Содержание к диссертации
Введение
1. Материал, методика и условия проведения опытов 13
2. Индуцирование гаплоидии из неоплодотво-ренных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro 21
2.1. Реакция генотипа на индукцию гаплоидии 26
2.2. Влияние стадий развития зародышевого мешка и расположения экспланта на кусте свеклы 37
2.3. Зависимость регенерационной способности неоплодотворенных семяпочек от сроков введения и условий культивирования 44
2.4. Влияние состава питательной среды 48
2.5. Воздействие физическими факторами на экспланты 57
3. Гаплоидия как ускоренный метод создания гомозиготных линий сахарной свеклы 64
3.1. Формирование гаплоидных линий in vitro 65
3.2. Диплоидизация и создание реституционных линий 79
3.3. Метод создания гомозиготных линий сахарной свеклы на основе индуцирования гаплоидии 93
4. Эмбриокультура в системе in vitro 97
4.1. Влияние возраста эксплан та на процесс регенерации в условиях in vitro 101
4.2. Влияние условий культивирования на жизнеспособность зародышей 109
4.3. Возможность применения эмбриокультуры для получения межвидовых гибридов и апомиктичных форм 116
5. Сохранение селекционного материала в условиях in vitro 125
5.1. Влияние состава питательной среды при длительном беспе-ресадочном культивировании 131
5.2. Роль химических ингибиторов при депонировании микроклонов сахарной свеклы 146
5.3. Гистохимическое изучение микроклонов свеклы при длительном беспересадочном культивировании 161
5.4. Рекультивирование растений сахарной свеклы после депонирования 176
6. Особенности морфогенетического развития сахарной свеклы 185
6.1. Пути и способы воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in situ и in vivo 186
6.2. Цитоэмбриологические особенности эмбрио- и эмбриоидо-генеза сахарной свеклы в условиях in vitro 193
6.3. Органообразовательные процессы в условиях in vitro 199
6.4. Анатомо-морфологическое развитие растений сахарной свеклы в условиях in situ и in vitro 211
Выводы 222
Рекомендации 226
Литература 227
- Реакция генотипа на индукцию гаплоидии
- Формирование гаплоидных линий in vitro
- Влияние возраста эксплан та на процесс регенерации в условиях in vitro
- Влияние состава питательной среды при длительном беспе-ресадочном культивировании
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из главных путей дальнейшего повышения продуктивности сахарной свеклы и производства сахара - создание и внедрение высокопродуктивных сортов и гибридов свеклы. Задачи селекции сахарной свеклы за последнее время сильно усложнились в связи с повышением требований производства к ряду признаков и с переходом к использованию регулируемого гетерозиса. В настоящее время необходимы прогрессивные научные решения, которые могли бы позволить максимально использовать эффект гетерозиса и создавать гибриды с высокой продуктивностью и комплексом полезных признаков.
Обычно селекционеры в своей работе применяют традиционные методы селекции - гибридизацию, отборы, полиплоидию, привлечение форм с ци-
топлазмотической мужской стерильностью (ЦМС). Данные методы очень
... '"її
трудоемки, затратны и ведут, как правило, к сужению генетической изменчивости и уменьшению многообразия исходного генетического материала (Кузьмин, Шевченко, Павлюк, 1995). Поэтому проблема получения нового исходного материала для селекции становится актуальной.
Многолетняя же практика показала, что основным направлением в селекции на гетерозис является получение гибридных материалов на основе использования форм с ЦМС. Однако гетерозисная селекция раздельноплод-ной сахарной свеклы с использованием ЦМС требует глубоких теоретических и практических разработок по созданию, изучению исходного материала разных форм, поддержанию материалов прежде всего по хозяйственно-ценным признакам, таким как масса корнеплодов и их сахаристость, устойчивость к болезням, скороспелость, качество семян и т.д.
Дальнейший прогресс в селекции сахарной свеклы требует усовершен-ствования традиционных методов выведения гибридов, разработки прогрес-
5 сивных способов создания компонентов скрещивания, их поддержания и
улучшения в процессе репродуцирования. Для этого необходимы поиск и применение новых нетрадиционных подходов и методов, позволяющих выявлять все потенциальные возможности растительного организма и получать новые формы с искомыми и, с селекционной точки зрения, полезными признаками (Атанасов, 1993).
Данным направлением является биотехнология, представляющая собой ценное дополнение к ряду классических методов селекции и генетики. Применение методов биотехнологии не уменьшает значения методов селекционной практики, а наоборот, способствует ускорению и улучшению селекционного процесса путем расширения генетического спектра полученного исходного материала, оценки и отбора полезных комбинаций, что, в конечном счете, ведет к получению новых сортов с высокими биологическими и хозяйственными показателями.
Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно разделяются на две группы. Первая группа - это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним относятся: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей, органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов и другого материала. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.
