Содержание к диссертации
Введение
1 Материалы и методы исследований 20
1.1. Материалы исследований 20
1.2. Методика проведения исследований 23
1.3. Электрофоретический анализ изоферментов 24
1.4. Электрофоретическое фракционирование глобулинов 27
1.5. Математическая обработка экспериментальных результатов исследований 28
2. Молекулярно - генетические маркеры в геномном анализе сахарной свеклы 30
2.1. ДНК-маркеры в изучении генома сахарной свеклы 31
2.2. Полиморфизм запасных белков в геноме сахарной свеклы 55
2.3. Органная специфика экспрессии белков и изоферментов в онтогенезе сахарной свеклы 61
3. Использование генетического маркирования в селекционном процессе сахарной свеклы 74
3.1. Изоферментный контроль гомозиготности 74
3.2. Оценка инбредных линий сахарной свеклы по структуре белковых спектров 102
3.3. Изоферментный контроль гибридизации 116
3.4. Взаимосвязь ферментных локусов с хозяйственно-полезными признаками 132
3.5. Метод подбора родительских компонентов для гибридизации 138
3.7. Использование генетического маркирования в процессе создания гомозиготных линий сахарной свеклы 158
3.8. Создание гибридов сахарной свеклы на стерильной основе с использованием маркированных гамма-линий 177
4. Молекулярные маркеры в изучении генетической структуры сортов и гибридов сахарной свеклы . 186
4.1. Генетическая изменчивость в популяциях сахарной свеклы
4.2. Полиморфизм молекулярных маркеров у сортов и гибридов сахарной свеклы 193
4.3. Метод кластерного анализа в изучении происхождения сортов и гибридов сахарной свеклы 208
4.4. Внутрисортовая изменчивость по молекулярным маркерам 219
5. Идентификация и паспортизация селекционных материалов сахарной свеклы 227
5.1. Способ идентификации сортов сахарной свеклы по изоферментным ло-кусам 228
5.2. Информационные технологии при проведении паспортизации селекционных материалов сахарной свеклы 241
Заключение 252
Выводы 254
Предложения для практического использования 257
Литература 258
- Электрофоретическое фракционирование глобулинов
- Органная специфика экспрессии белков и изоферментов в онтогенезе сахарной свеклы
- Использование генетического маркирования в процессе создания гомозиготных линий сахарной свеклы
- Метод кластерного анализа в изучении происхождения сортов и гибридов сахарной свеклы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современное сельское хозяйство требует резкого ускорения процесса создания сортов и гибридов растений, сочетающих устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам с высоким потенциалом продуктивности и приспособленностью к энергосберегающим, экологически безопасным технологиям. Селекция по большинству хозяйственно-ценных признаков подошла к биологическим границам повышения продуктивности. И сегодня главным становится повышение устойчивости организмов и улучшение качества получаемой от них продукции. Традиционные методы отбора по таким признакам становятся малоэффективными, поэтому необходим поиск новых подходов, одним из которых является использование методов биохимической генетики. Они дают возможность объективно оценивать генетически детерминированные биохимические особенности растения, популяции, линии, сорта, сравнивать их между собой, а также планировать подбор пар для скрещиваний, контролировать направление и сокращать время селекционного процесса (при создании новых сортов и гибридов).
Основная область применения методов биохимической генетики - селекционная работа, поиск и создание уникальных генофондов, поскольку изменчивость, которую мы наблюдаем, есть реальное отражение микроэволюционных или формообразовательных процессов, протекающих в популяциях в настоящее или прошедшее время (Глазко, Созинов, 1993).
Обычно селекционеры в своей работе применяют традиционные методы селекции - гибридизацию, отборы, полиплоидию, привлечение форм с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Данные методы очень трудоемки, затратны и ведут, как правило, к сужению генетической изменчивости и уменьшению многообразия исходного генетического материала
В связи с этим проблема получения нового исходного материала для селекции становится весьма актуальной.
5 Успехи селекции сахарной свеклы и перспективы ее развития определяются многими факторами, однако решающее значение имеют следующие: генетические ресурсы селекции, ее исходный материал; арсенал средств, приемов и методов селекции, в числе которых биотехнология; методы генетического анализа исходного и селекционного материала, быстрая, точная и экономичная оценка генетической конструкции объекта, без чего даже самые современные средства селекции остаются эмпиричными.
