- Определение спектров люминесценции компонент
- Люминесцентные свойства объектов с ненарушенным фотосинтетическим аппаратом
Введение к работе
Люминесцентный анализ широко применяется для решения широкого ряда научных и прикладных задач. С помощью люминесцентного анализа решаются задачи качественного и количественного характера. Он применяется для идентификации вещества по его спектрам люминесценции и спектрам возбуждения люминесценции, для определения концентрации исследуемого объекта, если известны его спектры люминесценции и (или) возбуждения люминесценции. Как известно, существуют и другие методы анализа смесей - например хроматография, экстракция и электрофорез. В данных методах смесь разделяется на компоненты, а затем каждая из компонент отдельно идентифицируется. Люминесцентный анализ позволяет определять компоненты смеси без предварительного их разделения на отдельные компоненты. Как известно, спектр люминесценции гомогенного вещества не зависит от длины волны возбуждающего света. Следовательно, наличие зависимости спектра люминесценции исследуемого объекта от длины волны возбуждения говорит о том, что данный объект является смесью нескольких веществ.
В настоящее время существуют приборы - спектрофлуориметры, которые позволяют регистрировать двумерные спектры люминесценции. Под двумерными спектрами подразумеваются спектры люминесценции, зарегистрированные в широком диапазоне длин волн возбуждения. Возможность получения двумерных спектров люминесценции позволяет проводить обработку полученных данных, не совмещая ее с процессом регистрации. Метод "последовательных исключений", представленный в этой работе, основан на обработке двумерного спектра люминесценции смеси, который содержит всю спектральную информацию.
Для изучения и анализа оптических свойств широкого круга объектов применяются спектрально-люминесцентные методы определения индивидуальных характеристик компонент смеси. Это обусловлено тем, что молекулы обладают индивидуальными спектрами люминесценции. Если спектры индивидуальных компонент известны, то задача определения спектральных свойств компонент смеси в общем случае может быть сведена к решению системы линейных уравнений. Методы, которые решают данную задачу, широко известны и описаны в литературе.
При анализе смеси в некоторых случаях можно определить спектры люминесценции и возбуждения люминесценции, как для известных, так и неизвестных компонент без применения специальных вычислительных методов. Во-первых, это возможно в том случае, если в спектрах возбуждения люминесценции каждой из компонент существует область, при возбуждении в которой люминесцирует только эта компонента. Ко второму случаю относится ситуация, когда спектры люминесценции компонент смеси спектрально разнесены. В данных случаях можно идентифицировать компоненты смеси по их спектрам поглощения, поскольку в большинстве случаев спектр возбуждения люминесценции вещества совпадает с его спектром поглощения.
В случае же, когда спектры возбуждения люминесценции неизвестных компонент смеси сильно перекрываются друг с другом, задача определения индивидуальных свойств неизвестных компонент смеси в общем случае не имеет однозначного решения. Однако, при выполнении определенных условий, задача определения спектров неизвестных компонент смеси может иметь однозначное решение. Методы, которые решают эту задачу, мало распространены и применялись для определения компонент смеси с числом компонент не более трех.
В данной работе разработан "метод последовательных исключений", который позволяет определять спектры люминесценции индивидуальных компонент смеси при отсутствии априорной информации о компонентах, т.е. когда неизвестно число компонент и их спектры люминесценции. Теоретически метод "последовательных исключений" может быть применен к смесям с любым числом компонент. Данный метод применим к смесям, удовлетворяющим следующим условиям: 1) анализируемая смесь является химически и спектрально аддитивной; 2) спектры люминесценции компонент смеси не должны полностью попарно перекрываться. Подробно условие 2) рассмотрено и обосновано в главе 2. Предполагается также, что в анализируемых смесях выполняется закон Вавилова - спектры люминесценции индивидуальных компонент не зависят от длины возбуждения люминесценции.