Из современных методов биотехнологии в растениеводстве интенсивно развиваются методы культуры клеток и тканей первой группы, а также генетическая инженерия. Во многих странах они достаточно широко используются в селекционно-генетических исследованиях как весьма эффективные. Более того, эти методы являются связующим звеном в экспериментах, проводимых на клеточном и молекулярном уровнях, а также на уровне целых растений.
Приемы биотехнологии и биоинженерии, основанные на данных молекулярной и клеточной биологии, позволяют установить эволюционную общность многих особенностей растительной клетки, моделировать уникальные генотипы и экспериментально исследовать феномен эпигенетической наследственности (Бутенко, 1999).
Все методы биотехнологии базируются на принципах управления системами размножения растений, поскольку именно через размножение реализуется неисчерпаемость биологических ресурсов, эволюция, филогенетическое бессмертие, отбор и становление новых признаков, в том числе желательных для человека (Тырнов, 1998).
В плане практического применения методы биотехнологии позволяют решать задачи получения новых важных форм и линий сельскохозяйственных растений, используемых в селекции на устойчивость, продуктивность и качество, размножения ценных генотипов, оздоровление растений от вирусов и т.д.
Наиболее изученным и широко применяемым методом биотехнологии является микроклональное размножение. Во многих странах мира биоиндустрия микроразмножения поставлена на поточную промышленную основу и представлена десятками активно функционирующих предприятий. Например, во Франции 94% всей продукции цветочных культур получают методом культуры изолированных тканей. В США более 100 комерческих предприятий
7 получают посадочный материал декоративных, овощных, полевых, плодовых
и лесных культур методом клонального микроразмножения. Ведущим производителем оздоровленного посадочного материала цветочных растений является Голландия, а подвоев яблони, сливы, персика - Италия (до 250-500 тыс. ежегодно). В нашей стране также ведутся интенсивные работы по оздоровлению и размножению многих декоративных, плодовых, овощных, древесных и других культур.
Для сахарной свеклы метод микроклонального размножения достаточно хорошо разработан и используется в селекционной практике (Амерханова, Рахимбаев, 1986; Славова, 1988; Ильенко, 1989; Знаменская, Жужжалова, 1989).
Широкое использование другого метода биотехнологии - получение гаплоидов, нашло в связи с быстротой получения гомозиготного материала. Практическая и теоретическая ценность данного метода состоит в том, что гаплоиды можно использовать для получения чистых линий, межвидовых гибридов, линий-восстановителей ЦМС, создания анеуплоидных форм, выявления рецессивных мутаций, проведения трансформации, проведения геномного анализа (картирование хромосом, данные о эволюции и сцеплении генов и т.д. (Атанасов, 1993).
При помощи метода гаплоидии в Канаде получен сорт ячменя Минго, являющися наиболее продуктивным сортом в Онтарио. В Китае получены высокоурожайные (80 ц/га риса) и устойчивые сорта пшеницы и риса, занимающие в 1999 году 170000 га (рис) и 70000 га (пшеница). В России (Одесса, Краснодар, Поволжье) созданы сорта ячменя, тритикале, табака, риса (Бутен-ко, 1999).
Исследования отдельных вопросов по индуцированию гаплоидии методом культуры неоплод отворенных семяпочек (Ильенко, Белоус, 1987; Славова, Рафаилова, 1991; Hosemans, Bossoutrot, 1983,1985; Van Geyt, Speckmann,
8 Halluin, 1987; Gibson Margaret, 1987; Lux, Herrmann, Claudia, 1990; Seman,
Farago, 1990) проводились независимо друг от друга и не дали полного представления о преимуществах метода при получении гомозиготных линий сахарной свеклы.
Вместе с тем полученные в процессе исследований гомозиготные растения сахарной свеклы проходят генетико-селекционную оценку и включены в селекционные программы.
Сочетание методов культивирования зародышей, семяпочек и оплодотворения in vitro открывает широкие возможности для получения ценных комбинаций признаков при внутри- и межвидовой гибридизации. Данные методы способствуют преодолению несовместимости скрещиваемого материала, покоя семян, получению новых форм растений при отдаленной гибридизации и клеточной селекции. Метод эмбриокультуры позволяет проводить исследования по цитоэмбриологии, генетике, физиологии растений. С помощью культуры изолированных зародышей получены межвидовые гибриды различных бобовых культур (Mallikarjuna Nalini, 1999), межвидовые гибриды ячменя и ржи (Aviv, Grosser, 1984), пшеницы и элимуса (Mujeeb-Kazi, Rodrigues, 1981), пшеницы с рожью, эгилопсом (Прилюк, 1984) и другие.
На сахарной свекле аналогичных работ нет.
