Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфогенез in vitro и сомаклональная изменчивость (литературный обзор)
1.1. Морфогенез в культуре растительных тканей 11
1.2. Роль фитогормонов в регуляции морфогенеза 17
1.3. Генетическая изменчивость in vitro 19
1.4. Механизмы и причины сомаклональной изменчивости 24
1.5. Практическое применение методов культуры тканей 33
Глава 2. Методы и условия исследований 38
2.1. Методы и эксперименты 38
2.1.1. Лабораторные эксперименты 38
2.1.2. Экспериментальный мутагенез 40
2.1.3. Полевые испытания 41
2.2. Рельеф, почвы и растительность 43
2.3. Климат 45
Глава З. Glycine max (L.)MEKR.-СОЯ 51
3.1 Характеристика вида G. max (литературный обзор) 51
3.1.1. Систематика и морфология 51
3.1.2. Экология и онтогенез 53
3.1.3. Биохимические признаки 56
3.1.4. Хозяйственное значение и распространение 57
3.1.5. Генетика и селекция 58
3.1.6. История культуры тканей in vitro 63
3.2. Исследования in vitro G. max 64
3.2.1. Микроклональное размножение 64
3.2.2. Каллусообразование 65
3.2.3. Культура изолированных семядолей 67
3.2.4. Развитие растений Rj из семян, полученных in vitro 70
3.3. Полевые исследования сомаклонов G. max 73
3.3.1. Изменчивость в первых поколениях сомаклонов 73
3.3.2. Изменчивость сомаклонов при отборе на продуктивность 82
3.3.3. Изменчивость в потомствах 1 растения-регенеранта 91
3.4. Обсуждение результатов 96
Глава 4. Brassicanapusl. -РАПС 106
4.1 Характеристика вида В. napus (литературный обзор) 106
4.1.1. Систематика и происхождение 106
4.1.2. Морфология 107
4.1.3. Онтогенез и экология 109
4.1.4. Распространение и хозяйственное значение 110
4.1.5. Генетика и селекция 111
4.1.6. История культуры тканей in vitro 113
4.2. Исследования in vitro В. napus 114
4.2.1. Получение асептического материала 114
4.2.2. Клонирование in vitro 115
4.2.3. Каллусообразование 116
4.2.4. Регенерация растений 120
4.2.5. Развитие растений-регенерантов и высадка в почву 124
4.2.6. Влияние генотипа 126
4.2.7. Влияние фитогормонов 127
4.2.8. Влияние физических факторов 128
4.2.9. Культура тканей В. napus как тест-система 131
4.2.10. Культура тканей ООО-форм 136
4.3. Полевые исследования сомаклонов В. napus 138
4.3.1. Изменчивость количественных признаков 138
4.3.2 Изменчивость биохимических признаков 144
4.3.3. Фертильность сомаклонов 148
4.3.4. Анализ изменчивости клонов и сомаклонов 153
4.3.5. Изменчивость 00-линий 164
4.4. Обсуждение результатов 170
Глава 5. Cicer arietinum L. - НУТ 177
5.1 Характеристика вида С. arietinum (литературный обзор) 177
5.1.1. Систематика, происхождение и морфология 177
5.1.2. Онтогенез и экология 179
5.1.3. Хозяйственное значение и распространение 183
5.1.4. Селекция и сорта 186
5.1.5. История культуры тканей in vitro 188
5.2. Исследования in vitro С. arietinum 191
5.2.1. Морфогенез in vitro 191
5.2.2. Развитие и клонирование растений-регенерантов in vitro 194
5.2.3. Развитие растений-регенерантов в почве 197
5.3. Полевые исследования сомаклонов С. arietinum 199
5.3.1. Количественная изменчивость 200
5.3.2. Корреляции признаков 202
5.3.3. Устойчивость к болезням 205
5.3.4. Сомаклоны с повышенной фертильностью 207
5.3.5. Изменчивость в потомствах 1 растения-регенеранта 212
5.4. Обсуждение результатов 216
Глава 6. Onobrychis arenaria {KIT.) DC - эспарцет песчаный 222
6.1 Характеристика вида О. arenaria (литературный обзор) 222
6.1.1. Происхождение и систематика 222
б. 1.2. Морфология 225
6.1.3. Экология и онтогенез 227
6.1.4. Хозяйственное значение и сорта 230
6.2. Исследования in vitro О. arenaria 234
6.2.1. Получение асептического материала 234
б. 2.2. Регенерация растений 234
6.2.3. Морфогенез in vitro 236
6.2.4. Рекуррентная регенерация 240
6.3. Полевые исследования сомаклонов О. arenaria 241
6.3.1. Изменчивость растений-регенерантов Ro 243
6.3.2. Изменчивость в потомствах сомаклонов 266
6.3.3. Изменчивость поразмерам и форме плодов 273
6.3.4. Изменчивость по таксономическим признакам видов 276
6.3.5. Особенности корреляций признаков 279
6.4. Обсуждение результатов 282
Глава 7. Medicago varia mart. -люцерна изменчивая 291
7.1 Характеристика вида М. varia (литературный обзор) 291
7.1.1. Систематика и происхождение 291
7.1.2. Морфология 293
7.1.3. Экология 294
7.1.4. Хозяйственное значение и распространение 298
7.1.5. Генетика и селекция 299
7.1.6. История культуры тканей in vitro 302
7.2. Исследования in vitro М. varia 305
7.2.1. Морфогенез in vitro и регенерация 305
7.2.2. Клонирование in vitro и развитие растений-регенерантов 307
7.2.3. Культура тканей М. varia как тест-система 310