Ситуации, когда отсутствует априорная информация о числе компонент и спектрах люминесценции возникает, например, при люминесцентном анализе природных загрязнителей. В ряде случаев к такому типу задач относится анализ биологических объектов. Обычно, у фотосинтезирующих организмов существует только люминесценция хлорофилла "а". Люминесценция других пигментов отсутствует, вследствие полного переноса энергии на хлорофилл "а". В данной работе метод последовательных исключений был применен для анализа спектральных свойств мутантного штамма хламидомонады СЫ-1. Данный штамм характеризуется нарушенным синтезом хлорофилла а. Из-за дезагрегации пигментного аппарата перенос энергии между другими пигментами сильно ослаблен. Поэтому, в спектрах люминесценции СЫ-1, в отличие от "дикого" типа, вместо люминесценции только хлорофилла а наблюдаются несколько полос, принадлежащих предшественникам хлорофилла а. С точки зрения люминесцентных свойств такой объект может рассматриваться как аддитивная многокомпонентная система.
Основные защищаемые положения:
Сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси, при котором принципиально возможно однозначное определение люминесцирующих компонент по двумерным спектрам люминесценции для смесей с любым числом компонент.
Разработан метод "последовательных исключений", который, при выполнении условия неполного попарного перекрывания, позволяет определять спектрально люминесцентные характеристики компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции. Метод не имеет принципиальных ограничений для числа компонент смеси.
Разработан математический алгоритм, реализующий метод "последовательных исключений".
Предложен модифицированный метод "последовательных исключений" для смесей с нарушением условия неполного попарного перекрывания для какой либо одной пары компонент смеси.
Показана применимость метода к объектам низкого оптического качества (неоднородным, рассеивающим) на примере биологических объектов; впервые in vivo определены спектры люминесценции и возбуждения люминесценции металлокомплекса протопорфирина и агрегированной формы протопорфирина IX у мутантного штамма хламидомонады.
Диссертационная работа имеет следующую структуру. В первой главе изложены и проанализированы представленные в литературе методы определения компонент смеси без использования эталонов. Методы, описанные в литературе можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы, которые решают задачу, имеющую единственное решение, и дают истинное решение. Ко второй группе относятся методы, решающие неопределенную задачу и дающие наиболее вероятное решение.
II Вторая глава посвящена методу "последовательных исключений". Во-первых, рассмотрены ограничения и область применения метода. Во-вторых, рассмотрен алгоритм определения спектров люминесценции индивидуальных компонент смеси и спектров возбуждения люминесценции. Наряду с двумя автоматическими вариантами определения спектров люминесценции компонент изложен также и интерактивный вариант. Отдельно рассмотрено обобщение метода в случае нарушения условия неполного попарного перекрывания спектров люминесценции для какой либо одной пары компонент смеси.
В третьей главе рассмотрены результаты применения "метода последовательных исключений". Работоспособность метода, во-первых, продемонстрирована на смоделированной шести компонентной смеси при отсутствии шумов, во-вторых, на реальных трехкомпонентной и четырехкомпонентных смесях. Также, в этой главе приведен анализ влияния шумов на результаты применения метода "последовательных исключений".
В четвертой главе рассмотрены особенности люминесценции биологических объектов, приведены результаты спектрально-люминесцентных исследований фотосинтезирующих объектов, которые использовались в данной работы. Также, в ней изложены результаты применения разработанного метода для определения люминесцирующих пигментов мутантного штамма (Chl-1) и "дикого" типа хламидомонады.
Методы, учитывающие только положительность спектров
В литературе также описаны статистические методы, которые, в отличии от рассмотренных выше, не учитывают некоторые из ограничений. К таким методам относится модификация метода АГК-СМ, описанная в работе [10]. Выбор точек в плоскости /,,/2» соответствующих возможным коэффициентам индивидуальных компонент, проводился с использованием метода Монте Карло по точкам сгущения положений максимумов рассчитываемых спектров компонент. Это значит, что из всех рассчитанных спектров выбираются те, в которых положение максимума полосы находится в одной из точек сгущения. Учет двух ограничений: 1) спектры индивидуальных компонент всегда положительны и 2) спектры смеси являются положительной комбинацией спектров индивидуальных компонент, значительно уменьшает число возможных вариантов спектров для каждой из компонент. Этот метод позволяет определять число компонент смеси, положение максимумов индивидуальных компонент, но не позволяет однозначно определять спектры индивидуальных компонент. В качестве результата получаются несколько вариантов возможных спектров поглощения индивидуальных компонент.
