Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Маркеры старения кожи 19
1.2. Представление о неироиммуноэндокриннои системе кожи .. 27
1.2.1. Клетки и сигнальные молекулы иммунной системы кожи 28
1.2.1.1. Кератиноциты 29
1.2.1.2. Клетки Лангерганса и дендритные антиген-представляющие клетки
1.2.1.3. Т- лимфоциты 34
1.2.1.4. Эндотелиальные клетки
1.2.1.5. Макрофаги 38
1.2.1.6. Тучные клетки 39
1.2.2. Клетки и сигнальные молекулы эндокринной системы кожи 45
1.2.2.1. Клетки Меркеля 46
1.2.2.2 Другие нейроэндокринные клетки кожи и их биохимические фенотипы 49
1.2.2.3. Мелатонин и серотонин 55
1.1.4. Сигнальные молекулы нервной системы кожи 59
1.1.4.1. Функциональные взаимодействия окончаний нервных волокон с тучными клетками 60
1.1.4.2. Нервная модуляция функций клеток Лангерганса... 62
1.1.4.3. Нервная модуляция функций меланоцитов
1.1.5. Структурно-функциональные основы организации нейроиммуноэндокринной системы кожи 64
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Характеристика наблюдений старения кожи 67
2.2. Характеристика наблюдений базально-клеточного рака кожи 69
2.3. Методы морфологического и иммуногистохимического исследования материала 72
2.4. Анализ гистологических препаратов 76
2.5. Статистическая обработка результатов исследований 77
Результаты собственных исследований 79
Глава 3. Хронологическое старение кожи 79
3.1. Гистологическое исследование кожи, закрытой от инсоляции, пациентов разных возрастных групп 79
3.2. Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул клетками кожи при хронологическом старении 81
3.2.1. Показатели экспрессии хромогранина А в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 81
3.2.2. Показатели экспрессии серотонина и мелатонина в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 85
3.2.3. Показатели экспрессии эндотелиальнои синтазы оксида азота в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп
3.3. Экспрессия сигнальных молекул иммунной системы клетками кожи при хронологическом старении 95
3.3.1. Показатели экспрессии антигена CD35 (CR1) в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 95
3.3.2. Показатели экспрессии антигенов HLA-DR и CD 1а в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп .- 98
3.3. Экспрессия маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза при хронологическом старении кожи 106
3.3.1. Показатели экспрессия антигена КІ67 в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 106
3.3.2. Экспрессия инволюкрина в эпидермисе кожи, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 109
3.3.3. Экспрессия белков р53, Вс1-2 и Мс1-1 в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 118
3.3.4. Экспрессия PCNA в коже, закрытой от инсоляции, у пациентов разных возрастных групп 126
3.5. Корреляционный анализ связей между показателями экспрессии маркеров пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток и показателями экспрессии
нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул при хронологическом старении кожи 130
Глава 4. Индуцированное ультрафиолетовым облучением старение (фотостарение) кожи... 134
4. 1. Гистологическое исследование кожи, подверженной ультрафиолетовому облучению, пациентов разных возрастных групп 134
4.2. Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул клетками кожи при фотостарении 137
4.2.1. Показатели экспрессии хромогранина А в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 137
4.2.2. Показатели экспрессии серотонина и мелатонина в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 142
4.2.3. Показатели экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 148
4.3. Экспрессия сигнальных молекул иммунной системы клетками кожи при фотостарении 149
4.3.1. Показатели экспрессии антигена CD35 (CR1) в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 149
4.3.2. Показатели экспрессии антигенов HLA-DR и CD 1а в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 153
4.4. Экспрессия маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза при фотостарении кожи 156
4.4.1. Показатели экспрессии антигена КІ67 в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 156
4.4.2. Экспрессия инволюкрина в эпидермисе кожи, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 163
4.4.3. Экспрессия белков р53, Вс1-2 и Мс1-1 в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 167
4.4.4. Экспрессия PCNA в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 176
4.5. Корреляционный анализ между показателями экспрессии маркеров пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток и нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул при фотостарении кожи 179
Глава 5. Базально-клеточный рак кожи 183
5.1. Связь между подверженностью кожи инсоляции, частотой возникновения базально-клеточного рака кожи и клинико-морфологическим вариантом опухоли 183
5.2. Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул в коже пациентов с базально-клеточным раком 185
5.3. Экспрессия сигнальных молекул иммунной системы в коже пациентов с базально-клеточным раком 189
5.4. Сигнальные молекулы неироиммуноэндокриннои системы кожи и маркеры пролиферации и апоптоза опухолевых клеток 191
5.4.1. Корреляция между экспрессией хромогранина А, мелатонина и пролиферативной активностью опухолевых клеток 190
5.4.2. Связь между экспрессией нейроэндокринных сигнальных молекул и маркеров апоптоза при базально клеточном раке кожи 194
4.4.3. Экспрессия белков р53, Вс1-2 и Мс1-1 в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 167
4.4.4. Экспрессия PCNA в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп 176