Сохранение разнообразных коллекций зародышевой плазмы и возможность ее использования в любое время для теоретических и практических целей предоставляет метод криосохранения (нахождение меристематических клеток и тканей в жидком азоте при температуре -196 С). В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур около (10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов) (Сельскохозяйственная биотехнология, 1998).
9 Литературные данные о длительном сохранении микроклонов сахарной
свеклы в условиях in vitro очень ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данного вопроса. Имеются лишь сведения о субкультивировании растений свеклы при пониженных температурах в Нидерландах (Miedema, 1982) и в Германии при добавлении б среду пактобутразола (Lux Horst et.al., 1991). Культура сохранялась в течение 12-24 месяцев.
В последние годы значительное развитие получил метод генной инженерии, представляющий из себя дальнейшее развитие классических методов генетики, а также их ценное дополнение. Для сельскохозяйственного производства генная инженерия призвана создавать новые сорта растений, устойчивые к болезням, гербицидам, насекомым, стрессовым воздействиям. Возможности переноса и экспрессии в растительной клетке различных генов, ответственных за различные стороны метаболизма позволили создать трансгенные растения картофеля с повышенным содержанием глюкозы и фруктозы (Rober et.al., 1996), рапса с повышенным содержанием белка и жирных кислот (Vandekerckhove et.al., 1989), табака, устойчивые к болезням (Anzai, Yoneyama, Yamaguchi, 1989), формы растений, устойчивые к гербицидам (Comai, Sen, Stalker, 1983) и т.д. Получены формы сахарной свеклы, устойчивые к гербицидам (Левенко и др., 1993).
Однако возможности применения известных биотехнологических методов весьма ограничены, т.к. являются узкоспецифичными не только для различных видов растений, но даже для разных этапов культивирования экс-плантов одного вида. Поэтому необходима индивидуальная разработка специфических условий различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять ценный селекционный материал в культуре изолированных тканей и органов такой важной культуры, как сахарная свекла.
В связи с этим возникает потребность теоретического обоснования воспроизведения растений в культуре in vitro с учетом тотипотентности клеток сахарной свеклы.
Поэтому наиболее актуальным является разработка режимов индукции гаплоидных и диплоидных регенерантов при культивировании неоплодотво-ренных семяпочек и зародышей, условий культивирования полученных гаплоидных, реституционных диплоидных и других новых материалов, режимов длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.
Методы гаплоидии, эмбриокультуры и длительного беспересадочного культивирования и их сочетание с традиционными методами селекции позволят повысить репродукционный потенциал системы размножения сахарной свеклы, получать новый исходный материал, обогощенный в генетическом отношении, длительно сохранять ценный генофонд в условиях in vitro и тем самым значительно сокращать селекционный прцесс, а следовательно и период создания новых сортов и гибридов.
Это определяет актуальность и необходимость проведения данной работы.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в разработке биотехнологических методов индукции и сохранения новых форм сахарной свеклы и установлении особенностей морфогенетического развития микроклонов в условиях in vitro.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1 .Определить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов сахарной свеклы из неоплодотворенных семяпочек.
Разработать оптимальные условия получения гаплоидных и реституционных диплоидных линий свеклы в условиях in vitro.
Установить лимитирующие факторы воспроизводства растений при культивировании незрелых и зрелых зародышей сахарной свеклы.
4. Разработать параметры длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.
5.Определить влияние ингибирующих веществ на морфофизиологиче-ское развитие клонов в период депонирования и после него.
6.Изучить пути морфогенеза растений свеклы в условиях in situ и in vitro.
Научная новизна. Впервые установлено влияние эндо- и экзогенных воздействий на индукцию гаплоидии in vitro из неоплодотворенных семяпо-чек. Экспериментально показано, что наибольшей склонностью к индукции гаплоидии обладают материалы от самоопыления и гибридного происхождения. Выявлена положительная корреляция между регенерационной способностью неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro и количественным выражением аномального развития мужских гамет, что может служить маркерным признаком при отборе донорского материала. Получены новые даные о взаимосвязи стадий развития зародышевого мешка с особенностями развития микрогаметофита, что можно использовать при от-боре эксплантов с наибольшей склонностью к индукции гаплоидии. Показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и пониженных температур на формирование гаплоидных структур из неоплодотворенных семяпочек свеклы. Получены оригинальные данные о влиянии физиологически активных веществ по индуцированию адвентивных побегов на гаплоидных проростках, расширяющие существующие представления о значении гормонов при культивировании растений в условиях in vitro. Впервые разработана последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации, микроразмножения гаплоидных и автодиплоидных линий сахарной свеклы. Установлен эффективный режим колхицинирования гаплоидных растений свеклы в условиях in vitro.
Впервые определены методические подходы эмбриокультуры незрелых
зародышей сахарной свеклы, включающие оптимальные стадии развития эксплантов, состав питательной среды и температурно-световой режим культивирования.
