Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Биотехнологические методы в селекции ярового рапса 9
1.2. Значение гаплоидии и её использование в селекции рапса 12
1.3. Применение методов in vitro в получении отдаленных гибридов у растений семейства Brassicaceae 14
2. Материал и методика исследований 21
3. Индуцирование гаплоидии из неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в условиях in vitro
3.1. Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии 30
3.1.1. Влияние генотипа на индукцию гаплоидов 30
3.1.2. Маркерные признаки растений-доноров 37
3.1.3 Зависимость регенерационной способности семязачатков от расположения ветвей на побеге и длины бутона 43
3.2. Влияние экзогенных факторов на индукцию гаплоидии 45
3.2.1. Подбор оптимального стерилизующего агента 45
3.2.2. Влияние предобработки бутонов и сроков введения в культуру на индукцию гаплоидии 48
3.2.3. Зависимость регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков от условий культивирования 50
3.3. Гаплоидия как ускоренный метод создания гомозиготных линий ярового рапса 60
3.3.1. Формирование гаплоидных линий 60
3.3.2. Процесс диплоидизации гаплоидов 66
3.3.3. Метод создания гомозиготных линий ярового рапса на основе индуцирования гаплоидии 69
3.3.4. Характеристика полученных реституционных линий 75
4. Эмбриокультура в условиях in vitro 83
4.1. Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro 83
4.2. Влияние возраста зародышей и условий культивирования на процесс регенерации 87
4.3. Характеристика полученных гибридов 91
Выводы 101
Рекомендации для практического использования... 103
Список литературы
- Биотехнологические методы в селекции ярового рапса
- Применение методов in vitro в получении отдаленных гибридов у растений семейства Brassicaceae
- Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии
- Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro
Введение к работе
Актуальность темы. Рапс яровой {Brassica napus L.) - ценная масличная и кормовая культура, для которой характерна высокая пластичность и приспособленность к умеренному климату. В России рапс является одной из перспективных масличных культур, увеличение объемов производства семян которой позволит полнее обеспечить население растительным маслом, животноводство - кормовым белком, а промышленность - сырьем (Карпачев, 2006).
Создание новых сортов, соответствующих требованиям современного производства, во многом зависит от разнообразия исходного материала. Достижение этого возможно не только с помощью традиционных методов селекции, но и современными методами биотехнологии, которые позволяют ускорить процесс формирования новых сортов ярового рапса в 5-Ю раз.
Широкое применение в сельскохозяйственной биотехнологии нашел метод индуцирования гаплоидии в культуре репродуктивных органов. У ярового рапса достаточно подробно разработан метод культуры изолированных пыльников (Муравлёв, Кривошеева, 1999; Keller, Armstrong, 1977). Однако, для гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности необходимо сохранение материнской цитоплазмы, что возможно только с помощью культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков. Причем, растения, полученные данным методом, свободны от некоторых вирусов и нежелательных генов, передающихся по мужской линии (Бутенко, 1999).
Сведений о получении гаплоидных растений в культуре неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в доступной нам литературе не выявлено.
Кроме того, немаловажную роль в селекции рапса играет отдаленная гибридизация, так как перенос ценных генов из других видов и родов
5 Brassicaceae расширяет его генетический потенциал, который отличается крайней узостью.
В связи с этим актуальным в селекции рапса является применение биотехнологических методов, в том числе эмбриокультуры и гаплоидии, позволяющих расширить генетический потенциал и ускорить создание новых сортов и гибридов.
Цель работы: обосновать приемы культивирования in vitro неоплодотворенных семязачатков и незрелых зародышей в процессе создания нового исходного материала ярового рапса.
Задачи исследований:
Изучить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов из неоплодотворенных семязачатков и формирование реституционных линий ярового рапса.
Разработать способ получения нового исходного материала ярового рапса, в том числе восстановителей фертильности, с использованием метода культуры неоплодотворенных семязачатков.
Изучить влияние направления скрещиваний (генотипа материнской и отцовской формы) и условий культивирования на развитие зародышей отдаленных гибридов в условиях in vitro.
Выявить ценные и хозяйственно-полезные признаки полученных реституционных линий и гибридных растений.
Научная новизна. Впервые установлено, что при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Данные наблюдения имеют теоретическое значение, так как расширяют научные представления о регуляции ростовых процессов у растений рапса при воздействии стрессовых условий культуры in vitro.