4.5. Корреляционный анализ между показателями экспрессии маркеров пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток и нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул при фотостарении кожи 179
Глава 5. Базально-клеточный рак кожи 183
5.1. Связь между подверженностью кожи инсоляции, частотой возникновения базально-клеточного рака кожи и клинико-морфологическим вариантом опухоли 183
5.2. Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул в коже пациентов с базально-клеточным раком 185
5.3. Экспрессия сигнальных молекул иммунной системы в коже пациентов с базально-клеточным раком 189
5.4. Сигнальные молекулы неироиммуноэндокринной системы кожи и маркеры пролиферации и апоптоза опухолевых клеток 191
5.4.1. Корреляция между экспрессией хромогранина А, мелатонина и пролиферативной активностью опухолевых клеток 190
5.4.2. Связь между экспрессией нейроэндокринных сигнальных молекул и маркеров апоптоза при базально клеточном раке кожи 194
Глава 6. Обсуждение результатов 197
6.1. Структурно-функциональные особенности неироиммуноэндокриннои системы кожи при старении 198
6.2. Нейроиммуноэвдокринные маркеры старения кожи 238
Выводы 240
Практические рекомендации 243
Указатель литературы
- Представление о неироиммуноэндокриннои системе кожи
- Методы морфологического и иммуногистохимического исследования материала
- Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул клетками кожи при хронологическом старении
- Показатели экспрессии антигенов HLA-DR и CD 1а в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп
Введение к работе
Актуальность проблемы. По мере развития молекулярной медицины, в последние годы, наряду с интегральным биологическим возрастом организма, возникла необходимость определения возраста систем, органов и отдельных клеток. В связи с этим проводится активный поиск комплекса параметров, отражающих функциональную способность ткани, органа или клетки при отсутствии болезни, для обозначения которых используется термин «биомаркеры старения» [G.T. Baker, R.L. Sprott, 1988]. При этом, очевидно, что биомаркеры старения должны отражать фундаментальные биологические процессы, нести информацию о функциональном состоянии органа или ткани и обменных процессах, протекающих в них, а также коррелировать с физиологическим возрастом [О.В. Коркушко и соавт., 2002; R. Arking, 1991; Ingram etal., 2001].
Разработка биомаркеров старения кожи является актуальной проблемой геронтологии и дерматологии. Это связано с тем, что в коже, непосредственно подверженной внешним влияниям, наиболее значимым из которых является ультрафиолетовое облучение (УФО), регрессивные изменения развиваются раньше, чем в других органах (нередко в молодом возрасте), [Д.Е. Фицпатрик, 1999; К. Seharffeter-Kohanek et al, 2000] и своевременное использование эффективных мер профилактики может предотвратить развитие преждевременной или ускоренной инволюции кожи [О.С. Озерская, 2000].
В дерматологии в качестве биомаркера старения чаще всего используют показатели содержания коллагеновых и эластических волокон в папиллярной дерме [J. Uitto, E.F. Peknstein, 1998; A. Ryu, 2000], считая, что они интегрально отражают комплекс изменений основных элементов дермы и характеризуют ее морфо-функциональное состояние. Однако существенным недостатком этого биомаркера является то, что он не отражает состояния
ЦИЛЮГЄКА J
эпидермиса. В связи с этим представляется целесообразным разработать более широкий комплекс морфо-функциональных параметров кожи, учитывающий наряду с показателями содержания коллагеновых и эластических волокон в дерме также и состояние эпидермиса.
Известно, что основными фундаментальными процессами, определяющими постоянство структурно-функциональной организации ткани вообще и кожи, в частности, являются клеточное обновление, цитодифферен-цировка и клеточная гибель [О.Д. Мяделец, В.П. Дцаскевич, 1997]. Координация процессов биосинтеза, обмена и воспроизведения генетической информации в различных клеточных популяциях эпидермиса и дермы осуществляется представленными в коже клетками классических регуляторных систем организма - нервной, иммунной и эндокринной, формирующими локальную нейроиммуноэндокринную систему кожи (НИЭСК) [И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон, 2002,2003; L. Misery, 1996; A. Slominski, J. Workman, 2000].
Представление о НИЭСК сформировалось в последнее десятилетие в рамках концепции, о диффузной нейроиммуноэндокринной системе, как. универсальной системе регуляции гомеостаза [I.M. Kvetnoy, 1996 2002]. Особенности взаимоотношений структурных элементов НИЭСК, характер синтезируемых ими сигнальных молекул при действии повреждающих факторов и заболеваниях кожи активно изучаются в последние годы [P. Alard et al, 1999; (XBauer, E. Razin, 2000; A. Jarvikallio et al, 2002, и др.]. Однако структурно-функциональная организация НИЭСК при старении практически не изучена. Выявление возрастных особенностей морфо-функциональной организации НИЭСК, как основной системы регуляции гомеостаза в коже, представляется актуальным и перспективным для более глубокого понимания процессов, происходящих при инволюции эпидермиса и дермы, патогенеза ассоциированных со старением дерматозов и совершенствования методов профилактики и коррекции возрастных изменений кожи.
Цель и задачи исследования
Изучение возрастных особенностей структурно-функциональной организации НИЭСК и определение спектра нейроиммуноэндокринных маркеров хронологического и индуцированного УФО старения кожи.
В рамках указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы нейроэндокринных сигнальных молекул - серотонина, мелатонина, хро-могранина А и синтазы оксида азота - при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.
Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул иммунной системы — CD35, CD la и HLA-DR— при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.
Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в эпидермисе и дерме при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.
Установить корреляции между морфометрическими изменениями показателей экспрессии нейроэндокринных, иммунных молекул и маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза при хронологическом и фотостарении кожи.
Изучить значение возрастных изменений экспрессии нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул в развитии ассоциированных со старением дерматозов на примере базально-клеточного рака кожи.
Научная новизна работы
Получены результаты, способствующие развитию и углублению представлений о регуляции гомеостаза кожи человека. Выявлены закономерности изменений структурно-функциональной организации компонентов
НИЭСК при хронологическом и индуцированном УФО старении (фотостарении) кожи.
Впервые обнаружена конституциональная экспрессия мелатонина и его основного предшественника серотонина клетками базального слоя эпидермиса, а также мелатонина и хромогранина A (CgA) тучными клетками дермы.
Установлено, что динамика экспрессии мелатонина и серотонина кера-тиноцитами и тучными клетками имеет сходный характер при хронологическом и фотостарении кожи. Усиление экспрессии мелатонина и серотонина при фотостарении представляет собой компенсаторно-приспособительные механизмы, направленные на ликвидацию последствий повреждающего действия УФО.
Особенности экспрессии нейроэндокринных сигнальных молекул свидетельствуют о том, что хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением неироэндокриннои активности компонентов НИЭСК. В свою очередь фотостарение характеризуется неоднозначными нейроэндокринными сдвигами: с одной стороны, способность тучных и эн-дотелиальных клеток абсорбировать и синтезировать биологически активные пептиды прогрессивно усиливается с возрастом, с другой, у пожилых пациентов происходит истощение деятельности кератиноцитов по продукции серотонина и мелатонина.
Результаты исследования экспрессии сигнальных молекул иммунной системы свидетельствуют о том, что снижение потенциальной способности клеток, в первую очередь клеток Лангерганса (КЛ) эпидермиса, вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа, хотя и более выражено при фотостарении кожи, но сопровождается компенсаторной гиперплазией в дерме С035-иммунопозитивных клеток и аккумуляцией клеток, экспрессирующих антигены HIA-DR.
Характер возрастной динамики инволюкрина в коже, а также установленные корреляции между показателями его экспрессии и экспрессии антигена КІ67 и CgA указывают на то, что обнаруженные изменения реактивности этого белка отражают особенности гомеостаза кожи, ассоциированные с ее хронологическим и фотостарением. В связи с этим инволюкрин следует расценить как новый перспективный маркер для оценки морфо-функционального состояния кожи при ее старении.
Продемонстрировало, что при хронологическом старении антиапопто-тический потенциал в первую очередь приобретают низкодифференциро-ванные клетки эпидермиса, а при фотостарении - клетки на разных этапах кератинизации.
Результаты регрессионного анализа свидетельствуют о существовании тесных связей между нейроэндокринными и иммунными сигнальными молекулами в коже человека, а также внутриклеточными молекулами, контролирующими процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Впервые зарегистрированы достоверные разнонаправленные корреляции между показателями экспрессии мелатонина и антигена КІ67 (положительная), Bcl-2 и р53 (отрицательные) при хронологическом и фотостарении кожи, а также между показателями экспрессии CgA и антигена CD la (отрицательная) при фотостарении.
Выявлено участие экспрессируемых'клетками НИЭСК сигнальных молекул, в частности CgA, мелатонина, CD 1а и HLA-DR в возникновении ба-зально-клеточного рака кожи. Продемонстрировано, что гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих CgA, и подавление экспрессии клетками кожи антигенов CD la и HLA-DR при фотостарении является предрасполагающим фактором для развития базально-клеточного рака кожи. Показано также, что с появлением нейроэндокринной активности в клетках базально-клеточного рака кожи, в частности экспрессии CgA и мелатонина, происходит снижение темпа роста опухоли.
Практическая значимость работы
Впервые определен спектр молекулярных и нейроэндокринных параметров, отражающих фундаментальные биологические процессы и характеризующих особенности регуляции гомеостаза кожи при ее хронологическом и фотостарении.
Показано, что среди изученных внутриклеточных сигнальных молекул, наиболее полно отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи при ее старении инволюкрин и белки p53,Bcl-2.
В качестве нейроиммуноэндокринных маркеров старения кожи рекомендуется использовать показатели экспрессии CgA, мелатонина, а также антигена CD 1а. Показано, что изменения этих параметров играют важную роль в патогенезе иволютивных процессов в коже и отражают регуляторные особенности кожи при ее хронологическом и фотостарении. Обнаружение разнонаправленных корреляций между показателями экспрессии мелатонина, CgA и антигена CD la, а также молекул, определяющих качественный и количественный состав эпидермиса и дермы, свидетельствует о высокой ценности комплекса этих показателей как биомаркеров старения кожи.
Полученные данные об изменениях структурно-функциональной организации НИЭСК, ассоциированных с хронологическим и индуцированным УФО старением, позволят разработать критерии оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику и коррекцию хронологического и преждевременного старения кожи.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Кератиноциты эпидермиса, тучные и эндотелиальные клетки дермы являются звеньями нейроиммуноэндокринной системы кожи, регулирующей физиологические функции кожи, а продуцируемые ими вещества — сигнальными молекулами для локальной координации межклеточных и межтканевых взаимодействий.