Модифицирован состав питательной среды Гамборга , основанный на изменении осмотического, углеводного уровня и добавлении ингибирующих веществ, для беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы. Впервые показаны морфологические и биохимические изменения клеточных структур растений при длительном субкультивировании на ингибирующих средах и дальнейшем их рекультивировании. Экспериментально доказана возможность увеличения продолжительности хранения меристемно-го материала свеклы в течение 12-18 месяцев беспересадочного культивирования на модифицированных средах.
Впервые выявлены и описаны этапы морфогенетического развития адвентивных почек, незрелых и гаплоидных зародышей в условиях in vitro. Изучены и представлены пути морфогенеза при воспроизведении растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro. Определены морфо-анатомические отличия растений свеклы, выращенные в условиях in situ и in vitro, выражающиеся в образовании структурных изменений клеток черешка и листа, проводящей системы и паренхимных тканей.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. Разработанный метод получения гомозиготного материала методом индуцирования гаплоидии в условиях in vitro позволил создать и передать на Льговскую ОСС 12 реституционных линий сахарной свеклы, что подтверждает возможность его использования в практической селекции.
Показано, что культивирование незрелых зародышей может быть использовано для получения растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстановления длительно хранившегося в семенах селекционно-
13 го материала. С помощью данного метода восстановлены, размножены и переданы селекционерам ВНИИСС 9 линий (семена урожая 1981 года).
Для создания коллекции генофонда сахарной свеклы разработан метод длительного беспересадочного культивирования микроклонов на модифицированных питательных средах, позволяющий в течение длительного периода сохранять ценные селекционные генотипы в условиях in vitro. Данным методом в течение 3-х лет сохранялись 28 селекционных номеров, а затем 12 из них были переданы селекционерам для дальнейшей работы.
Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в ВУЗах. Полученный в результате изучения новый исходный материал сахарной свеклы также может использоваться в дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях
На защиту выносятся следующие положения.
1. Экспериментальное обоснование воздействия эндогенных и стимуляции экзогенных факторов на регенерационную способность неоплодотво-ренных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro для получения гаплоидов.
2.Процесс формирования гаплоидных, автодиплоидных линий зависит от гормональной нагрузки питательной среды и морфогенетического развития регенерантов.
З.Регенерационная способность незрелых и зрелых зародышей в условиях in vitro определяется генотипическими различиями донорского материала, условиями культивирования (гормональный и углеводный состав среды, температурно-световой режим), стадией дифференциации тканей незрелых зародышей.
4.Установленные воздействия модифицированного состава питательной среды на рост и развитие микроклонов сахарной свеклы при субкультивиро-
вании позволяют увеличивать беспересадочный период и сохранять в чистоте
селекционный материал в виде меристемных коллекций в течение длительного времени (2-5 лет).
5.Регуляция морфобиохимических изменений в росте, развитии и жизнеспособности эксплантов в период депонирования и после него обеспечивают высокую выживаемость и способность к дальнейшему размножению микроклонов сахарной свеклы.
6. Система воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro.
Реакция генотипа на индукцию гаплоидии
Индукция гаплоидных регенерантов в культуре неоплодотворенных семяпочек является сложным, не до конца изученным процессом. На него оказывает влияние целый комплекс лимитирующих факторов. Часть из них является эндогенными: генотип исходного материала, физиологическое состояние доноров, стадии развития женского гаметофита. Другая часть факторов, влияющая на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек, искусственно создается исследователями и относится к экзогенным. В комплекс таких факторов входят: сезонность выращивания донорского материала и время введения в культуру in vitro, состав питательной среды, условия культивирования и т.д. Многообразие лимитирующих факторов отрицательно сказывается на
индукции гаплоидии у сахарной свеклы, эмбриогенная способность семяпочек которой пока не превышает 30% (Славова, Рафаилова, 1988).В связи с этим возникает необходимость исследования всего комплекса вопросов, касающихся индукции гаплоидов.
Генотип растения - один из наиболее эффективных факторов, оказывающих влияние на выход гаплоидных растений в культуре репродуктивных органов. Не только внутри рода, но и сорта одних и тех же видов обнаруживают при культивировании неоплодотворенных семяпочек различную способность растений к регенерации (Бутенко, 1975; Павлова, 1987).
При этом возникающие различия на всех этапах получения гаплоидов в культуре in vitro и каждая ступень имеет свою генетическую основу (Дьячук, Дьячук, 1989). Зависимость формирования гаплоидов от генотипа исходной формы в культуре неоплодотворенных семяпочек показана практически для большинства изучаемых культур (Русина и др., 1985; Wu,Chen,1982; Truong-Andre, Demarly,1984). Отмечая важную роль генотипа в индукции гаплоидных растений, некоторые; исследователи склонны считать, что генотип является главным лимитирующим фактором при получении гаплоидов через культуру генеративных органов (Бутенко, 1975; Новак, 1986; Sitbon,1981).