Впервые разработан метод получения гомозиготных линий рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro, позволяющий установить влияние эндо- и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии, определить оптимальные стадии развития эксплантов, выявить состав и последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации и микроразмножения гаплоидных и реституционных линий ярового рапса. Установленные параметры культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса in vitro дали возможность впервые разработать способ, позволяющий ускоренно (в 5-10 раз) получать исходный материал для гетерозиснои селекции, на который подана заявка на патент «Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса».
Впервые модифицирован состав питательной среды для получения гибридов от межвидовых и межродовых скрещиваний путем прямой регенерации из незрелых зародышей в условиях in vitro. Установлен оптимальный срок введения зародышей изучаемых отдалённых гибридов семейства Brassicaceae в культуру. Использование метода эмбриокультуры позволило получить межродовые гибриды между рапсом яровым и горчицей белой при использовании последней в качестве опылителя, что представляет определенный теоретический интерес для отдаленной гибридизации рапса.
Практическая значимость результатов исследований. С помощью культуры неоплодотворенных семязачатков получено 5 реституционных линий ярового рапса, которые были переданы в лабораторию селекции рапса ВНИПТИР и включены в её научно-исследовательскую работу.
Данные линии представляют ценность для использования в гетерозиснои селекции в качестве восстановителей фертильности и как перспективный исходный материал для селекции ярового рапса на скороспелость, качество семян и масла, устойчивость к полеганию и другие признаки.
Полученный в ходе применения эмбриокультуры гибридный материал может использоваться в практической селекции и дальнейших
7 фундаментальных и прикладных исследованиях. Среди полученных гибридов выявлены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой.
Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в ВУЗах.
Апробация работы. Основные положения исследовательской работы доложены и обсуждены на школах-семинарах молодых учёных Липецкой области: «Актуальные проблемы современной науки» (Липецк, 2004), «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2005, 2006); III и IV Международных конференциях молодых учёных и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007), школе молодых учёных «Экологическая генетика культурных растений» (Краснодар, 2005), Международной научно-практической конференции «Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели» (Липецк, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии в высших педагогических учебных заведениях» (Орехово-Зуево, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Международной научной конференции «Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2006), IX Международной научно-практической экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2006), на межвузовских научных конференциях преподавателей, аспирантов и студентов (Липецк, 2003 - 2006 гг.) и заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИПТИР (Липецк, 2004 - 2007 гг.).
8 На защиту выносятся следующие положения:
1. Экспериментальное обоснование влияния эндогенных и экзогенных
факторов на индукцию гаплоидии в культуре неоплодотворенных
семязачатков в условиях in vitro, позволяющее ускоренно получать новый
исходный материал ярового рапса.
Способ создания реституционных линий рапса, основанный на индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, стабилизации, микроразмножении и диплоидизации полученных регенерантов.
Параметры эмбриокультуры, заключающиеся в определении влияния направления скрещиваний и оптимизации условий культивирования зародышей отдаленных гибридов.
4 Ценные признаки полученных гибридных растений и реституционных линий.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и рекомендаций для практического использования. Работа иллюстрирована 52 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 19 таблиц. Библиография включает 222 литературных источника, из которых 135 на иностранных языках.
Биотехнологические методы в селекции ярового рапса
Рапс яровой (Brasstea napus L. subsp. oleifera annua Metzg.) возделывается во многих странах мира, в том числе и в России, главным образом как масличная культура. В мировом сельскохозяйственном производстве на долю рапса приходится 12 % (24-26 млн. га) общей площади посевов масличных культур. По валовому сбору семян, достигшему 44-46 млн. тонн в 2004-2005 гг., рапс занял вторую позицию после сои. Объем производства рапсового масла составляет более 15 % в совокупном мировом производстве растительных масел (Горлов и др., 2006).
В состав рапсового масла входит большое количество ненасыщенных жирных кислот (олеиновая, линолевая, линоленовая), которые являются незаменимыми в питании человека (Осипова, 1998). По вкусовым качествам рапсовое масло канольных сортов (низкоэруковых, низкоглюкозинолатных, с высоким качеством пищевого масла и белкового шрота) приравнивается к оливковому и считается одним из лучших растительных масел.