Независимо от средств и методов селекции самая сложная часть работы - выявление генетической изменчивости в исходном материале и отбор желаемых генотипов. Эти трудности обусловлены, во-первых, фенотипиче-ской изменчивостью, пределы которой особенно широки у таких важных, но генетически сложных признаков, как устойчивость к неблагоприятным факторам среды и возбудителям болезней, качество урожая и продуктивность сорта; во-вторых, наличием у сортов, популяций и видов, так называемой, скрытой генетической изменчивости, обусловленной рецессивностью аллелей, супрессиями в межгенных взаимодействиях. Запасы такой изменчивости составляют генетический потенциал формообразования вида и популяций, но в силу сложности обнаружения селекционеру они малодоступны, а некоторые из них обычными методами генетического анализа совсем не раскрываются. Методы традиционной классической генетики часто громоздки, как правило, почти не эффективны в анализе сложных признаков и не выявляют многие формы скрытой генетической изменчивости. Соответственно они не могут обеспечить переход селекции и семеноводства на полностью контролируемый технологический процесс (Конарев, 1993). Нужны дополнительные средства и новые подходы, которые позволили бы, во-первых, наиболее полно раскрыть генетический потенциал сортов, популяций и видов для селекции, во-вторых, оценивать генетическую конституцию растения непосредственно - без скрещиваний и длительных процедур генетического анализа, в-третьих, осуществлять точный и быстрый контроль включением желаемого генетического материала в создаваемые сорта и гибриды.
Решение данных проблем возможно только путем использования моле-кулярно-генетического маркирования (Конарев, 1983; 2001; Созинов, 1985; Глазко, Созинов, 1993). Генетические маркеры играют исключительно важную роль в оценке наследственной конституции организма и служат одним из главных средств селекции. В основном для этого до сих пор используют морфологические признаки. Однако набор их в сравнении с числом генов и генетических систем в организме весьма ограничен. К тому же подавляющая часть их нестабильна, зависит от условий развития организма. Совершенно новые возможности генетического маркирования появились с привлечением белковых признаков, которые положены в основу принципов и методов маркирования генетических систем растения.
Белковые маркеры имеют ряд существенных преимуществ перед морфологическими на генном уровне. Они дают возможность более точно идентифицировать генные локусы и таким путем позволяют в генетическом анализе избегать проблем, связанных с влиянием других локусов (Конарев, 1983; Левитес, 1986; Созинов, 1993).
Естественно, белковые маркеры не могут полностью заменить морфологические, они взаимодополняют друг друга. В то же время у белковых маркеров больше преимуществ: они более генотипичны, позволяют точнее идентифицировать локусы генома и выявлять многочисленные генетические изменения, не затрагивающие морфологические признаки.
С появлением биохимических методов исследования, в частности, изо-ферментного анализа, были созданы принципиально новые возможности для решения этих проблем,
Изоферменты обладают кодоминантным характером проявления, позволяющим оценивать гомо- и гетерозитотность растений по генам, контролирующим данные ферменты. Кроме того, для растений в настоящее время разработаны методы электрофоретического и гистохимического анализа более 50 ферментных систем. Поскольку каждая из них, как правило, контро-
7 лируется двумя - тремя генами, то число локусов, потегщиалъно пригодных
для изучения, достаточно велико.
Генетический анализ многих важных в практическом отношении признаков культурных растений затруднен сложностью фенотипического проявления этих признаков. Среди различных методических приемов, облегчающих исследования, особое место занимает метод генетических маркеров или «сигнальных генов», подробно разработанный известным генетиком А. С.
Серебр ОБСКИМ.
«Сигнальными генами» или «сигналами» автор называл «удобные для менделистических наблюдений альтернативные гены, которые не влияя на изучаемый трансгрессирующий признак, или влияя достаточно определенным образом, облегчают генетический анализ этого признака, позволяя следить за наследованием того участка хромосомы, в котором эти сигнали расположены» (Серебр овский, 1970).
В генетике маркером обычно называют ген известной локализации, по которому можно выявить другие гены. В практике генетического анализа экспериментатор, как правило, имеет дело не с самим геном-маркером, а с его каким-либо фенотипическим выражением, представляющим собой конкретный, хорошо различимый, дискретный, то есть качественный признак. Такой признак можно рассматривать как фактор идентификации соответствующего ему гена, то есть маркер самого гена (Конарев, 1983).
Для успешного проведения исследований по селекции сахарной свеклы очень важно изучение маркерных генов, необходимых в работе по контролю скрещивания линий.
Долгое время селекционное улучшение сортов сахарной свеклы проводили по морфологическим признакам таким, как: форма розетки, форма листовой пластинки, скрученность или морщинистость корня, форма и масса корнеплода и др. (Гринько, 1940, Мазлумов, 1950; Неговский, 1963, Орловский, 1968 и др.).