В работе [11] представлен другой статистический метод определения спектральных свойств компонент смеси. В данном методе учитываются те же ограничения. На первом этапе для определения числа компонент смеси осуществляется диагонализация матриц ковариаций: M = Y-Y (1.3.1)
Затем проводится преобразование полученных абстрактных собственных векторов в физически значимые спектры компонент. Для этого в рассматриваемом методе собственные векторы преобразовывались, используя плоские вращения. Данная процедура проводилась итерационным способом до тех пор, пока не получались спектры, содержащие только неотрицательные значения. Данный метод был применен для анализа двухкомпонентных систем - смесях антрацена и пирена при различном соотношении концентрации компонент (от 1/1 до 1/5).
На основе рассмотренных методов определения спектральных свойств компонент смеси, описанных в литературе все методы можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы, решающие задачу, имеющую единственное решение. Это единственное решение и получается в качестве результата, при применении этих методов.
В эту группу входят базовый метод АГК-СМ [1,2], а также модификации данного метода, описанные в работах [4 - 8]. Во всех этих методах выполняется три условия: 1) спектры индивидуальных компонент содержат только положительные значения; 2) исходные спектры смеси являются положительными комбинациями спектров индивидуальных компонент и 3) на границах зарегистрированных спектров смеси должны существовать две области длин волн, в которых отлична от нуля люминесценция только одной из компонент.
В методе АГК-СМ для случая трех компонент выполнение данных трех условий является необходимым, но не достаточным. Проблема однозначного определения решена в модифицированном методе АГК-СМ [5,8,12] благодаря применению алгоритма, позволяющего выбирать три наиболее отличные друг от друга рассчитанных спектра. Однако, этот метод, также как и другие рассмотренные здесь методы анализа многокомпонентных систем, имеет ряд существенных недостатков, которые ограничивают область его применения. Основным недостатком данного метода является то, что он не может быть обобщен на случай, когда число компонент больше трех. Причем, следует отметить, что это ограничение носит принципиальный характер. Это связано с тем, что спектры индивидуальных компонент рассчитываются как линейные комбинации "значимых" собственных векторов, т.е. задача сводится к определению индивидуальных коэффициентов /„.. В случае трехкомпонентной смеси коэффициенты tu, t2i для /-ой компоненты определяются как координаты выбранного угла треугольника, а третий коэффициент /3/ связан с первыми двумя следующим уравнением:
Следовательно, для четырех компонент экспериментальные коэффициенты trj теоретически должны образовывать четырехугольник в плоскости tx,t2, чьи углы соответствуют точкам, координаты которых в четырехмерном пространстве определяют индивидуальные коэффициенты tri. Ясно, что для случая четырех компонент также должно выполняться равенство (1.4.1). Однако в этом случае всегда будет присутствовать неоднозначность в определении коэффициентов t3i и /4/. Именно данное обстоятельство не позволяет однозначно определить спектры индивидуальных компонент для случая четырехкомпонентной смеси.
Также следует отметить, что хотя модификация метода АГК-СМ [4] позволяет однозначно определять спектры компонент для трехкомпонентной смеси, однако полученные спектры компонент некоторые ошибки [5,8]. В полученных спектрах индивидуальных компонент соотношение полос не совпадает с соотношением полос в соответствующих зарегистрированных спектрах компонент. Данное несоответствие может быть вызвано следующими причинами: точность определения спектров компонент зависит от точности выбора индивидуальных коэффициентов tri, которая, в конечном счете, определяется уровнем шумов в каждом конкретном случае. Причем, с увеличением числа компонент в смеси существенно возрастает требование к соотношению сигнал/шум, поскольку увеличивается число коэффициентов /„для каждой компоненты: в двухкомпонентной смеси для каждой компоненты определяются два коэффициента, для трехкомпонентной — три и т.д., а недостаточно точное определение одного из коэффициентов автоматически приводит к ошибочным значениям оставшихся коэффициентов для определенной компоненты, т.к. их сумма всегда равна 1 (1.4.1).