Рапс используют также в качестве кормовой, технической культуры, как зелёное удобрение и хороший медонос. Широкое применение продукция из рапса находит в химической, металлургической, перерабатывающей и других отраслях промышленности. По пищевым и кормовым достоинствам он значительно превосходит многие сельскохозяйственные культуры. В его семенах и рапсовой муке содержится 40-48 % жира и 22-24 % переваримого протеина, что в 1,9-4,0 раза больше, чем в гороховой, пшеничной, ячменной муке (Артемов, Карпачев, 2006). Кроме этого, интерес к яровому рапсу обусловлен также хорошей приспособленностью этого растения к умеренному климату (Рапс озимый и яровой, 1988).
По мере усложнения селекционных задач возрастают требования к исходному материалу ярового рапса. В последнее время развивается новое направление селекции - создание желтосемянных безэруковых и низкоглюкозинолатных «000» сортов рапса (Осипова, 1998). В целях ускорения селекционного процесса, создания принципиально новых форм, улучшения существующих, массового их размножения, хранения, более точной оценки и отбора селекционного материала в селекции рапса используются биотехнологические методы. Методам культуры клеток и тканей в решении этих вопросов отводится значительное место.
Выбор растительного объекта при использовании метода культуры ткани имеет решающее значение. Для растений семейства Brassicaceae наиболее характерно в качестве эксплантов в работах по регенерации растений использовать семядоли, гипокотиль, части соцветий и листьев (Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты, 2004).
Использование в качестве экспланта частей бутона позволило клонально размножить стерильные или самонесовместимые растения капусты с низкой завязываемостью семян, выделенные в период цветения растений. Эффективность такой методики была показана также при размножении стерильных растений сурепицы яровой (Brassica campestris L.) (Yang et al., 2000).
Для рапса отмечалась успешная регенерация растений из каллуса, индуцированного практически из всех видов эксплантов: корней, стеблей, листьев, семядолей (Jain at al., 1988; Sharma, Thorpe, 1989).
С разработкой техники получения растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие среди клеточных линий и растений-регенерантов называют «сомаклоны».
Отбор и испытание генотипов из сомаклонов с целью использования этого метода в селекции на устойчивость проводят на селективных средах in vitro. Так, через каллусную культуру были выделены солеустойчивые растения из протопластов и полученных из них каллусов (Ролдугина, Пескова, 1988). Из культуры протопластов (Bundgaard, Buchwaldt, 1989) и из гаплоидного каллуса (MacDonald et al., 1989) также были получены растения рапса, устойчивые к альтернариозу {Altemaria brassica).
Кроме этого, важными предпосылками экономически выгодного использования метода культуры тканей ярового рапса являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности, а также экономия времени при размножении in vitro, что дает возможность эффективно включать его в селекционный процесс.
Большие перспективы в селекции рапса открывает и соматическая гибридизация - слияние изолированных протопластов соматических клеток. В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплазмы) создаются уникальные возможности для получения новых комбинаций генов, которые очень трудно получить с применением классических методов генетики и селекции, но они могут представлять практический интерес для селекции (Атанасов, 1993). Например, перенос цитоплазматических генов ЦМС и генов восстановления фертильности от Moricandia arvensis к Brassica juncea L., стал возможен с помощью соматической гибридизации (Prakash, 1998). Кроме этого, применение метода слияния протопластов позволило получить жизнеспособные межродовые гибриды между горчицей белой {Sinapis alba L.) и рапсом {Brassica napus L.), резистентные к вредителям и болезням, которые трудно получить посредством половой гибридизации (Primard et al., 1988; Lelivelt et al., 1993; Chevre et al., 1994; Plumper, Sacristan, 1995). Также в результате соматической гибридизации были получены гибриды Brassica napus L. и Brassica nigra L., устойчивые к Phoma lingam (Sjodin, Glimelius, 1989; Gerdemann-Knoerck et al., 1994), Sinapis alba L. и Brassica oleracea, устойчивые к альтернариозу (Hansen, Earle, 1997; Sigareva et al., 1999), Brassica napus L. и Raphanus sativus, устойчивые к поражению нематодами (Heterodera schachtii Schm.) (Lelivelt, Krens, 1992) и т. д.
Помимо этого, при слиянии протопластов рапса, изолированных из гаплоидной цитоплазматической атразиноустойчивой линии и гаплоидной линии с ЦМС, были получены диплоидные гибриды, характеризующиеся ЦМС и устойчивостью к гербициду атразину (Chuong at al., 1988).