Вероятность получения гаплоидов у различных форм сахарной свеклы не одинакова (Ильенко, 1989) и в значительной степени зависит от генетических особенностей донорского материала (Зубенко и дрю, 1991; Speckmann et.al.,1986;Luxet.al.,1990).
В наших исследованиях формирование новых структур из неоплодотворенных семяпочек свеклы в условиях in vitro происходило почти на всех изучаемых генотипах, но направление морфогенетического развития семяпочек (эмбриоидогенез или каллусогенез) и частота возникновения гаплоидных регенерантов определялись генотипом.
Самую низкую регенерационную способность показали формы с ЦМС и сорта - популяции, частота образования гаплоидов у которых составила в среднем 2,0% (рис.1). Фертильные линии и гибридные комбинации с участием этих линий имели более высокую склонность к индукции регенерантов, количество которых достигало 3,1% и 4,9%. Наибольшая частота формирования гаплоидов наблюдалась у селекционного материала, подверженного ин-цухтированию - 5,5%.
Наши данные находят подтверждения в экспериментах других исследователей (Zagorska et.al., 1998; Chekurov, Rarmarhnin, 1999), отметивших повышение регенерационной способности у гетерозиготного материала в сравнении с линейным.
Частота каллусогенеза при индукции гаплоидии у сахарной свеклы в общем не превышала величины эмбриоидогенеза, за исключением у МС-форм. По-видимому, повышенное количество каллусных структур появлялось на местах поранения семяпочек МС растений, отличающихся очень малень 31 кими размерами. Среди форм различного селекционного материала склонность к индукции гаплоидии колебалась в достаточно широких пределах. Выход гаплоидных проростков от доноров линейного происхождения составлял 0,6 - 5,9%, от гибридных материалов -до 10,5% (табл.1).
Поскольку формирование женского гаметофита генетически связано с процессами дифференциации мужского гаметофита, то для индукции гаплоидии мы провели поиск маркерных признаков донорского материала. Согласно теории Т.Б.Батыгиной (1987) генотипы с наибольшими отклонениями в формировании генеративных органов имеют большую склонность к индукции гаплоидии в культуре in vitro.
Проведенное нами цитологическое изучение линейного материала позволило обнаружить значительные изменения при формировании мужского гаметофита. Если прохождение мейоза в пыльниках растений сорта Рамон-ская односемянная 9 проходило нормально по симультанному типу с расположением веретен деления под углом друг к другу, то у линий РФ 358и 1338 наблюдались существенные отклонения в ходе мейотического деления. Характерным для мейоза указанных линий являлось нарушение функций веретена.
Образование монад, диад, триад в телофазе 11 Цитологическое изучение показало наличие аномальных пыльцевых зерен, количество которых варьировало от 4,6 до 17,6%, а у отдельных растений достигало 27,0%.
Такая пыльца часто имела несколько спермиев или микроядер. Стерильные микроспоры представляли образования в виде цепочек и других конфигураций (рис.5,6), что связано с нарушением прохождения цитокинеза в период формирования мужского гаметофита.
Наличие фракции крупных (нередуцированных) пыльцевых зерен отмечено многими исследователями у различных культур: у сливы (Воробьев, Исачкин, Сильченко, 1999), картофеля (Souter, Dawe, Peloquin, 1980; Абрамова, 1989; Подлисских, Подлисских, Аношенко, 1999), сахарной свек
Формирование гаплоидных линий in vitro
Одним из этапов гетерозисной селекции является создание гомозигот-ных линий, обладающих, высокой комбинационной способностью. У самоопыляющихся культур необходимость создания таких линий отпадает, так как вследствие естественного самоопыления каждый сорт представляет собой линию.
Сорта перекрестноопыляющихся культур гетерозиготны. Гомозиготные линии из таких сортов получают путем принудительного самоопыления и отбора константных форм, обладающих высокой комбинационной способностью.
Создание линий методом самоопыления - очень трудоемкий и длительный процесс. Кроме того, самоопыление сортов популяций в большинстве случаев оказывает сильное отрицательное воздействие на растения: уменьшается число завязавшихся семян, снижается фертильность пыльцы, скорость роста, размеры и мощность растений. Иногда в результате сильной инцухт-депрессии потомство гибнет, растения оказываются нежизнеспособными (Добросотсков, 1983). Кроме того, у перекрестноопыляющихся культур (в частности у сахарной свеклы) часто наблюдается явление самонесовместимости, что не позволяет получать линии от самоопыления.