Возрастная инволюция кожи характеризуются морфо-функциональными изменениями структурных компонентов нейроим-муноэндокринной системы кожи, которые носят специфические черты при хронологическом и фотостарении.
Хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением нейроэндокринной и иммунной активности компонентов ней-роиммуноэндокринной системы кожи, а фотостарение характеризуется неоднозначными нейроиммуноэндокринными сдвигами.
Среди изученных параметров возрастные особенности морфо-функционального состояния кожи при хронологическом и фотостарении кожи наиболее полно отражают показатели экспрессии инволюк-рина и белков р53 и Вс1-2, что определяет возможность их использования для оценки биологического возраста кожи.
При хронологическом и фотостарении кожи имеется тесная связь между экспрессией мелатонина, антигена КІ67 и белка р53 в эпидермисе. Со снижением секреции мелатонина, оказывающего питостатическое и антиоксидантное действие, происходит аккумуляция в клетках белка р53, характеризующегося проапоптотическими эффектами, что отражает комплекс приспособительных реакций, направленных на сохранение гомеостаза стареющей кожи.
Фотостарение кожи сопровождается гиперплазией тучных клеток, экс-прессирующих CgA, что является одним из факторов, повышающих риск развития базально-клеточного рака. Возникновение базально-клеточного рака ассоциируется со снижением экспрессии клетками кожи антигенов CD la и HLA-DR.
Апробация и реализация результатов исследования Материалы исследования представлены и доложены на I Российском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления развития ди-
агностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004); III Съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004); XIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт - Петербург, 2004); I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 г.); XXI научной конференции дерматовенерологов "Псевдолимфомы" (Москва, 2004 г.); на научно-практической конференции, посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 100-летаю больницы им. Императора Петра Великого (Санкт-Петербург, 2003 г.); на ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава СПбГМА им. И. И. Мечникова (Мечниковские чтения) (Санкт-Петербург, 2001-2004 гг.)
Материалы исследования используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова МЗ и СР РФ.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 1 монография.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 275 станицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 15 таблиц и 68 рисунков, в том числе 18 монтажей,
скомпонованных из 40 микрофотографий. Список литературы включает 306 источника, из них 257 иностранных авторов.
Представление о неироиммуноэндокриннои системе кожи
Следует отметить, что кожа разных частей тела стареет с неодинаковой скоростью, которая в значительной мере определяется степенью ее подверженности внешним воздействиям. Наиболее значимым экзогенным фактором является УФИ. В связи с этим выделяют естественное или хронологическое старение кожи, представляющее собой проявления нормальной зрелости, характерной для всех людей [Фицпатрик Д.Е., 1999], и фотостарение, включающее комплекс изменений вследствие кумулятивного воздействия УФО [Фицпатрик Д.Е., 1999; Krutmann J., 2001; Seharffeter-Kohanek К. et al., 2000]. Оба процесса -хронологическое и индуцированное УФО старение кожи - затрагивают все ее отделы и производные. Кроме того, оба процесса характеризуются специфическими клиническими проявлениями, функциональными и морфологическими особенностями [Фицпатрик Д.Е., 1999; Хертель Б., 2000; Lavker R.M. et al., 1987; Yaar M., Gichrest B.A., 1998].
Так хронологическое старение кожи клинически выражается в ее небольшом истончении и сухости, уплощении нормального кожного рисунка. Проявления фотостарения, называемые солнечной геродермией или дерматогелиозом [Фицпатрик Д.Е., 1999], представляют собой синдром, включающий атрофию и сухость кожи, гиперплазию сальных желез, солнечный кератоз, старческое лентиго, стойкие телеангиэктазии и геморрагическую сыпь, солнечный эластоз (утолщение кожи с образованием желтоватых папул и бляшек), а таюке комедоны, особенно в периорбитальной области (болезнь Фавра-Ракушо).
В качестве морфологических маркеров старения кожи чаще всего используют показатели содержания коллагеновых и эластических волокон в дерме [Gogly B.et al., 1997; Miachi Y., Ishikawa O., 1998; Krutmann J., 2001]. Считают, что они интегрально отражают комплекс изменений основных элементов дермы, в частности, особенностей синтеза фибробластами матричных протеинов и активности ферментов, участвующих в их полимеризации и деградации [Miachi Y., Ishikawa О., 1998]. В этой связи важно подчеркнуть, что динамика содержания коллагеновых волокон имеет сходный характер при хронологическом и фотостарении кожи, а эластических волокон - разнонаправленный.