Применение методов in vitro в получении отдаленных гибридов у растений семейства Brassicaceae
Основой любой селекционной программы является расширение диапазона генетической изменчивости с целью отбора желаемых признаков для улучшения возделываемых сортов сельскохозяйственных культур. Одним из методов решения данной задачи является отдаленная гибридизация. Этот вопрос особенно актуален для селекции рапса, так как большинство современных сортов ярового рапса, созданных к концу XX века, имеют узкую генетическую основу в связи с тем, что получены на основе безэрукового сорта Ого и низкоглюкозинолатного сорта Bronowski (Жидкова, Карпачёв, 1996).
С помощью отдалённой гибридизации для данной культуры возможно повысить урожайность, устойчивость к вредителям и болезням, улучшить жирнокислотныи состав масла семян, увеличивая содержание олеиновой и линолевои кислот и уменьшая содержание линоленовои кислоты, получить семена с жёлтой семенной оболочкой, характеризующихся улучшенным качеством масла (в отличие от тёмноокрашенных) и т. д. Однако лишь ограниченное число межвидовых и межродовых скрещиваний в семействе Brassicaceae может привести к получению полноценных гибридных растений. Трудности создания отдалённых гибридов обусловлены барьерами несовместимости, которые выражены между растениями разных таксономических групп с момента опыления, а затем проявляются на протяжении всего онтогенеза гибридных растений.
Для преодоления естественных барьеров несовместимости разработаны биотехнологические методы изолирования и выращивания в условиях in vitro незрелых и зрелых зародышей, завязей и семязачатков, что позволило получить фертильные растения межвидовых и межродовых гибридов многих важных сельскохозяйственных культур: озимой пшеницы (Барабанова и др., 1988), ржи (Першина и др., 2003), хлопчатника (Азизходжаев, Даминова, 1988), сахарной свеклы (Васильченко, Подвигана, 2005), кукурузы (Прасад и др., 1988), томата (Тодераш, 1988), лука (Титова, 1988) и многих других.
Первый фертильный аллополиплоидный капустно-редечный гибрид получен Г. Д. Карпеченко в 1927 году, и им же показаны причины нескрещиваемости разных видов и пути ее преодоления (Карпеченко, 1927).
Большие перспективы при неспособности пыльцы к прорастанию открывает метод опыления рыльца, верхушки завязи (после удаления рыльца или столбика) или непосредственно изолированной завязи в условиях in vitro. Этот метод используется для преодоления прогамной несовместимости, выражающейся в неспособности пыльцы прорастать на рыльце пестика, а пыльцевых трубок достигать семязачатка из-за чрезмерной длины столбика, медленного роста пыльцевых трубок или разрывов пыльцевых трубок в столбике. Возможность оплодотворения в условиях культивирования изолированных семязачатков возрастает при удалении рыльца, столбика, стенок завязи (Першина, Шумный, 1991).
Опыление и оплодотворение in vitro оказалось необходимым для создания отдалённых гибридов между рапсом (Brassica парт) и другими представителями семейства Brassicaceae: В. oleracea, Arabis caucasica, Diplotaxis tenuifolia, Moricandia arvensis, Sysymbrium loeselli и Sinapis alba. Оплодотворённые завязи и развивающиеся зародыши культивировали на питательной среде MS с добавлением никотиновой кислоты и миоинозитола (Zenkteler, 1990).
Успех оплодотворения определяется совместимостью мужского и женского растений, в то время как выживание образовавшегося в результате оплодотворения зародыша обусловлено как нарушениями в клетках самого зародыша, так и отрицательным влиянием на их формирование аномально развивающихся эндоспермов и тканей, окружающих зародышевый мешок. Постгамная несовместимость, вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма, служит значительным препятствием во многих гибридных комбинациях скрещивания (Егорова, 2003). С целью её преодоления во многих экспериментах по созданию отдалённых гибридов растений успешно используется метод культивирования зародышей. Данный метод для получения межвидовых гибридов растений семейства Brassicaceae первым использовал в 1959 году Nishi S. (цит. по Gowers at al., 1999).