7.3. Полевые исследования сомаклонов М. varia 314
7.3.1. Качественная изменчивость 314
7.3.2. Онтогенез и количественная изменчивость 318
7.3.3. Вариации фертильности 321
7.3.4. Устойчивость к болезням 326
7.3.5. Осыпаемость листьев и корреляции 329
7.3.6. Изменчивость биохимических признаков 331
7.3.7. Высокопродуктивные сомаклоны 332
7.4. Обсуждение результатов 334
Глава 8. О свойствах и практическом использовании сомакло нальной изменчивости 340
8.1. О пределах сомаклональной изменчивости 340
8.2. О практическом применении сомаклональной изменчивости 332
Выводы 346
Рекомендации для селекционной практики 349
Список литературы 350
- Генетическая изменчивость in vitro
- Экспериментальный мутагенез
- Микроклональное размножение
- Получение асептического материала
Введение к работе
Актуальность проблемы. Обеспечение населения полноценными продуктами питания зависит от решения актуальных проблем кормопроизводства, в частности проблемы кормового белка, имеющей глобальное значение. Для регионов зоны рискованного земледелия, куда входит Сибирь, решающая роль принадлежит селекции новых сортов кормовых культур из сем. Fabaceae и Bras-sicaceae, обеспечивающих высокие урожаи кормовой массы и стабильный семеноводческий процесс в жестких условиях континентального климата.
Создание исходного материала для селекции требует расширения генетического разнообразия, что даст возможность повысить устойчивость новых сортов к биотическим стрессам и увеличить их адаптивность к меняющимся условиям среды. Однако традиционный процесс, начинающийся с поиска вовлекаемых в скрещивание форм и прогноза комбинационной способности родительских пар, трудоемок и не всегда эффективен (Мережко, 2005). В последние десятилетия методы биотехнологии стали новым источником генетической изменчивости. Особенностью культуры соматических тканей растений, в отличие от тканей животного происхождения, является возможность регенерации полноценных организмов благодаря свойству тотипотентности растительной клетки (Бутенко, 1964, 1975). Давно известно, что пролиферация соматических клеток in vitro сопровождается цитогенетическими аберрациями (Shamina, 1966; Фролова, Шамина, 1974). Некоторые нарушения (сомаклональные вариации) реализуются в растениях-регенерантах (сомаклонах) и передаются потомству в виде морфологических, физиологических и химических изменений. RJ. Larkin и W.R. Skowcroft (1981) предложили использовать сомаклональную изменчивость для селекции новых сортов. В то же время спонтанные наследуемые вариации недопустимы в области генетической трансформации растений, размножения или сохранения растительных ресурсов in vitro. Клональное микроразмножение обеспечивает генетическую стабильность только при использовании меристем, детерминированных к развитию (Высоцкий, 1995). По данным Н.А. Вечерниной
(2006), стабильность регенерантов зависит как от модели регенерации, так и от вида растения.
Методы биотехнологии находят все большее применение в селекции, размножении редких и исчезающих видов, создании генетических коллекций растительных ресурсов (Melnyk et al., 2002; Белокурова и др., 2005; Чесноков, 2006). Однако, поскольку морфогенный потенциал растительной ткани in vitro контролируется генотипом, использование биотехнологий для многих видов и сортов ограничено отсутствием надежных регенерационных протоколов и способов адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro. Кроме того, для более эффективного использования сомаклональной изменчивости в селекции необходимо найти ответы на целый ряд вопросов: каков ее спектр в каждом конкретном случае, как она сохраняется в половых поколениях, может ли привести к появлению новых, не свойственных виду признаков и др. Физиологические, молекулярно-генетические и селекционные аспекты сомаклональной изменчивости однодольных растений подробно исследованы и обобщены Ю.И. Долгих (2005) на примере кукурузы. Для двудольных растений, в биотехнологическом аспекте радикально отличающихся от однодольных, подобных сводок в России нет. Поэтому проведенное нами изучение условий возникновения вариаций, морфологических и агрономических признаков и адаптационных свойств растений-регенерантов и семенных потомств, осуществленное для 5 видов Dicotyle-donae, является актуальным для современной биологии и представляет интерес для практического использования в селекции кормовых культур. Особенно актуально создание новых высокопродуктивных, адаптированных к условиям Сибири, экологически стабильных форм с признаками устойчивости к гидротермическим стрессам и патогенам.