Ко второй группе относятся методы, которые не используют ограничение 3 (условие существования двух областей, где отлична только одна из компонент). В общем случае, если это ограничение не выполняется, то задача является неопределенной. Методы данной группы пытаются решать именно эту неопределенную задачу. В эту группу входит статистический метод, описанный в работе [4]. В данном методе не учитывается условие 3. Если это условие выполнено, то для каждой из компонент получаются несколько наиболее вероятных решений. Одно из полученных решений соответствует спектрам индивидуальных компонент. В случае же, когда условие не выполняется и однозначного решения задачи не существует, в результате получаются также несколько наиболее вероятных решений. Однако, ни один из вариантов полученных решений может не соответствовать спектрам индивидуальных компонент.
Методы определения множителей попарных линейных преобразований спектров смеси
Ниже изложены несколько способов определения множителя W, входящего в формулы (2.5.1 — 2.5.4). Следует отметить, что разработанные в данной работе варианты не предполагаются единственно возможными и являются одними из вариаций реализации метода последовательных исключений.
Определение множителя с использованием кусочного усреднения отношения спектров. На каждом шаге в процедуре определения спектров люминесценции компонент вычисляются отношения MJk по формуле: К =К;""/ vo/ " (2.6.1) где к - нумерует спектральные точки. На "прямом" ходе, начиная с длинноволновой границы (или с коротковолновой границы, для "обратного" хода), положение которой определяется на предыдущем шаге, ищется область определенной длины (например, 5 точек), в которой выполняется неравенство: (Л/У-А/У.Ь (2.6.2) где єх - эмпирический параметр, определяемый уровнем шума в спектрах люминесценции смеси. В большинстве исследованных нами случаев он полагался равным 0.1. В случае сильно зашумленных спектров он может быть увеличен.
Определив эту область, за начальную точку обработки принимаем её длинноволновую границу (точкуj0). В том случае, если такую область определить не удается, параметр єх увеличивается и решение задачи начинается сначала. Начиная с выбранной точки (у0) для каждой к -ой текущей точки в порядке уменьшения к вычисляем разность Рк:
Первое слагаемое в правой части выражения (2.6.3) соответствует глобальному среднему значению М 1к, второе - локальному среднему значению. Нами было выяснено, что для локального усреднения значений M jj, достаточно пяти значений (N/(K.=5).
Для каждой вычисленной разности Рк проверяется, выполнено ли следующее неравенство: Рк є2 (2.6.4) где є2 - параметр, определяющий точность искомого множителя. При получении первого значения Р , для которого Рк є2, останавливаем процедуру анализа и определяем область значений множителя, принимая за ее границы минимальные и максимальные значения отношения M ,jB анализируемой области ( Мтп и Л/тах).
Для уточнения множителя может быть применена любая из известных процедур поиска минимума функции а(т) = -- I iV,, +m-V0l)2 (где n = j0-k) от переменной т в интервале \МттМтю\.
Описанная выше процедура нахождения множителя т может быть остановлена преждевременно из-за наличия в спектрах люминесценции случайных выбросов. Принимая во внимание такую возможность, для повышения точности определения множителя ищется вторая область, где значения отношений М1к постоянно с заданной точностью (параметр є2).
Если расстояние между областями мало (например, 5 точек), то процедура нахождения множителя повторяется для этой области. Далее, аналогичным образом, определяются все области, которые удовлетворяют данным требованиям. Например, вычислим по формуле (2.6.1) отношения М)к для двух векторов в области 520 - 580 нм (рис. 2.6.1). в которых М )к постоянны с заданной точностью. Коротковолновой границе области №1 соответствует точка у0, определенная согласно (2.6.2). Для каждой из выбранных / (в рассмотренном примере / = 3) областей определяется свое значение множителя т„ (/ = 1,.../). Далее определяется область L, включающая в себя данные / областей. Затем, для каждого из т, множителей, вычисляются / линейных комбинаций двух векторов, анализируемых на данном шаге. Из набора множителей w,, выбирается наилучший, при котором вектор, получающийся на этом шаге, имеет во всей области I значения близкие к нулю (контролировалось по среднему квадратическому отклонению).