Барьер несовместимости при развитии гибридного зародыша часто возникает на средних и поздних стадиях эмбриогенеза. Обычно это проявляется в нарушении развития эндосперма или полном его отсутствии, что приводит к гибели зародышей. Специально подобранный состав компонентов питательных сред для культивирования незрелых зародышей предоставляет все необходимые вещества для нормального развития зародыша и, таким образом, заменяет эндосперм. Несмотря на то, что состав питательных сред варьирует в зависимости от вида культивируемых зародышей, очевидно, что чем менее развит зародыш, тем выше требования к составу питательных сред. Например, если относительно зрелые зародыши можно выращивать на средах только с добавлением солей и сахарозы, то для нормального развития зародышей, изолированных на ранних стадиях, необходимы витамины, аминокислоты, фитогормоны, а также сложные комплексные добавки в виде экстракта дрожжей, гидролизата казеина, кокосового молока и др. Полученные гибридные растения доращивают в условиях теплиц (Атанасов, 1993).
Для увеличения генетического разнообразия внутри рода Brassica были получены гибриды от скрещивания горчицы абиссинской (В. carinatd) с сурепицей яровой (В. campestris) с использованием метода эмбриокультуры (Starzycki, Krzymanski, 1987), дикого вида Diplotaxis siifolia и культивируемых видов Brassica: В. juncea и В. napus (Batra et al., 1990). Аналогично были получены гибриды в комбинациях скрещивания видов рода Brassica и Raphanus (Tang, Williams, 1988), видов рода Sinapis и Brassica napus (Mathias, 1991; Momotaz et al., 1998), Eruca sativa x B. rapa (Robers et al., 1999), B. oleracea x Raphanus sativus (Sarashima et al., 1980), Diplotaxis tenuisiliqua x B. campestris (Sarmah, Sarla, 1998), B. napus и В. juncea (Bajaj et al., 1986; Zhang et al., 2003).
Получение отдалённых гибридов с помощью культивирования зародышей in vitro играет немалую роль для повышения устойчивости к биотическим и абиотическим факторам. Например, реципрокные скрещивания горчицы белой (Sinapis alba L.) с рапсом (Brassica napus L.) проводили для повышения устойчивости к Alternaria (Ripley, Arnison, 1990; Brown et al., 1997), B. napus с В. oleracea с целью переноса устойчивости к триазину (Ayotte et al., 1987), B.napus с В. juncea и В. carinata для переноса устойчивости к Phoma lingam (Sacristan, Gerdemann, 1986). Гибриды Brassica napus x Brassica oleracea характеризовались устойчивостью к тле (Quazi, 1988; Gowers, Christey, 1999), а гибриды от скрещивания Eruca sativa и В. campestris - не только устойчивостью к тле, но и высокоурожайностью (Agnihotri et al., 1990). Помимо этих признаков, гибриды от комбинации скрещивания В. juncea х В. tournefortii проявили также устойчивость к засухе (Goyal et al., 1997; Kumar et al., 2001), а гибриды В. oleracea и В. campestris -холодоустойчивость (Kudou et al., 1995).
Кроме того, в Германии разработана система успешного переноса ЦМС от редиса к рапсу методом культуры зародышей. Исследователи Paulmann W., Robbelen G. (1988) не только перенесли гены восстановления фертильности редиса в рапс, но получили линии с мужской стерильностью, имеющие зеленые хлоропласты при низких температурах (Paulmann, Robbelen, 1988).
Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии
Генотип исходных растений является одним из факторов, играющих ведущую роль в регуляции роста и развития культивируемых семязачатков разных объектов: сахарной свеклы (Белоус и др., 1988; Подвигана, 1994; Ра-фаилова и др., 1997), герберы (Meynet, 1986), лука (Gemesne, Martinovich, 1995), фиалки душистой (Wijowska, 1999) и т. д.
Установлено, что генотип растений-доноров был одним из основных факторов, влияющих на эмбриоидогенез у всех исследованных видов рода Brasska, где применялась культура пыльников и микроспор (Dietert at al., 1982; Thurling, Chay, 1984; Ockendon, 1985; Chuong, 1988; Arnison et al., 1990; Baillie et al., 1992; Burnett et al., 1992). Даже в пределах одного генотипа наблюдались значительные отличия (Seguin-Swartz et al., 1983; Phippen, Ockendon, 1990).
В результате проведенных нами исследований выявлено, что генотип растения-донора определял способность неоплодотворенных семязачатков ярового рапса к дальнейшему развитию. Проведенные исследования показали, что развитие неоплодотворенных семязачатков ярового рапса шло по пути образования каллуса с последующей регенерацией ростовых почек. Аналогичные результаты были получены у других культур, например, у риса (Zhou, Yang, 1981), герберы (Mamar, 1986), картофеля (Калинин, 1988), кориандра, лаванды и шалфея мускатного (Бугара, Русина, 1988; 1989).