В настоящее время широкое применение нашел способ получения гомозиготных линий методом культивирования генеративных органов. Полученные таким методом гомозиготные реституционные диплоиды в генетическом отношении являются эквивалентами линий, полученных длительным самоопылением. Одно из преимуществ использования гомозиготных реституционных линий состоит в сокращении времени (в 2-3 раза) и затрат труда на их получение в сравнении с традиционным методом самоопыления (Хохлов, 1976). Другим преимуществом является то, что увеличение изменчивости признаков за счет гомозиготации позволило не только улучшить ранее созданные сорта и популяции (Gallais, 1978), но и создавать новые при рекуррентной селекции.
Ряд авторов (Головин, 1977; Doussinault Gerard, 1983) отмечают, что гибриды с участием полигаплоидных линий по ряду хозяйственно - ценных признаков не уступают лучшим гибридам, полученным традиционным методом.
Эффективность использования таких линий в селекции прежде всего определяется способностью гаплоидов индуцировать новую генетическую изменчивость, которая не отмечается при обычном получении чистых линий путем самоопыления. Гибридизация полигаплоидов также приводит к большей изменчивости по сравнению с гибридизацией инцухт - линий.
Проведенные нами исследования в процессе формирования линий показали, что с одного растения сахарной свеклы в культуру можно ввести 200 -250 неоплодотворенных семяпочек. Но количество семяпочек, дающих гаплоидные регенераты, незначительно, и колеблется от 0 до 13%. Так, напри 68 мер, у различных растений одного генотипа РФ 15 было получено от 2 до 13 гаплоидных проростков (табл. 15).
Каждый такой регенерант с отдельно взятой семяпочки является родоначальником будущей гаплоидной линии, формирование которой зависит от дальнейшей способности растения нормально развиваться, а также от последовательности используемых культуральных сред (Bossoutrot, Hosemans, 1985). Наиболее ответственным этапом при дальнейшем культивировании полученных гаплоидных регенерантов является период стабилизации ростовых процессов у индуцированных гаплоидов, отборе наиболее жизнеспособных, активно растущих и хорошо размножающихся растений.
В зависимости от генотипа гаплоиды по-разному реагировали на изменяющиеся факторы внешней и внутренней среды. Реакцир регенерантов на смену питательной среды была однозначной у большинства генотипов и выражалась в незначительном образовании дополнительных побегов в первый месяц культивирования (рис. 21).
Рост и развитие микроклонов от донора РФ1338 происходили активно, что позволило к 4 пассажу получить 113 растений. Гаплоиды от РФ 358 (фертильная и стерильная формы) имели пониженную активность размножения, что повлекло за собой необходимость изменения питательной среды для данного генотипа.
Основная же масса гаплоидных генотипов проходила процесс стабилизации в течение 3-4 пассажей и имела достаточное количество размноженного материала.
Предложенная Н.А. Таратоновым (1999) схема стабилизации гаплоидов, включающая два пассажа на ростовую питательную среду (ГК, Кн, БАП по 0,2 и 0,1 мг/л), позволяет сократить время адаптации и микроразмножения полученных регенерантов. Данный метод способствует сохранению 87,5% гаплоидов, полученных на индукционной среде с 2 мг/л гиббереллина. Включение в индукционную среду других гормонов - 6-БАП, кинетина, ИМК вместе с гиббереллином приводит к несоответствию гормонального баланса растений и содержания фитогормонов в искусственной питательной среде. Поэтому для повышения жизнеспособности и активизации роста и развития полученных регенерантов мы установили наиболее благоприятное чередова 73 ниє гормональной и безгормональной питательной среды в период стабилизации, исключающее отрицательное влияние ростовых веществ на растения.
Получение гаплоидных растений на средах с комплексом гормонов (ГК -2 мг/л, 6-БАП - 0,2 мг/л, ИМК - 0,1 мг/л) происходило как путем прямой регенерации, так и путем формирования вторичных регенерантов (адвентивных побегов) на структурно измененных тканях проростков. Нормально развитые регенераты проходили этап стабилизации при выживаемости 77,7% (табл. 18).
Влияние возраста эксплан та на процесс регенерации в условиях in vitro
Краеугольным камнем любой селекционной программы является расширение диапазона генетической изменчивости с целью отбора или введения желаемых признаков для улучшения возделываемых сортов сельскохозяйственных культур. Половая гибридизация является одним из средств при создании генетического разнообразия исходного селекционного материала. Однако лишь ограниченное число межвидовых и межсортовых скрещиваний может привести к получению полноценных гибридных растений.
Поэтому для эффективного получения определенной генетической комбинации желаемых признаков традиционными способами был разработан метод эмбриокультуры, позволяющий в условиях in vitro выращивать регене-ранты из зиготических зародышей на различных стадиях их развития.
Наиболее важным аспектом применения эмбриокультуры является получение различных гибридов. Невозможность осуществления некоторых скрещиваний очень часто связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что, в свою очередь, может быть обусловлено либо его ранней гибелью, либо дегенерацией эндосперма.