Отношения М ,м так же, как и в первом автоматическом варианте, вычисляются по формуле (2.6.1). Положение длинноволновой границы (точка у„) определяется следующим образом. Для каждого значения M JJt вычисляется разность по формуле: +2 іуі = (2.6.6) /-»-2 «far За точку у0 принимается точка, начиная с которой разность Lk удовлетворяет неравенству: Lt et9 (2.6.7) где єх - параметр, задаваемый так же, как и в первом автоматическом варианте.
Начиная с выбранной точки /0, для каждой для каждой А-ой текущей точки в порядке уменьшения к вычисляется разность Рк по формуле (2.6.3).
Для каждой вычисленной разности Рк проверяется выполнение неравенства: Р„йе2, (2.6.8) где є2тт є2 є2тт. є2тп и є2тм - эмпирические параметры, которые задаются исходя из требуемой точности искомого множителя. Значение Е2 получалось с использованием процедуры описанной ниже. В большинстве исследуемых нами случаев полагалось: :2mjn=0.1, г2тах=0.3.
При получении нескольких (у нас - N,,K) подряд значений Рк є2, процедура останавливается и определяется количество значений отношения M jj,, для которых выполнено условие (2.6.8). Если количество значений А/7 достаточно велико (у нас - 3Nlm), процедура останавливается. В противном случае значение параметра є2 увеличивается на величину шага И (у нас полагалось: Л=0.01) и, начиная с точки у 0, заново ищется область, в которой для значений М ,м выполняется неравенство (2.6.8). Увеличение параметра е2 продолжается до тех пор, пока данная область не будет включать в себя достаточное количество значений М ,,к, для которых выполняется неравенство (2.6.8) или значение е2 не достигнет 2(ШЫ. В последнем случае делается вывод о том, что для компонент, анализируемых на данном шаге, не выполняется условие неполного попарного перекрывания.
Множитель вычисляется как среднее арифметическое отношений М ,м, входящих в данную область. В качестве иллюстрации способа определения множителя рассмотрим тот же пример, что и для первого автоматического (рис. 2.6.2). В этом случае определяется одна область, в которой значения M jj, удовлетворяют неравенству (2.6.8).
Определение спектров люминесценции компонент
В моделируемой смеси спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент смеси полагались равноотстоящими функциями следующего вида: (Л -Лпах,) ;(Я,) = 2-ехр , Ll(A.l) = 0,npuLl(Al) 0.0\-LJ(Amax), (3.1.1) max у ДЯ2 (Хк -Я(. ) Ej(At) = ехр , Е1{Хк) = 0,приЕІ ) ОЛ\-ЕІ{Хі.тті) (3.1.2) [max J ДЛ%„ где - Я, - длина волны люминесценции; Я,лах - длина волны максимума люминесценции у-ой компоненты; ДЯтах - полуширина полосы люминесценции /-ой компоненты; Лк- длина волны возбуждения, Я4.тах длина волны максимума возбуждения; АЯ.тач - полуширина полосы возбуждения.
Расстояние между максимумами полос люминесценции компонент полагалось равным 60 нм, полуширина полос люминесценции: дЛтах = 30 нм.
Расстояние между максимумами полос возбуждения люминесценции компонент полагалось равным 25 нм, полуширина полос возбуждения: Чп«г35нм.
На рис. 3.1.1 и 3.1.2 представлены соответственно спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент, из которых составлялась смесь. Спектры люминесценции смеси при различных длинах волн возбуждения определяются выражением: ykJ=±E .i}t \ (3.1.3) 7-І где {" - спектр возбуждения люминесценции; L\J) - спектр люминесценции У-ой компоненты; индексы ли/ нумеруют спектральные точки спектров возбуждения и люминесценции, соответственно; vkJ - спектр люминесценции смеси при длине волны возбуждения Л; п - число компонент (в данном случае - 6).
Спектры люминесценции смеси нормировались по формуле (2.2.1). Двумерный спектр люминесценции смеси представляет собой набор спектров люминесценции (3.1.3) при длинах волн возбуждения от 250 до 370 нм с шагом 10 нм.