Из 16 изученных генотипов ярового рапса 15 были способны к каллу-сообразованию, 10 обладали способностью к индукции ростовых почек и только у пяти генотипов почки развивались в растения.
Каллус второго типа (морфогенный) становился визуально заметным на 18 - 20-й день культивирования и имел белую или бледно-жёлтую окраску, плотную консистенцию и зернистую или глобулярную структуру. Массовое формирование и развитие каллуса наблюдали за период с 30-го по 45-й день после изоляции, что согласуется с данными других исследователей (Славова, Рафаилова, 1991). В процессе культивирования в нем образовывались проэм-бриогенные массы или меристематические зоны (рис. 7).
В дальнейшем из этих меристематических очагов путем последующей дифференциации тканей формировались сначала ростовые почки, а затем растения (рис. 8).
Следует отметить, что в 98% случаев наблюдался процесс развития вегетативной почки (вегетативный геммогенез). Формирующиеся гаплоидные регенеранты имели слабо развитый гипокотиль с двумя-тремя узкими листовыми пластинками бледно-зеленого цвета (рис. 9). Отмечались единичные случаи генеративного геммогенеза, когда растение высотой не более 2,5 см образовывало бутоны (рис. 10).
Частота индукции каллусных структур колебалась от 0 до 7,10 % в зависимости от генотипа донорского растения. У сортов и самоопыленных линий со стерильной цитоплазмой выявили самую низкую частоту каллусооб-разования, которая составила 1,15 % и 2,43 %, и регенерации (1,67 % и 3,85 % соответственно) (рис. 11). Сорта и линии более чем в 2 раза уступали материалу гибридного происхождения по количеству ростовых почек (12,46 %).
Полученные данные находят подтверждение в экспериментах других исследователей (Рафаилова и др., 1997; Кио, 1982; Chekurov, Razmakhnin, 1999), отметивших повышение регенерационной способности у гетерозиготного материала в сравнении с линейным.
Максимальную частоту регенерации среди линий наблюдали у № 13 -полученной на основе сорта Hanna самоопыленной линии со стерильной цитоплазмой (15,38 %). Сорт Hanna также проявил способность к индукции морфогенного каллуса и образованию ростовых почек (11,11 %), что подтверждает ещё раз зависимость регенерационной способности от генотипи-ческих особенностей растительного материала. Наибольшей склонностью к индукции гаплоидии среди сортов ярового рапса обладал № 9 (Липецкий) -6,67 %.
Часть генотипов (№ 1, 10, 14, 15, 16) формировала нерегенерационный каллус. Генотипы № 4, 5, 11, обнаруживали относительно высокий выход ростовых почек (10,71 %, 12,5 % и 11,11 % соответственно), однако, при пересадке их на среду для регенерации не отмечалось дальнейшего развития.
Таким образом, у ярового рапса способность к каллусообразованию и регенерации растений в культуре неоплодотворённых семязачатков зависела от генотипа донорского растения. Для реализации морфогенетических потенций у остальных сортов, линий и гибридов необходимо подобрать соответствующие добавки гормонов к питательной среде в определённых комбинациях и количествах. Условия культивирования, подобранные для какого-либо одного генотипа, могут оказаться непригодными для другого и требовать существенных изменений.
Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro
Семена ярового рапса могут быть темноокрашенными и желтыми. В семенах с жёлтой окраской содержится больше белка, масла и меньше сырых волокон, чем в таковых чёрной и коричневой окраски (Потапов, 2004). С использованием таких желтосемянных сортов (тип «000») повышается кормовая ценность жмыха (Robbelen, 1981) и выход масла при переработке.
Окраска семенной кожуры рапса наследуется нестабильно и определяется тремя независимыми генами, которые в рецессивном состоянии вызывают чисто желтую окраску (Barcikowska et al, 1987).
Первые желтосемянные растения ярового рапса были выделены самоопылением из образца ВИР к-4984, имеющего примесь пёстрых по окраске семян. Самоопыление таких растений до Із не дало константных форм. Положительный эффект был достигнут у-облучением семян с желтосемянной окраской, выделенных в 13, и последующим самоопылением растений в М, Мг и Мз- В результате были выделены перспективные образцы безэрукового желтосемян-ного рапса (Бочкарева, 2000).