Цель исследований - создание исходного материала для селекции сои (Glycine max (L.) Merr.), нута (Cicer arietinum L.), рапса (Brassica napus L.), эспарцета (Onobrychis arenaria (Kit.) DC), люцерны (Medicago varia Mart.) путем использования сомаклональной изменчивости растений-регенерантов, полученных in
vitro, и их генеративных потомств.
Основные задачи: 1) разработка или модификация регенерационных протоколов и методик культивирования in vitro и ex vitro для изучаемых видов растений;
сравнительный анализ фенотипической изменчивости по основным признакам вегетативной и генеративной сферы у растений-регенерантов и в популяциях сомаклонов, меристемных клонов, растений, подвергшихся мутагенному воздействию, и исходных генотипов в разных погодных условиях;
выявление закономерностей сомаклональной изменчивости у изученных видов;
изучение и отбор селекционно ценных сомаклонов и экспериментальных форм, полученных после мутагенного воздействия.
Основные защищаемые положения. 1. Регенерация in vitro в культуре дедифференцированных тканей у изученных видов двудольных кормовых растений из сем. Fabaceae и Brassicaceae способствует увеличению наследственной изменчивости растений-регенерантов по морфологическим и биологическим признакам: фертильности, скорости и мощности развития, устойчивости к факторам внешней среды, химического состава. В первых поколениях половых потомств происходит дальнейшее увеличение вариабельности.
Сомаклональная изменчивость культурных растений расширяет биологическое разнообразие посредством появления как ценных, так и нежелательных для селекции вариаций. Отклонения от исходного генотипа по количественному признаку в популяциях сомаклонов распределяются по нормальному закону с асимметрией в сторону, противоположную направлению предшествующего отбора.
Процесс регенерации растений обеспечивает отбор in vitro форм с высоким уровнем онтогенетической адаптации и неспецифической устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам внешней среды.
Метод сомаклональной изменчивости в сочетании с отбором позволяет
создавать ценный селекционный материал с признаками скороспелости, повышенной семенной и кормовой продуктивности, улучшенного химического состава фитомассы, устойчивости к гидротермическим факторам и патогенам.
Научная новизна. Впервые разработана методика введения в культуру in vitro и соматического эмбриогенеза О. arenaria, усовершенствованы методические приемы культивирования in vitro и разработаны регенерационные протоколы для сортов кормовых культур, адаптированных к условиям Сибири: G. max, С. arietinum, В. napus (в т.ч. желтосемянных форм), а также сортообразцов М. varia сибирского и якутского происхождения. На базе культуры тканей В. napus и М. varia разработаны новые тест-системы для диагностики регуляторной активности химических препаратов. Впервые изучено влияние рекуррентной регенерации на рост, развитие и устойчивость к гидротермическим и биотическим стрессам О. arenaria в течение онтогенеза (10 лет), выявлена прямая корреляция между числом пассажей in vitro и устойчивостью сомаклонов О. arenaria к патогенам. В исследованиях использованы оригинальные методические приёмы анализа фенотипических вариаций в популяциях сомаклонов, полученных от единого исходного растения. Впервые исследована изменчивость в генеративных поколениях сомаклонов G. max до VIII поколения, С. arietinum, В. napus до IV поколения, О. arenaria, М. varia до III поколения в условиях Сибири и выявлена зависимость вариаций признаков от экологических факторов.
Практическая значимость. Площадь возделывания выбранных для изучения видов, играющих важную роль в мировом производстве кормового белка, может быть увеличена за счет обширных регионов Сибири и Якутии, для чего необходимы новые высокопродуктивные сорта с адаптивным комплексом признаков. Применение методов биотехнологии направлено на повышение эффективности селекционного процесса. Разработанные регенерационные протоколы и выявленные особенности сомаклональной изменчивости позволяют расширить применение биотехнологий в селекции и сохранении растительных ресурсов. Полученные новые формы сои, нута, рапса, эспарцета и люцерны с ценны-
ми хозяйственными признаками, возникшими в результате сомаклональной изменчивости, переданы и изучаются в селекционных питомниках СибНИИ кормов, СибНИИРС, СибНИИСХ, Алтайского НИИСХ, Приморского НИИСХ, Института Северного луговодства (г. Якутск), РГП НПЦ земледелия и растениеводства (Казахстан).