Для определения числа компонент смеси применялась процедура ортогонализации (см. раздел 2.4). В результате были получены ортогональные векторы, соответствующие исходным спектрам люминесценции смеси. Как видно из таблицы 3.1, число норм векторов, отличных от нуля, равно шести. Поскольку в спектрах смеси отсутствуют шумы, число компонент смеси определяется однозначно на основании значений норм. На рисунке 3.1.3. представлены репрезентативные спектры люминесценции смеси, соответствующие первым шести ортогонализованным векторам.
В предыдущей главе описаны три способа вычисления множителя т в процедуре определения спектров люминесценции компонент (см. раздел 2.6). Поскольку в данном случае репрезентативные спектры смеси не содержат шумовой составляющей, то результат не зависит от способа определения множителя т. Нами был использован первый автоматический вариант (см. раздел 2.6.1). На рисунке 3.1.4 приведены полученные спектры люминесценции компонент. Сравнивая полученные спектры со спектрами люминесценции компонент (рис. 3.1.1), видно, что они идентичны между собой с точностью до множителя. Максимум полосы люминесценции первой компоненты (рис. 3.1.4, кривая 1) оказался интенсивнее, чем у других компонент, из-за нормировки спектров.
Спектры возбуждения компонент были определены в результате решения системы линейных уравнений (2.7.1). Согласно изложенному в разделе 2.7, выбор п точек (в данном случае п=6) в спектрах люминесценции смесей, которым соответствуют уравнения в системе (2.7.1), может быть осуществлен двумя способами. Однако, при достаточно большом шаге по длинам волн возбуждения (10 нм), применение процедуры ортогонализации на множестве зарегистрированных спектров возбуждения люминесценции смеси не дает преимуществ перед выбором точек, соответствующих максимумам полос люминесценции компонент смеси.
Люминесцентные свойства объектов с ненарушенным фотосинтетическим аппаратом
В случае смеси №1 в системе линейных уравнений (2.7.1) были оставлены четыре уравнения, соответствующие следующим длинам волн регистрации люминесценции: 403, 485, 555 и 578 нм. Эти точки выбирались не точно в максимумах люминесценции, а в точках, близких к максимумам, в которых шум в полученных спектрах люминесценции компонент сказывался в наименьшей степени на действительное значение интенсивности люминесценции в спектре компонент. Полученные спектры возбуждения люминесценции приведены на рисунке 3.4.16. Для смеси №2 в системе линейных уравнений были выбраны спектры возбуждения люминесценции смеси, соответствующие длинам волн регистрации люминесценции: 409, 484, 557 и 686 нм, а для смеси №3 - 412, 484, 547 и 689 нм. Данные точки выбирались по тому же принципу, что и для смеси №1. На рисунках 3.4.17 и 3.4.18 приведены полученные спектры возбуждения люминесценции компонент для смеси №2 и смеси №3 соответственно.
Полученные спектры возбуждения люминесценции антрацена, родамина 6Ж (рис. 3.4.16 - 3.4.18, кривая 1 и 3 соответственно) и родамина Б (рис. 3.4.16, кривая 4) могут быть сопоставлены с их спектрами поглощения, приведенными в литературе. Так, в спектре поглощения антрацена в смеси этанола с метанолом, при +18 С [16] присутствуют полосы 374, 5 нм (3,87), 354,5 нм (3,86), 338,0 нм (3,75), 323,0 нм (3,47), 308,0 нм (3,15) и 251,5 нм (5,29) (в скобках - Igs). В спектре поглощения родами 6Ж [17] в рассматриваемой области имеются полосы: 350 нм, 303 нм, 280 нм и 245 нм, а в спектре поглощения родамина Б [18] - полосы 360 нм, 310 нм, 280 нм и
Для всех трех соединений имеет место удовлетворительное согласие полученных спектров возбуждения люминесценции с их опубликованными спектрами поглощения.
Спектр возбуждения люминесценции кумарина в данной работе был зарегистрирован только в области от 220 до 340 нм (рис. 3.2.2 "б"). При сравнении полученного спектра возбуждения люминесценции кумарина для смеси №1 (рис. 3.4.16, кривая 2) с зарегистрированным спектром видно, что между ними наблюдается качественное соответствие.