Так при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи, происходит снижение количества коллагеновых волокон в дерме и образование ковалентных связей между ними [Miachi "Y., Ishikawa О., 1998, Uitto J., Peknstein E.F., 1998, Ryu A., 2000]. Однако при фотостарении эти изменения более выражены. Морфометрические исследования кожи живота пациентов разных возрастных групп (от 10 до 75 лет) выявили прогрессивное уменьшение доли соединительной_ткани, содержащей коллагеновые волокна [Gogly B.et al., 1997], достигающее существенных значений уже к 50 годам. При этом происходит параллельное снижение коллагена I и III типов и изменение соотношения коллагена III типа к коллагену I типа, коррелирующие с возрастом пациентов. По другим данным [Gogly B.et al., 1997; El-Domiaty M.et al., 2002] существенное уменьшение коллагеновых волокон на закрытых участках кожного покрова отмечается только на восьмой декаде жизни. В тоже время в коже, подверженной хронической инсоляции, интенсивность иммуноокрашивания коллагена снижается с 82,5% до 80,4% уже на первой и до 44,1% - на девятой декаде жизни, а значительные нарушения архитектоники коллагеновых волокон на лице определяются в возрасте 40 лет [De Backer СМ. et al., 1998; El-Domiaty M.et al., 2002]. Предполагают, что эти изменения могут быть результатом подавления экспрессии гена коллагена, опосредованного через транскрипционный фактор АР-1, содержание которого в фибробластах повышается при действии ультрафиолетового излучения (УФИ) [Fisher D.J., Voorhees J J., 1998; Voorhees J.J., 2000].
Усиление деградации коллагеновых волокон происходит за счет повышения активности матричных металлопротеиназ (ММП), индуцированного средними и длинными ультрафиолетовыми волнами [KrutmannJ., 2001]. Точная роль транскрипционных факторов, в первую очередь АР-1, в развитии этих эффектов установлена только средних волн ультрафиолета. Известно, что клетки кожи человека экспрессируют три типа металлопротеиназ: ММП-1 (коллагеназу-1), ММП-8 (коллагеназу-2) и ММП-13 (коллагеназу-3), причем УФО усиливает экспрессию первых 2 типов [Fisher G.J.et al., 2001]. При этом ММП-1 синтезируется преимущественно фибробластами, а основной популяцией клеток, продуцирующей , ММП-8, являются нейтрофилы. УФО культуры фибробластов в течение 2 часов значительно стимулирует экспрессию мРНК ММП-1 и последующий синтез фермента [Yin L.et al., 2001]. А исследования in vivo продемонстрировали повышение- проэнзима ММП-8 в папиллярной дерме уже через 8 часов после однократного УФО двумя минимальными эритематозными дозами, что ассоциируется с нейтрофильной инфильтрацией дермы. Результатом частичной дегенерации коллагеновых волокон дермы является снижение на 40% интактного пропептидного остатка проколлагена III в фотоповрежденной коже [Хертель Б., 2000].
Методы морфологического и иммуногистохимического исследования материала
Эндокринная система кожи представлена принадлежащими к APUD-системе клетками Меркеля (KM) [Pearse A.G.E., 1980], функция которых связана с синтезом и секрецией пептидных гормонов, биогенных аминов и нейропептидов [Fantini F., Johansson О., 1995; Tachibana Т., 2002; Halata Z.et al., 2003].
Кроме того, в последние годы установлено, что к секреции биологически активных пептидов в ответ на специфические стимулы способны практически все клеточные популяции эпидермиса и дермы [Slominski A., Wortsman J., 2000]. В этом аспекте кожа обладает мощными эндокринными свойствами. Так, кератиноциты и меланоциты, К Л, фибробласты,. эндотелиальные клетки сосудов, Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, тучные клетки и фибробласты вырабатывают пептидные гормоны, биогенные амины, нейротрансмиттеры и нейропептиды, идентичные таковым в центральной нервной и эндокринной системах [Misery К, 1996, 1997, 1999; O Salivan R.L. et al., 1998; Slominski A., Wortsman J., 2000; Zoubolish C.C., 2000]. Это свойство клеток, имеющих различное гистогенетическое происхождение и выполняющих разнообразные функции, проявляется при воздействии стимулирующих (стрессорньтх) факторов. Последние специфически активируют генетический аппарат клеток, что ведет к частичной или полной реализации их секреторного потенциала [Угрюмов М.В., 1999; Kvetnoy I.M. et al., 1997; Day R., Salzet M., 2002].
КМ принадлежат к эндокринной APUD-системе и являются частью НИЭСК [Fantini F., Johansson О., 1995; Tachibana Т., 2002]. В эпидермисе КМ локализуются в базальном и шиповатом слое, а также формируют конгломераты в эпителии наружного волосяного влагалища. Основная часть КМ образует ассоциации с окончаниями нервных волокон, дисками Меркеля (Merkel cell- neurit complexes) [Halata Z. et al., 2003].
Известно, что апудоциты, локализующиеся в различных органах, характеризуются рядом специфических особенностей — цитохимических и ультраструктурных признаков, отличающих их от других видов клеток [Райхлин Н.Т. и соавт., 1993, 2000; Kvetnoy I.M. et al., 1997]. Специфичность этих признаков связана с процессом их биохимической дифференцировки и репрессией части генома, обеспечивающей функционирование механизмов синтеза биогенных аминов и пептидных гормонов.