Апробация работы. Основные результаты были представлены на семинарах генетико-селекционной школы (Новосибирск, 1994, 1999, 2004); заседаниях Проблемного совета по растениеводству, селекции и биотехнологии Сибири (Омск, 1995; Красноярск, 1996; 2001; 2005; Тулун, 1997; Абакан, 1998; Новосибирск, 2000); научно-методических конференциях (Омск, 1998; 2002); Международном симпозиуме «Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources» (Ялта, 2002); II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002); XI съезде РБО (Новосибирск-Барнаул, 2003); международных конференциях «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999); «Теоретические и прикладные вопросы травосеяния в криолитозоне» (Якутск, 2001); «Адаптивная селекция растений. Теория и практика» (Харьков, 2002); «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (Томск, 2003); «АГ-РОИНФО» (Новосибирск, 2003, 2006); «Актуальные проблемы генетики и селекции растений» (Омск, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 57 научных работ, в том числе монография «Соя и нут в Сибири: культура тканей, сомаклоны, мутанты» (2005 г.), зарегистрирован патент на изобретение № 2267927 «Биостимулятор роста растений».
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 373 страницах, содержит 120 таблиц, иллюстрирована 68 рисунками, схемами и фотографиями. Она состоит из введения, 8 глав и выводов: Список литературы содержит 589 наименований, в том числе 268 на иностранных языках.
Генетическая изменчивость in vitro
Ключевым моментом реализации методов биотехнологии является получение целых растений из отдельных соматических клеток или изолированных тканей. Регенерация растений происходит благодаря свойству тотипо-тентности растительной клетки (Бутенко, 1964). Успех регенерационного процесса зависит от баланса фитогормонов, типа экспланта, длительности культивирования, минерального состава среды, физических условий культивирования, способности генотипа к регенерации и других факторов.
Согласно современным представлениям, морфогенез высшего растения как создание определенной материальной структуры является результатом влияния среды на наследственно закрепленные признаки посредством слож-ных физиологических взаимодействий между органами, тканями, клетками, разделенными в пространстве и времени. В онтогенезе реализуются генетически закрепленные особенности и нормы морфогенетических реакций. Особенно важен интегральный характер процессов. Гармоничное осуществление развития обеспечивается на уровне организма синтезом морфогенетически активных соединений в одних органах и тканях, переносом их на разные расстояния и рецепцией в тканях-мишенях, реагирующих соответствующим образом на эти стимулы (Бутенко, 1975; Шевелуха, 1992; Батыгина, 1987, 1997). Начальное звено в цепи морфогенетических реакций организма - это его клетки, разнообразие которых является результатом изменения темпа и направления делений и роста. Цитодифференцировка представляет собой базу морфогенеза на клеточном уровне.
Изучение закономерностей развития генеративных и эмбриональных структур позволило установить универсальность путей морфогенеза in vivo и in vitro (Батыгина, 1987). Нормальным состоянием клетки является митоз или подготовка к нему. Дифференцировка происходит после приостановки деления клеток посредством блокирования процессов подготовки к очередному митотическому циклу. Акт детерминации предшествует морфогенетической реакции. Детерминированная система способна проходить определенный путь развития и достигать определенного состояния «автоматически», даже если внешний стимул, побудивший ее развиваться в данном направлении, прекратил свое воздействие. В культуре in vitro компетентная клетка, детерминированная к одному из трех типов морфогенеза, становится морфогенетической единицей каллуса, корня или побега (Моисеева, 1991).
Начальным этапом морфогенеза in vitro следует считать дедифферен-цировку (превращение дифференцированной клетки экспланта в каллусную). Каллусообразование свойственно растительным тканям in vivo как естественная реакция организма на повреждение (Кренке, 1950). Формирование каллусной ткани связано с индукцией клеточного деления, способность к которому была блокирована до эксплантирования в процессе дифференцировки тканей исходного растения. Возобновление митотической активности обусловлено дедифференцировкой растительной клетки и служит первым шагом к реализации тотипотентности, находящейся под генетическим контролем и связанной с функцией фитогормонов (Лутова, 1993). Эксплантированные ткани и клетки на искусственной питательной среде, содержащей минеральные соли, сахара и регуляторные вещества, переходят к неорганизованному размножению. Каллусную ткань в культуре in vitro легко образуют не только дедифференцированные, но и митотически активные меристематические клетки. Если дедифференцировка специализированной клетки обусловлена индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся клетки меристемы связана с остановкой делений, деспециализацией и только после этого - с индукцией митоза и образованием каллуса.