Для получения желтосемянных форм рапса применяется также межвидовая гибридизация, при которой рапс с частично жёлтой окраской скрещивается с желтосемянными формами видов рода Brassica: горчицей сарептской (В. juncea) и сурепицей яровой (В. campestris) и межродовая гибридизация с горчицей белой {Sinapis alba). При использовании отдаленной гибридизации во ВНИПТИР желтосемянные линии впервые были выделены в Fg (Жидкова, Кар-пачёв, 1999). В результате длительной селекционной работы во ВНИИМК создан первый перспективный сорт ярового желтосемянного рапса Янтарь, характеризующийся по сравнению с сизосемянными сортами более высокой маслич-ностью семян, более высоким содержанием углеводов и более низким - лузги, клетчатки и глюкозинолатов (Бочкарева и др., 2004).
Однако лишь ограниченное число межвидовых и межродовых скрещиваний может привести к получению полноценных гибридных растений. С целью преодоления барьеров несовместимости в экспериментах по созданию отдалённых гибридов растений используется метод культивирования незрелых зародышей.
Так как гибридные зародыши абортируются на очень ранних стадиях развития, то желательно введение их в условиях in vitro проводить как можно раньше. Однако, из-за мелких размеров эксплантов (менее 2 мм) изолирование зародышей на сердцевидной, ранней торпедовидной и более поздних стадиях оказалось безуспешным. Поэтому нами для дальнейших исследований в качестве эксплантов были взяты оплодотворенные семязачатки без изолирования зародышей. Основное преимущество этого метода состоит ещё и в том, что состав используемых питательных сред более прост, чем при культивировании незрелых зародышей, более того, семязачатки выделяются намного легче, чем незрелые зародыши (Атанасов, 1993). Скрещивания рапса ярового (В. napus, 2п=38) и горчицы сарептской (В. juncea, 2п=34) Основной задачей данных скрещиваний являлся перенос рапсу от горчицы белой желтой окраски семенной оболочки, а также устойчивости к альтер-нариозу. В проведенных исследованиях эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне - 5,6 % и 1,7 % в обратных скрещиваниях.
Увеличить жизнеспособность зародышей в 1,8 в прямом и в 2,9 раза в обратном скрещивании удалось с применением эмбриокультуры. При использовании рапса в качестве отцовского компонента скрещивания средняя частота образования проростков (16,4 %) была в 5,3 раза больше, чем в прямых скрещиваниях (3,1 %) (табл. 16). Полученные результаты подтверждают литературные данные о получении максимальной частоты образования проростков, если В. juncea использовалась в качестве материнской формы, а В. napus - в качестве отцовской (Bajaj et al., 1986; Zhang et al., 2003). При этом они не согласуются с мнением о том, что в отдалённой гибридизации лучшие результаты обычно удаётся достичь в тех случаях, когда в качестве материнского компонента используют вид с большим числом хромосом (Жученко, 2004).
Скрещивания рапса ярового (Brassica napus, 2п=38) и горчицы белой (Sinapis alba, 2п=24) Скрещивания рапса ярового с горчицей белой также проводились с целью переноса болезнеустойчивости, желтосемянности и признака крупности семян. Получение истинных межродовых гибридов горчицы белой с рапсом в полевых условиях затруднено. Проведенные исследования показали, что эффективность гибридизации находилась на низком уровне и достигала 1,2 % в прямом и 0,2 % в обратном скрещиваниях. В условиях in vivo семена или не образовывались совсем, или из-за гибели зародышей становились стерильными и
В результате применения культуры незрелых зародышей регенерация проростков гибридов (1,9 %) получена только в комбинации скрещивания рапс яровой х горчица белая, что подтверждает литературные данные о более успешной гибридизации между многими видами рода Brassica, если в качестве материнского растения выступают высокохромосомные виды (Жидкова, Шапошникова, 2005). Однако наши результаты не согласуются с данными Ripley о получении истинных гибридов в случае, если горчица белая взята в качестве материнской формы (Ripley, Arnison, 1990).
Таким образом, в скрещиваниях рапса с горчицей белой наиболее эффективным оказалось культивирование гибридных зародышей, если рапс был материнской формой, а с горчицей сарептской - отцовской формой.