Ультраструктурной особенностью апудоцитов является наличие специфических гранул с плотной сердцевиной и светлым ореолом [Райхлин Н.Т. и соавт., 1993, 2000; Launay J.M., 1983; Kvetnoy I.M. et al., 1997]. В них происходит образование и хранение пептидных гормонов и биогенных аминов. В КМ секреторные гранулы сосредоточены в участках цитоплазмы, обращенных к нервным терминалям, в них идентифицированы метионин-энкефалин, вазоактивный интестинальный пептид (VIP), вещество Р (SP), пептид, ассоциированный с геном кальцитонина (CGRP), нейропептид Y (NPY), нейрокинин A (NKA), соматостатин (SOM) и некоторые другие [Hartschuh W. et al., 1989; Fantini F., Johansson O., 1995; Tachibana Т., 2002]. Считают, что нейропептиды, секретируемые КМ, оказывают широкий круг эффектов по регулированию гомеостаза эпидермиса. Они участвуют в механорецепции, контролируют пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, а также обеспечивают выживание кератиноцитов и меланоцитов после действия повреждающих факторов [Vos P. et al., 1991].
Среди цитохимических характеристик клеток APUD-системы экспрессия хромогранинов, синаптофизина, нейрон-специфической энолазы, а также ферментов метаболизма гормонов и биогенных аминов — SPC2 и SPC3 (Subtilase-like Pro-protein Convertases) [Day R., Salzet M., 2002]. Причем наиболее специфичным маркером апудоцитов считают хромогранины-А (CgA), -В (CgB) и секретогранин, принадлежащие к группе кислых секреторных протеинов. Их иммунореактивность ассоциирована с гранулами APUD-клеток.
Физиологические функции этих белков четко не установлены [Hutter W.B., 2004]. Предполагается, что CgA участвует в биосинтезе секреторных гранул и укладке в них пептидов [Loh Y.P. et al., 2004; Hutter W.B., 2004]. CgB способен модулировать процессинг пептидных гормонов [Feldman S.A., Eiden L.E., 2003], поскольку выступает в качестве конкурентного субстрата для протеолитических ферментов. Кроме того, он может играть роль ауто- или паракринного регулятора процесса секреции. В КМ иммунопозитивная реакция к Cg [Hartschuh W. et al., 1989], нейрон-специфической энолазе и синаптофизину [Ortorme J.P. et al., 1988] по данным разных авторов выявляется с непостоянной частотой.
КМ способны поглощать предшественников биогенных аминов и подвергать их декарбоксилированию [Hartschuh W. et al., 1989], свойство, положенное в основу аббревиатуры «APUD» {Amine Precusor Uptake and Decarboxilation) [Pearce A.G.E., 1969] и характерное для всех апудоцитов [Boyd C.A.R., 2001]. Исследования, проведенные в последние годы, доказали [Blackmore C.G., 2001], что поглощение предшественников биогенных аминов эндокринными клетками определяет особенности синтеза и секреции ими пептидных гормонов и биогенных аминов. Так, известно, что процессинг этих веществ осуществляется эндопептидазами внутри секреторных гранул. Поскольку ферменты высоко чувствительны к уровню рН, то и продукция биологически значимых пептидов зависит от кислотности внутри везикул. Было продемонстрировано, что уровень рН в секреторных гранулах саморегулируется клеткой путем поглощения предшественников биогенных аминов. Их транспорт через мембрану гранул происходит с помощью системы, осуществляющей согласованный перенос в противоположном направлении протонов. Это ведет к изменению кислотности внутри органелл и ассоциируется с изменением процессинга прогормонов, их расщепления и, следовательно, определяет особенности конечных продуктов секреции. Таким образом; связь между двумя феноменами - поглощением предшественников биогенных аминов и синтезом пептидных гормонов - определяется наличием у них единого молекулярного механизма.
В тоже время в последние годы внимание исследователей привлекает выраженная гетерогенность популяции КМ, в том. числе и по способности секретировать нейропептиды [Fantini F., Johansson О., 1995; Tachibana Т., 2002]. Так исследование экспрессии нейрохимических веществ в КМ человека установило, что их наиболее стойкими маркерами являются нейрон-специфическая энолаза, которая характерна для клеток неврального или нейроэктодермального происхождения и относительно специфична для апудоцитов. Экспрессия нейропептидов КМ также значительно варьирует по интенсивности и числу иммунопозитивных клеток, а предположение об их использовании в качестве трансмиттеров механорецепции, одной из функций активно обсуждаемых в связи с КМ, пока не нашло фактических подтверждений.
Кроме того, наряду с КМ, формирующими ассоциации с нервными терминалями - дисками Меркеля - и предположительно выполняющими механорецепторные функции, имеются клетки, располагающиеся свободно [Halata Z. et al., 2003]. Их роль остается неизвестной. В местах типичной локализации КМ в эпидермисе были обнаружены светлые клетки овальной формы, содержащие гранулы, расположенные не на периферии, а в непосредственной близости к аппарату Гольджи [Tachibana Т., 2002; Halata Z. et al., 2003]. Они также отличаются наличием вытянутого (а не лобулярного) ядра с множественными порами и практически не образуют отростков. На основании этих и некоторых других фактов авторы исследования выдвигают гипотезу о существовании популяции клеток, подобных KM (Merkel cell - like cells) [Halata Z. et al., 2003], и предполагают, что именно их следует считать компонентами эндокринной APUD-системы.
Таким образом, вопрос о принадлежности КМ к эндокринной APUD-системе и физиологической роли, продуцируемых ими биологически активных пептидов, окончательно не решен.
Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул клетками кожи при хронологическом старении
Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к серотонину выявила диффузное окрашивание клеток базального слоя эпидермиса. Характерной особенностью иммунореактивности базальных кератиноцитов была более выраженная иммунопозитивная реакция в их апикальном полюсе (рис. 3 А).
Поскольку серотонин является главным предшественником мелатонина можно предположить, что синтез и экспрессия второго биогенного амина осуществляются теми же клетками. Действительно, иммунопозитивная реакция к мелатонину определялась в базальном слое эпидермиса, но отличалась фокальным характером окрашивания клеток, что отражалось в некотором уменьшении площади его экспрессии по сравнению с соответствующим индексом серотонина (табл. 7, рис. З Б). В тоже время показатели оптической плотности имму но окрашивания мелатонина были несколько выше, чем серотонина. Кроме того, клетки, экспрессирующие мелатонин, были обнаружены в дерме. Они имели локализацию и морфологию, аналогичную таковым клеток, окрашиваемых антителами к CgA (рис. 3 В, Г). Электронно микроскопическое исследование подтвердило их мастоцитарный фенотип (рис. З Д). Следует отметить, что в большинстве исследованных случаев имелась обратная зависимость между интенсивностью иммуноокрашивания клеток эпидермиса и дермы антителами к мелатонину: выраженная иммунопозитивная реакция тучных клеток определялась на участках кожи, характеризующихся практически полным отсутствием таковой в кератиноцитах, и наоборот. Эти данные предполагают способность мастоцитов активно абсорбировать мелатонин, синтезированный и секретированный клетками эпидермиса.
Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование впервые обнаружило экспрессию мелатонина и серотонина клетками эпидермиса кожи человека in situ. Известно, что оба вещества играют важную роль в нейроэндокринной регуляции процессов жизнедеятельности органов и тканей, в том числе клеточного пролиферации. В связи с этим особого внимания заслуживает факт их экспрессии клетками базального слоя, образованного активно пролиферирующими полустволовыми клетками и редко делящимися стволовыми клетками [Lavker R.M., Sun Т.Т., 2000].
Динамика показателей экспрессии серотонина и мелатонина при хронологическом старении кожи Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить количественные параметры экспрессии изученных биогенных аминов в эпидермисе и дерме в процессе хронологического старения кожи.
При хронологическом старении кожи отмечалась тенденция к снижению количества клеток, экспрессирующих серотонин и мелатонин. При этом график зависимости показателей площади экспрессии изучаемых веществ от возраста пациентов несколько отличался от прямолинейного (рис. 4). Так, количество клеток, синтезирующих мелатонин и серотонин, оставалось стабильным до 55 лет, после чего плавно снижалось, достигая статистически значимых различий с показателями молодых (19 -27 лет) у пациентов старше 60 лет (8,17 ± 0,03 % по сравнению с 10,82 ± 0,26 %, р 0,001 и 10,16 ± 0,31 по сравнению с 11,94 ± 0,15, р 0,001, соответственно, табл. 7, рис. 5). Изменения обоих показателей коррелировали с возрастом пациентов, старше 40 лет (г= -0,76 и г= -0,78, соответственно, F 0,0001, рис. 6).
Результаты морфометрических исследований экспрессии мелатонина в дерме продемонстрировали, что в то время как число CgA-иммунопозитивных тучных клеток существенно не изменялось, количество мастоцитов, окрашиваемых антителами к мелатонину, с возрастом снижалось.
Заметное уменьшение количества мелатонин-иммунопозитивных тучных клеток определялось в коже пациентов старше 50 лет и составляло 211,59 ± 6,59 клеток в 1мм дермы, а после 60 лет - 205,66 ± 5,0 клеток в 1мм" дермы (по сравнению с 269,02 ± 15,87 клеток у пациентов 19 - 27 лет, соответственно, р 0,001, табл. 7, рис. 3).
Возраст Рис.6. Отрицательные корреляции между площадью экспрессии серотонина (А) и мелатонина (Б) и возрастом пациентов старших возрастных групп при хронологическом старении кожи. Наличие сильной достоверной связи между динамикой показателей площади экспрессии мелатонина в эпидермисе и количеством иммунопозитивных к нему мастоцитов в дерме (г= +0,66, F 0,0001, рис. 7) позволяет предположить, что уменьшение числа последних отражает ассоциированное с возрастом снижение синтеза и секреции этого биогенного амина кератиноцитами, а, следовательно, и его абсорбции мастоцитами.
Показатели экспрессии антигенов HLA-DR и CD 1а в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению, у пациентов разных возрастных групп
Экспрессия белка р53 выявлена также в клетках дермы (рис. 24 Б). Причем абсолютное число иммунопозитивных клеток и индекс р53 имели тенденцию к увеличению с возрастом пациентов (табл. 10).