Особенности каллусных клеток подробно рассмотрены в фундаментальных работах Р.Г. Бутенко (1964, 1975, 1985). Доказано, что длительно культивируемые клетки устойчиво сохраняют видовую, органную и тканевую специфику исходного экспланта. Они остаются способными к некото рым специфическим биосинтезам вторичного обмена и могут сохранять даже такие комплексные физиологические свойства исходного генотипа, как устойчивость к низким температурам или высокой концентрации сахарозы в среде. Тем не менее свободное существование вне организма определенным образом отражается на морфологических и функциональных характеристиках клеток, и каллусные культуры разного происхождения приобретают морфологическое сходство. Некоторые биохимические характеристики основного клеточного обмена каллусных клеток высших растений унифицируются, становясь более архаичными, сходными с обменом низших растений или даже бактерий. Однако культивируемые растительные клетки сохраняют тотипотентность как способность к вторичным дифференцировкам и образованию структур, свойственных только высшим растениям и тому исходному растению, генетическую информацию которого клетка несет во время неорганизованного размножения. В процессе морфогенеза возникают сформированные de novo, не связанные с предсуществующими инициалями элементы тканевых структур, корни, побеги, листья и цветки.
Способность к регенерации свойственна всем живым организмам и предназначена для заживления ран, восстановления или компенсации утраченных частей. Термин «регенерация» обозначает, с одной стороны, восстановление целостности организма, с другой - образование новых организмов из соматических клеток. Изучая регенерационные процессы у животных, М.А. Воронцова (1949) впервые определила регенерацию как вторичное развитие. Первичным развитием считается онтогенез, т.е. развитие организма от яйца до взрослого состояния. У животных, по мнению Б.П. Токина (1959), различия между соматическим эмбриогенезом и регенерацией чрезвычайно велики: в первом случае происходит закладка и развитие нового организма, не совпадающего с материнским, во втором - производится починка старого.
Иначе выглядит феномен регенерации в растительном мире. У высших растений сохранились различные формы вегетативного и бесполого размно жения, что сглаживает различия между процессами первичного и вторичного развития организмов. В сущности, регенерация целого растения из единственной соматической клетки представляет собой предельный акт выживания исходного организма в неблагоприятных условиях. А.А. Жученко (2005) относит регенерацию к приспособительным механизмам онтогенетической адаптации растений. Несмотря на известные особенности соматического эмбриогенеза и стеблевого морфогенеза (рост эмбриоида носит биполярный характер, побега - униполярный), в итоге мы получаем равноценные растения-регенеранты, которые могут быть идентичны исходному генотипу, а могут и отличаться от него. С.Э. Смоленская (2002) полагает, что определение реге-нерационного потенциала растений in vitro является наиболее эффективным методом изучения их способности к восстановлению после повреждений in vivo.
Экспериментальный мутагенез
Исходным материалом для наших исследований послужил сорт Сиб-НИИК 315. Он создан в СибНИИ кормов В.Е. Гориным с коллегами путем отбора из шведского сортообразца коллекции ВИР (к-5828). По мнению авторов, причиной изменчивости в коллекционном образце явилась спонтанная гибридизация (Горин, 1994). Сорт относится к маньчжурскому подвиду и входит в апробационную группу sordida. Растения высотой 50 - 80 см, зеленые с коричневым опушением, формируют компактный куст с 1 - 4 ветвями, и 10 - 12 междоузлиями. Тип роста промежуточный. Высота прикрепления нижнего боба 8 - 10 см. Лист тройчатосложный с широкояйцевидными листочками. Соцветие - кисть с 2 - 5 фиолетовыми цветками. Бобы слабоизогнутые, четковидные, 2 - 3-семянные, с густым рыжим опушением, при созревании желто-бурые. Семена округлые, светло-желтые, рубчик коричневый, масса 1000 семян 180 г. Период вегетации 90-110 дней. Сорт устойчив к полеганию и растрескиванию бобов, засухоустойчив, средняя урожайность 1,6 т/га, максимальная 2,8 т/га. Содержание белка в семенах 35-40, жира 17 - 20%. Районирован с 1991 г. и допущен к использованию в производстве по Волго-Вятскому, Средневолжскому, Уральскому, Западно-Сибирскому и Восточно-Сибирскому регионам России и в Казахстане (Каталог сортов..., 2003; Кашеваров и др., 2004). Регенерация целого растения из недифференцированных клеток - необходимый этап любой технологии in vitro, применяемой в растениеводстве и селекции, однако соя в этом отношении долгие годы не поддавалась усилиям исследователей. Gamborg с сотрудниками в 1968 г. опубликовали состав питательной среды В5 для каллусной и суспензионной культуры G. max (Gamborg et al., 1968). K.N. Kao с коллегами (1970) сообщили о делении клеток в культуре протопластов, D.R Elvers с сотрудниками (1974) освоили культуру пыльников. Легкость культивирования клеточных суспензий сои привела к раннему развитию технологий культуры изолированных протопластов-(Barwale, Widholm, 1990).