Различие в соотношениях интенсивности полос у данных спектров обусловлено тем, что при измерении спектра возбуждения люминесценции этанольного раствора кумарина его концентрация на порядок превышала концентрацию кумарина в исследуемых смесях. Для смесей №2 и №3 полученные спектры возбуждения люминесценции могут быть сопоставлены с измеренным спектром только в области от 300 до 340 нм, поскольку для оставшейся области 350 - 370 нм данные о спектре возбуждения люминесценции кумарина отсутствуют. Как видно из рисунков (рис. 3.4.17 и 3.4.18, кривая 2), в области 300 - 340 нм, наблюдается согласие между полученными и измеренным спектрами возбуждения люминесценции кумарина.
У двух оставшихся веществ (протопорфирин и феофитин а) в исследуемой в этой работе области длин волн отсутствуют характеристические полосы поглощения. При сравнении полученных спектров возбуждения люминесценции протопорфирина и феофитина (рис. 3.4.17, кривая 4 и рис. 3.4.18, кривая 4 соответственно) с их измеренными спектрами возбуждения люминесценции (рис. 3.2.2 "г" ) видно, что ход соответствующих кривых совпадает.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что возможность и точность определения спектров возбуждения люминесценции компонент зависит от степени зашумленности полученных спектров люминесценции компонент.
В исходном зарегистрированном двумерном спектре люминесценции реальных смесей всегда присутствует шумовая составляющая. На результат применения метода последовательных исключений, наряду с индивидуальными особенностями двумерного спектра люминесценции смеси и самих компонент (области возбуждения и регистрации люминесценции смеси, выполнение условия неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси) влияет также тип шума и его уровень в двумерном спектре люминесценции смеси.
Как известно, в зарегистрированном спектре люминесценции смеси обычно присутствуют как аддитивная, так и мультипликативная шумовые составляющие. В тоже время, влияние одного и того же по типу и уровню шума в исходном двумерном спектре смеси на результат применения метода зависит от числа компонент исследуемой смеси. Поэтому, нами было исследовано влияние аддитивной, мультипликативной и совместно аддитивной и мультипликативной шумовых составляющих в исходном двумерном спектре люминесценции смеси на результат применения метода для смесей с числом компонент от 2 до 6. Для каждой смеси уровень шума изменялся от нулевого до максимально допустимого. Определение понятия максимально допустимого уровня шума приведено дальше в разделе 3.5.1.
Исследование смесей с различным типом и уровнем шума в исходном двумерном спектре люминесценции проводилось для выяснения следующих вопросов. Во-первых, как уровень и тип шума в исходном двумерном спектре влияет на результат ортогонализации и, соответственно, на возможность и точность определения числа компонент смеси. Во-вторых, как от него зависит точность множителя, получаемого на каждом шаге в процедуре определения спектров люминесценции компонент смеси. В третьих, каким образом начальный уровень шума сказывается на зависимости увеличения уровня шума и уменьшения точности множителя от номера шага "прямого" и "обратного" хода в процедуре определения спектров люминесценции компонент. И, наконец, каким образом зависит степень зашумленности получаемых спектров люминесценции компонент от уровня шума в двумерном спектре люминесценции смеси.
Уровень и тип шума также сказывается при определении спектров возбуждения люминесценции компонент смеси. Точность определения спектров возбуждения зависит от выбора метода решения системы линейных уравнений (2.7.1), в которой число уравнений обычно превышает число неизвестных. В этом случае уровень шума в полученных спектрах также зависит и от выбора метода решения системы (2.7.1). Поэтому в данной работе влияние шумов на точность определения спектров возбуждения люминесценции компонент не исследовалось.
Данное исследование проводилось на смоделированных смесях, компоненты которых были взяты те же, что и в шестикомпонентной смеси, описанной в разделе 3.1. Спектры люминесценции и возбуждения люминесценции также полагались гауссовыми функциями, описываемыми (3.1.1) и (3.1.2), а спектры люминесценции смесей при различных длинах волн возбуждения определялись по формуле (3.1.3).