Проведенное исследование экспрессии белков Вс1-2 и Мс1-1 в эпидермисе установило, что их иммуноокрашивание характеризуется противоположным градиентом. Слабая иммунопозитивная реакция кератиноцитов с антителами кВс1-2 определялась в цитоплазме клеток базального слоя, на фоне которой имелись единичные клетки с выраженным окрашиванием мембраны или ядра (рис. 26 А). Мс1-1 экспрессировался в цитоплазме кератиноцитов супрабазальных отделов эпидермиса (рис. 26 Б), причем интенсивность его иммуноокрашивания возрастала по мере кератинизации клеток. Зависимая от степени дифференцировки кератиноцитов реципрокная экспрессия белков Вс1-2 и Мс1-1 предполагает, что они выполняют различную роль в регуляции жизнедеятельности клеток многослойного ороговевающего эпителия, каким является эпидермис.
Морфометрический анализ экспрессии белков Вс1-2 и Мс1-1 в эпидермисе пациентов разных возрастных групп обнаружил возрастание показателей оптической. плотности .обоих маркеров при. старении кожи (табл. 9, рис. 27). Анализ графического изображения изученных показателей от возраста пациентов (рис. 25) установил, что рост оптической плотности экспрессии белка Вс1-2 был более существенным, чем Мс1-1: с третьей по седьмую декады жизни они возрастали на 20% и 15%, соответственно (с 2,23 ± 0,08 OpDEC у.е. до 2,96 ± 0,03 OpDEC у.е., р 0,001- и с 2,19 ± 0,02 OpDEC у.е. до 2,57 ± 0,05 OpDEC у.е., р 0,001; табл. 9). Параллельно более чем на 15% увеличился индекс Вс1-2 (с 8,2 ± 0,46% до 9,92 ± 0,11% клеток эпидермиса, р 0,01).
Описанные особенности экспрессии Вс1-2 и Мс1-1 свидетельствуют о преимущественном повышении резистентности к проапоптотическим сигналам менее дифференцированных клеток эпидермиса. Последнее представляется особенно важным в свете данных об отсутствии влияния белка Вс1-2 и кодирующего его гена на пролиферативную активность клеток.
Выявленная тесная корреляция между показателями экспрессии Вс1-2 и КІ67 (г= - 0,89, F 0,001; рис. 28) позволяет считать усиление иммунореактивности первого одним из компенсаторных механизмов, обеспечивающих увеличение продолжительности жизни низкодифференцированных клеток эпидермиса при снижении их пролиферативной активности.
Что касается экспрессии антиапоптотических белков Всі-2 и Мс1-1 клетками дермы, то она характеризовалась существенной вариабельностью количественных показателей (абсолютного числа иммунопозитивных клеток и индексов- Вс1-2 и Мс1-1) в изученных полях зрения. Тем не менее, обращало на себя внимание, что интенсивность иммуноокрашивания. клеток дермы существенно превышала таковую эпидермиса и оставалась на стабильно высоком уровне по мере старения пациентов (табл. 10). Кроме того, отмечена явная тенденция к росту индекса Вс1-2, отражающая повышение в дерме доли клеток, экспрессирующих этот белок.
Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что ассоциирующиеся с хронологическим старением кожи изменения в системе регуляции апоптоза, прежде всего, касаются экспрессии белков р53 и Вс1-2. При этом с одной стороны, в низкодифференцированных клетках эпидермиса отмечается усиление антиапоптотического потенциала, способствующее4 выживанию кератиноцитов, в том числе с поврежденной генетической информацией. С другой, в них- происходит аккумуляция молекул, основная роль которых связана с предупреждением переноса поврежденной генетической информации от одного поколения клеток к последующему.
Экспрессия PCNA обнаружена в нижних отделах эпидермиса, преимущественно в его базальном слое. Со старением кожи ассоциировалось уменьшение как относительного (индекса), так и абсолютного числа PCNA-иммунопозитивных клеток. При, этом; хотя абсолютное количество иммуноокрашенных клеток снижалось, со второй-третьей по седьмую декаду жизни более значимо (на 33% - с 1112,67 ± 34,67 клеток до 841,34 ± 23,12 клеток, р 0,0001), чем индекс PCNA (на 24% - с 15,95 ± 0,65% до 10,76 ± 0,24%, р 0,0001), изменения последнего достигали достоверно значимых различий раньше - уже после 40 лет (табл. 9).
Известно, что молекула PCNA полифункциональна и является кофактором ДНК-полимеразы є, вовлеченной в репарацию генетического материала, и ДНК-полимеразы 5, принимающей участие в синтезе ДНК в пролиферирующих клетках. Поэтому изменения количественных показателей ее экспрессии с возрастом могут отражать ассоциированные со старение изменения в системе репарации ДНК или пролиферативной активности клеток. В связи с этим был проведен корреляционный анализ между показателями экспрессии клетками эпидермиса антигенов PCNA и КІ67, а также белка р53.
Обнаруженная тесная связь между индексами PCNA и КІ67 (г = + 0,85, F 0,0001; рис. 29), отражающими долю иммунопозитивных к антигенам клеток эпидермиса, может свидетельствовать о том, что в коже закрытых участков кожи экспрессия PCNA характерна в первую очередь для пролиферирующих клеток.
![Перекисное окисление липидов и барьерная функция кожи в условиях старения организма [Электронный ресурс]](/i/i/4505/199416.png "Перекисное окисление липидов и барьерная функция кожи в условиях старения организма [Электронный ресурс] Ермакова Екатерина Юрьевна")