В экспериментах Cheng и Saka с коллегами (Cheng et al., 1980; Saka et al., 1980) были получены растения-регенеранты G. max из семядольных узлов, причем из одного экспланта формировалось до 11 побегов. Т. Катеуа и J.M. Widholm (1981) добились регенерации растений разных видов Glycine из отрезков гипокотилей, G.C. Phillips и G. В. Collins (1981) получили соматические эмбрионы сои. M.L. Christianson и сотрудники в 1983 г. сообщили о морфо-генной суспензионной культуре тканей незрелых зародышей (Christianson et al., 1983a,b). Наконец, в 1985 - 1987 г.г. многие зарубежные исследователи опубликовали разработанные ими методики регенерации растений из тканей различных эксплантов G. max путем органогенеза и соматического эмбриогенеза (Ranch et al., 1985, 1986; Lazzeri et al., 1985; Li et al., 1985; Barwale et al., 1986a,b; Hymowitz et al., 1986; Chazi et al., 1986; Wright et al., 1986; 1987).
К тому времени и перед российской наукой была поставлена задача разработать технологию регенерации в культуре in vitro отечественных сортов сои (Шевелуха, 1986). Вскоре ученые из ВНИИ сои сообщили об успешном получении растений in vitro в культуре тканей сортов, районированных в Амурской области (Донцова, 1989; Соловьев, 1990; Соловьев, Родина, 1990). В начале 90-х годов в Приморском НИИСХ П.П. Фисенко с коллегами дос тигли регенерации растений из тканей незрелых семядолей и семядольных узлов путем органогенеза И соматического эмбриогенеза (Фисенко, Галукян, 1992; 1994; Хохлова, Фисенко, 1994). В это же время в Сибирском НИИ кормов были начаты наши- исследования по разработке эффективных регенера-ционных протоколов для сорта СибНИИК 315 (Рожанская, Клеблеева, 1994).
Основной задачей первого этапа стала разработка эффективных и удобных методик, культивирования in vitroH регенерационных протоколов для исходного сорта сои СибНИИК 315. Зрелые семена, предварительно промытые в мыльном растворе; обрабатывали- 10%-ным раствором хлорамина Б в течение 20 минут, промывали автоклавированной водой и проращивали в стерильных чашках Петри или пробирках с минимальной средой. Полученные проростки, как правило, были асептическими и не имели повреждений.
Экспланты из тканей 3 - 7-дневных проростков помещали на агаризо-ванные питательные среды В5 или MS с добавлением ауксинов и цитокини-нов. Регенерационные протоколы были разработаны на базе эксплантов зрелых семядолей и семядольных узлов. Регенерация побегов происходила на питательных средах различного состава и даже на воде (табл. 3.1).
Для размножения и сохранения растений-регенерантов применялось клонирование in уігго.Наиболее эффективным было размножение в культуре стеблевых узлов на агаризованной среде В5 с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных компонентов, без гормонов (табл. 3.2). Каждая стеблевая почка формировала 1- 2 побега и корни через неделю после начала инкубации, причем у трети эксплантов-развивались каллусы в базальной части. Легкость укоренения и наличие каллусной ткани говорят о присутствии эндогенных ауксинов в эксплантах.
Микроклональное размножение
В результате проведенных экспериментов установлено, что регуляторы роста из торфа В3 и Тз обладают свойствами инициации морфогенетических процессов in vitro, ускоряют рост и развитие побегов и корней. Эффективная концентрация их в водном растворе составляет 10 мг/л. Препарат В3 усиливает пролиферацию каллусной ткани в присутствии ауксина, увеличивает частоту регенерации растений из каллусной ткани и способен функционально заменить, цитокинин.
Наблюдавшееся при микроклонировании В. napus ускорение образования корней и роста побегов в 1-ю неделю культивирования позволяет предположить, что препараты В3 и Т3 способствуют адаптации изолированных почек к условиям in vitro. Стимулирование роста продолжалось в течение 3 недель культивирования и вызвало увеличение количества и длины корней и количества листьев на побегах рапса. Готовность растений к высадке в почву наступила на 1 неделю раньше, чем в контроле.