С помощью культуры развивающихся зародышей были получены межвидовые гибриды чины посевной, фасоли обыкновенной, клевера, люцерны посевной и т.д. (Кожахметов, Исаков, Алимгазинова, 1997; Bajaj, Gosal, 1982; MallikarjunaNalini, 1999).
Эмбриокультура широко используется в селекции как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации, помогая преодолеть постгамную несовместимость. С привлечением метода культивирования изолированных зародышей получены гибриды ячменя и ржи (Aviv, Grosser, 1984), пшеницы и элимуса (Mujeeb-Kazi, Rodriguez, 1981), пшеницы с рожью, эгщюпсом (При-люк, 1984, Слесаравичус, Дабкявичинс, 1984).
В последние годы в исследованиях по отдаленной гибридизации метод эмбриокультуры применяется для микроразмножения ценных гибридных растений. Это связано с тем, что при отдаленных скрещиваниях формируется очень ограниченное количество семян и гибриды часто бывают стерильными. Сущность метода состоит в том, что незрелые зародыши или части зрелого зародыша культивируются на средах, вызывающих формирование морфоген-ного каллуса или адвентивных побегов.
Так в культуре незрелых зародышей гречихи посевной (Лукина, Румянцева, 1999) и семядолей зародыша чая (Rao et.all, 1982) гибридные растения были получены путем активации меристематических очагов каллусов гормонами питательной среды. Индуцирующее влияние гормонов (в основном 6-БАП и 2,4-Д) приводило к появлению соматического эмбриогенеза у зародышей ячменя (Дунаева и др., 2000; Whelan, Aallo-Meagher, 1996) и кокосовой пальмы (Chan et.all, 1998). При этом число регенерантов на один зародыш составляло 20-40.
Культуру зародышей также используют для преодоления покоя семян. В качестве примера можно привести семена дикой формы культурного банана - Musa balbisiana Colla, не способные к прорастанию в естественных условиях. Желая получить проростки, Кокс с соавторами (1960) культивировали изолированные зародыши in vitro.
Получение сеянцев лишь через эмбриокультуру возможно у клубнеплодных растений Calocasia autiquarum и С. esculentum, у древесных -Magnolia soulangeana.
В литературе также имеются сведения о сокращении продолжительности жизненного цикла (от семени до цветения) ириса благодаря культивированию зародышей (Raghavan, 1979).
В настоящее время перспективно получение гомозиготных линий различных культур с использованием при гибридизации гаплопродюссера. Так при скрещивании двух видов ячменя Hordeum vulgare и Н. bulbosum в зародышевом мешке происходит элиминация (исчезновение) хромосом Н. bulbosum, в результате чего получаются гаплоидные зародыши Н. vulgare, которые впоследствии диплоидизируются. Своевременная изоляция зародышей в культуре in vitro и успешная диплоидизация полученных растений дает возможность создавать гомозиготные линии, которые представляют собой ценный исходный материал для селекции .Этим методом были получены гомозиготные диплоидные линии ячменя, пшеницы, ржи, кукурузы (Петров и др., 1982; Subrahmahuam, 1979; Bothmer et. all, 1984).
Аналогично были получены гомозиготные линии пшеницы посредством гибридизации пшеницы с кукурузой (Campbell et. all, 1998).
С привлечением современных методик биотехнологии исследователи разработали метод получения триплоидных растений в культуре эндосперма:
Традиционные методы селекции триплоидов, включающие скрещивания тетраплоидных и диплоидных растений, страдают двумя недостатками: 1. такие скрещивания могут не дать ожидаемого результата в связи с гибелью зародыша, 2.этот процесс крайне трудоемок.
В тоже время метод регенерации триплоидов из ткани эндосперма обладает значительными достоинствами и имеет важное значение для реализации различных селекционных программ культур, важных в экономическом отношении (Snvastava, 1982).
Явление органогенеза наблюдается как в каллусных культурах, полученных из эндосперма, так и непосредственно из тканей самого эндосперма.
Чаще всего триплоидные регенераты получат из каллусных культур, полученных из эндосперма. Таким образом были получены растения кротона, петрушки, лимона, яблони, риса (Jotiri, Snvastava, Raste, 1980). Большой склонностью к каллусогенезу, а затем и к эмбриоидогенезу был отмечен незрелый эндосперм сандалового дерева в сравнении со зрелым эндоспермом (Lakshmi Sita, Raghava Ram, Vaidyanathan, 1980).
Но на процессы роста и дифференциации каллуса также влияют различные физические и химические факторы. Важную роль играют гормональный, углеводный состав питательной среды, ее рН, условия культивирования - температура, свет. Так культуры эндосперма Asimina хорошо росли на среде рН 4,0, яблони - при рН 6,0, кукурузы - при рН 7,0 (John, Srivastava, Raste, 1980).Каллус, полученный из эндосперма кукурузы, хорошо рос в темноте, а для роса каллуса клещевины, напротив, необходимо непрерывное освещение; в тоже время свет не оказывал существенного влияния на рост каллуса лилий (Norstog, 1956).