Регулятор роста из хвои пихты СП не проявил ауксиновой активности в отношении каллусообразования, но в сочетании с ауксином усиливал рост каллусной ткани, в сочетании с БАП стимулировал рост каллуса и регенерацию растений, а в отсутствие БАП проявил способность к инициированию процесса регенерации, т.е. цитокининовую активность. В процессе микро-клонального размножения В. napus препарат СП вызывал увеличение количества побегов на 10-20%. В первые недели культивирования он угнетал рост и замедлял начало образования корней, но к концу 4-й недели ингибирую-щий эффект уменьшался и исчезал в варианте с концентрацией 1 мг/л. Итогом действия регулятора роста из хвои пихты явилось формирование невысоких, плотных, хорошо облиственных и укорененных побегов рапса, легко переносящих высадку в почву и адаптацию к автотрофному питанию.
Так культура тканей В. napus послужила тест-системой для определения регуляторной активности химических веществ. С ее помощью проводилось тестирование различных препаратов и в 2006 г. защищен патент РФ № 2267927 «Биостимулятор роста растений» (приложение II).
Светлосемянные формы видов Brassica предпочтительнее темносемян-ных для возделывания на пищевые и кормовые цели, благодаря повышенному на 2,6 - 5,0% содержанию масла и белка в семенах и пониженному на 3,0 136 4,0% - сырых волокон (Потапов, 2002). Окраска оболочки, состоящей из нескольких слоев паренхимы и одного слоя алейроновых клеток, обусловлена главным образом полифенолами. Паренхима развивается из материнской ткани (наружного интегумента завязи), а алейроновый слой, расположенный с внутренней стороны оболочки семени, формируется из клеток эндосперма.
Пигмент оболочки сконцентрирован в основном в ее паренхимном слое. Более тонкий палисадный слой светлоокрашенной оболочки обусловливает снижение содержания клетчатки в семенах и повышение - масла и белка. Поскольку в пределах вида В. napus нет желательных желтосемянных генотипов (так называемых трехнулевых, или 000-форм), для получения жел-тосемянного рапса используют различные селекционные стратегии, основанные на скрещиваниях с целью переноса этого признака из желтосемянных видов Brassica: В. campestris, В. juncea и В. carinata. Однако созданные к настоящему времени 000-формы отличаются пониженной семенной продуктивностью и генетической нестабильностью признака желтой окраски семян.
С целью ускоренного размножения наиболее ценных линий желтосе-мянного рапса был использованы методы in vitro. Для введения 000-линий в асептическую культуру из инбредных популяций нами отбирались семена с желтой окраской оболочки без крапинок и пигментации. Проращивание in vitro семян с пониженной жизнеспособностью и микроклональное размножение проводили в соответствии с нашими рекомендациями (Рожанская, Све-жинцева, 1991; Потапов, Рожанская, 2003).
Число семян на растении у линий, созданных с использованием методов in vitro, варьировало в более широких пределах и в среднем было вдвое больше, чем у форм, полученных традиционными методами. Доля желтых семян у клонов была более высокой, чем у инбредных линий (табл. 4.11).
Повышенная желтосемянность растений, полученных с использованием методов культивирования in vitro, явилась следствием улучшения условий отбора желтых семян для проращивания. Дело в том, что семена с наиболее выраженной светлой окраской (как правило, щуплые и недоразвитые) в почве не.прорастают. В культуре in vitro были созданы более благоприятные условия для прорастания, роста и развития генотипов, формирующих абсолютно желтосемянные растения.
Получение асептического материала
В таблице 5.3 представлена динамика развития регенерантов в культуре измельченных зародышей в течение 6 недель на разных средах. Лучшим вариантом мы считаем использование среды Гамборга В5 половинной концентрации с добавкой кинетина в количестве 0,25 - 0,5 мг/л по причине экономичности и достаточно высокой частоты регенерации: в течение месяца на каждом экспланте формировалось в среднем 2 побега высотой от 1 до 4 см, с 2-3 листьями. При дальнейшем культивировании регенеранты активно развивались, но часть из них погибала, поэтому не следует затягивать с пересадкой сформировавшихся побегов на новую среду.
Среда MS с добавкой 8 мг/л НУК вызывала каллусогенез и формирование зачаточных побегообразных структур, рост которых быстро прекращался. Очевидно, уровень эндогенного цитокинина у исходного генотипа недостаточно высок для поддержания гормонального баланса, необходимого для регенерации, при высокой концентрации экзогенного ауксина.