Увеличение концентрации сахарозы в среде ингибировало рост каллусов у большинства исследуемых растений. Для некоторых видов растений при выращивании культуры эндосперма в питательную среду добавляют ко-. косовое молоко, виноградный и дрожжевой экстракт, томатный сок и другие вещества.
Но так как каллусная культура является нестабильной системой и получение морфогенного каллуса связано с определенными трудностями, данный метод получения триплоидных регенерантов посредством культуры эндосперма не нашел массового применения.
Влияние состава питательной среды при длительном беспе-ресадочном культивировании
В состав питательной среды для культивирования растительных тканей входят минеральные соли (макро- и микроэлементы), углеводы, органические добавки и экстракты, агар для получения твердых сред, витамины, гормоны и другие вещества. Минеральный состав является менее варьирующим компонентом сред, т.к. он обусловлен основными физиологическими требованиями культивируемых объектов. Наиболее часто используемой питательной средой является среда Мурасиге и Скуга (Murosihige, Skoog, 1962). Это универсальная и многоцелевая среда, пригодная для растительных клеток многих видов, особенно для каллусной культуры.
Культуры тканей очень чувствительны к недостатку минеральных элементов. При нехватке в среде N,P,K,S, Са, и Mg гибель культуры наблюдается после 1-2 пересадок, причем потребность в элементах питания зависит от физиологического состояния объекта (Бутенко, 1963). Так, при культивировании водорослей Spirulina platensis в условиях недостатка элементов минерального питания была отмечена практически полная остановка роста (Калачева, Сущик, 1994). Выращивание культуры клеток сахарной свеклы при снижении концентрации макросолей в два раза также подавляло рост культуры (Ралдугина, Смоленская, 1983).
Исследования Ботрилла Д.Е. с соавторами (Botrill, Posingham, Knedeman, 1970) показали, что недостаток минерального питания замедляет рост растений и снижает фотосинтетическую активность. В этих условиях потребности в продуктах фотосинтеза уменьшаются, поэтому фотосинтетический аппарат в прежних размерах является излишним и значительная часть его разрушается. Другие авторы (Чемерис и др., 1989) утверждают, что снижение активности фотосинтеза является лишь выражением адаптации клеток к переживанию неблагоприятных условий.
Не только недостаток минерального питания, но и избыток некоторых элементов также оказывает ингибирующее действие на ростовые процессы растений. Культура земляники при выращивании на среде с избытком нитрата кальция снижала интенсивность роста и в течение длительного времени сохраняла жизнеспособность и высокую выживаемость (Высоцкая, 1994). Многочисленные публикации по увеличению азотного питания растений подтверждают данное положение. Избыток азота на ранних фазах развития сахарной свеклы задерживает рост растений (Бузанов, 1968), удлиняет период созревания многих культур (Клечковский, Петербургский, 1967), приводит растения горчицы в состояние стресса (Андреева и др., 1998). По литературным данным в питательной среде для депонирования растений высокий уровень хлоридов (Glimeroth et.all, 1983) или фосфатов калия (Высоцкая, 1994) считается нежелательным, и их замена на другие соли калия способствуют более длительному поддержанию жизнеспособности экс-плантов.
Адаптация растений к уровню минерального питания имеет сложный характер: рост одних органов ускоряется, других замедляется, изменяются активность фотосинтеза, показатели водного обмена, устойчивость растений к неблагоприятным условиям произрастания (Редько, Редько, Сахно, 1989).
Из литературных источников также известно, что в Германии и Нидерландах разработаны методы длительного сохранения микроклонов сахарной свеклы в условиях пониженных температур +4-5 С и освещенности 500 люкс. В Нидерландах укорененные побеги хранили в пробирках в течение года (Miedema, 1982), в Германии при добавлении в среду паклобутразола (РР 333) культура сохранялась 18-24 месяца (Lux Horst et.all, 1991).
Проведенные нами попытки хранения микроклонов сахарной свеклы при пониженных положительных температурах и небольшого освещения в условиях бытового холодильника положительных результатов не дали. После пятимесячного культивирования вегетирующими остались лишь 45 % растений, имевшие живыми 2-3 листа бледно- зеленой окраски и точку роста. Дальнейшее нахождение микроклонов в изучаемых условиях привело к их полной гибели.
В связи с этим реальными возможностями при длительном сохранении материала в культуре in vitro является изменение состава питательной среды. Поэтому начальным этапом изучения условий культивирования явилось снижение содержания макросолей и замена хлорида кальция (Са С1 2) на нитрат кальция (Са(МОз)г) в питательной среде.