Основной задачей культивирования регенерантов нулевого поколения является размножение путем клонирования и получение семян. В наших опытах С. arietinum не плодоносил in vitro, в отличие от G. max, поэтому молодые растения необходимо готовить к высадке в почву, а для этого они должны иметь развитые листья и корни, подобно изображенным на рисунках 5.3 и 5.5 (справа).
Клонирование С. arietinum в культуре стеблевых узлов на среде MS с добавкой БАЛ приводило к образованию множества коротких адвентивных побегов с зачатками листьев, без корней и каллуса (рис. 5.5, табл. 5.4). Увеличение концентрации БАЛ стимулировало частоту стеблевого морфогенеза и выход побегов, снижая их высоту и степень развития.
Добавка 1 мг/л кинетина способствовала усиленной вторичной регенерации побегов из разросшейся базальной части первичного регенеранта. Адвентивные побеги были в основном слабо дифференцированными, с аномальными витрифицированными листьями и стеблями, склонными к побуре-нию и отмиранию, но многие побеги нормально росли и формировали корни. При увеличении концентрации цитокинина замедлялся рост побегов и прекращался ризогенез. Присутствие экзогенного ауксина ИМК в среде с кине 196 тином не способствовало ризогенезу и замедляло рост побегов, но предохраняло их от побурения и гибели.
В отсутствие экзогенных цитокининов добавление в среду ауксинов стимулировало образование корней и адвентивных побегов. На среде с ИМК происходила интенсивная вторичная регенерация побегов из базальной части, ризогенез и быстрый рост корней у каждого второго экспланта, при отсутствии каллусообразования. На такой же среде с добавкой регулятора роста грибного происхождения «Симбионт Иванова» вторичная регенерация побегов не происходила, но достоверно увеличился каллусогенез, ризогенез и рост побегов в высоту. Эффект «Симбионта Иванова» был подобен действию ауксина, причем в чрезвычайно малой дозе этот регулятор роста заметно сдвинул гормональный баланс. Наиболее благотворное воздействие на развитие регенерантов оказала добавка ИУК в концентрации 1 мг/л, способствовавшая увеличению частоты ризогенеза до 90% и достаточно быстрому росту и развитию растений.
На практике для ускоренного размножения регенерантов мы часто использовали среду 1/2В5 с кинетином в концентрации 0,5 - 1 мг/л. Растения с корнями высаживали в почву, а неукоренившиеся - клонировали в-культуре стеблевых узлов. Темпы роста in vitro отдельных растений-регенерантов сильно варьировали даже в одинаковых условиях культивирования. В таблице 5.6 приведены данные наблюдений за развитием 54 растений RQ в течение 50 - 60 дней на среде 1/2 В5 с добавкой кинетина 1 мг/л. Особенно высокой была вариабельность по высоте побегов, длине корней, ветвистости.
После пересадки в почву каждый второй регенерант С. arietinum погибал по различным причинам, снижающим способность к адаптации ex vitro. Растения с нежным, слабым стеблем, удлиненными междоузлиями, с каллусом у основания побега плохо переносят пересадку. Иногда у них отсутствует или ослаблена связь сосудов между стеблем и корнем, что исключает или затрудняет выживание ex vitro (Altaf, Ahmad, 1990).
Изменчивость по высоте и количеству узлов значительно уменьшилась по сравнению с этапом культивирования in vitro за счет выпадения растений с тяжелыми аномалиями развития, однако варьирование по другим элементам вегетативной сферы осталось на прежнем уровне, дополненное высокой изменчивостью по числу генеративных органов. В среднем 1 из 3 цветков завязывал боб с одним, редко двумя семенами.
Выращивание растений-регенерантов нута Ro в поле имеет свои проблемы, главная из которых - неблагоприятные погодные условия, но в случае жаркого и засушливого лета можно получить более 100 семян от каждого растения.
Полевые исследования потомств растений-регенерантов С. arietinum (рис. 5.6) проводились, начиная с 1998 г. Результаты испытаний в крайней степени зависели от погоды. Условия вегетационного сезона 1998 г. характеризовались несколько повышенной температурой и пониженным количеством осадков по сравнению со средними многолетними, а лето 1999 г. было экстремально сухим и жарким (см. рис. 2.3). Эти годы, а также жаркий и засушливый 2003 г., были благоприятными для нута (см. рис. 2.4). Три сезона подряд (2000 - 2002 гг.), а затем 2004 и 2005 гг. были неблагоприятными, т.е. отличались повышенным количеством осадков и прохладной погодой в период цветения и созревания, что позволило провести оценку изменчивости сомаклонов С. arietinum на естественном селективном фоне.