8 Результаты первых исследований отдельных морфологических признаков сахарной свеклы, имеющих менделевское наследование, были отражены в нескольких обзорах (Keller, 1936; Савицкий, 1940; Буренин, Красочкин, 1971), положивших начало генетическому изучению этих признаков для селекционных целей. В частности, в селекции используются в качестве маркеров гены Тг и С1, вызывающие у свеклы пятнистую окраску листьев. Популяции, маркированные этими генами, применяют для опыления линий с целью оценки последних по признаку общей комбинационной способности (ОКС) (Парий, Долотий, 1983). Для контроля выхода гибридов в парных скрещиваниях использовали ген R (red hypocotyl), контролирующий окраску гипоко-тиля (Мазепин, 1971).Показано, что окраска гипокотиля связана с продуктивностью и может использоваться для определения гибридности при скрещивании гомозиготных по генам г и К линий сахарной свеклы. Гибридностъ можно установить только у линий, гомозиготных по рецессивному алле-лю(гг). Эта особенность проявление генов окраски (отношения доминантности и рецессивности) аллелей затрудняет их широкое использование в селекционных работах.
В работе польского исследователя М. Яссема (Jassem, 1997) предлагается использовать окраску гипокотиля в качестве сортового признака при идентификации. В исследованиях И. И. Лялько была выделена новая мутация листового аппарата сахарной свеклы - опушенность листовых пластинок (Hairy leaf) и показана эффективность использования ее как маркера закрепителей стерильности (Лялько, 1999; Лялько и др., 1999).
Наряду с морфологическими признаками в селекции сахарной свеклы широко применялся отбор но биологическим признакам таким, как скороспелость, величина и энергия роста проростков, окраска листьев и т.д. (Федорович, 1940;Мазлумов, 1950).
Для повышения эффективности селекционного процесса сахарной свеклы были привлечены различные физиолого-биохимические признаки, использование которых позволило создать известные сорта сахарной свеклы,
9 например, Рамонский-100 сахаристого направления с повышенными технологическими качествами, обеспечивающими высокий выход сахара на сахарном заводе.
С использованием морфологических признаков было выведено большинство многоростковых сортов сахарной свеклы. Так, долгие годы возде-лывался в производстве сорт Рамонская 1537, отличающийся высокой энергией начального корнеобразованяя и листообразования, обеспечивающих повышенную продуктивность.
Более 40 лет выращивался широко пластичный сорт Рамонская 06, созданный методом гибридизации и отбора по морфологическим признакам и отличающийся засухоустойчивостью, скороспелостью и малоцветушностыо (Якименко, Сушков, Юсубов, 1992).
Возможность изменения принципов отбора и формирования сортов и гибридов сахарной свеклы возникла благодаря успехам исследований по частной генетике. Это в первую очередь относится к результатам изучения систем размножения у сахарной свеклы (внутривидовой несовместимости и ци~ топлазматическои мужской стерильности, признака раздельноплодности и возможности получения полиплоидных (тетраплоидных форм)) (Юсубов, Мосина, 1969; Голев, 1972; Жужжалова, 1972, 1999; Малецкий, 1974; Балков, 1978; Знаменская, 1985).
Это позволило увеличить количество маркерных генов у сахарной свеклы. Так, топкроссные гибриды получают, скрещивая линии с фертиль-ным тестером, несущим маркерные гены окраски листьев, или со стерильным тестером, сформированным на широкой генетической основе (Малецкий, 1984).
Важным событием в изучении морфологических маркерных признаков было открытие питошіазматическои мужской стерильности (ЦМС) у сахарной свеклы (Owen, 1945; 1948; 1950). Было выявлено, что признак ЦМС контролируется двумя рецессивными локусами (х и z) и предложена схема получения межлинейных гибридов. Оуэном (Owen, 1942) также описан генетиче-
10 ский контроль самофертильности, и в дальнейшем самофертильность (S1) стали широко использовать для поддержания и получения новых линий закрепителей стерильности (линии О-типа). В то же время были выделены раз-дельноплодные линии сахарной свеклы и выяснено наследование признака раздельноплодности (Savitsky, 1952, 1958). В.Ф. Савицкому удалось выделить несколько раздельноплодных растении из сорта "Мичиганский гибрид 18", причем одно из выделенных растений имело генотип mmSSxxzz (гомозигота по генам раздельноплодности, самофертильности и генам, закрепляющим стерильность). Потомство этого единичного растения дало линию SLC 101, которая легла в основу работ по получению гибридных сортов раз-дельноплодной сахарной свеклы в США и странах Западной Европы.
Все это свидетельствует о том, что морфологические маркерные признаки сыграли и играют большую роль в селекции сахарной свеклы. Вместе с тем морфологические признаки, как генетические маркеры, малоинформативны, различия по ним между сортами не всегда достаточно четкие, сами признаки подвержены модификационной изменчивости. Оценка их проводится, как правило, на взрослых растениях, получение которых требует немалых производственных затрат (Аржанцев, 1988).
Идентифицировать сорта и гибриды сахарной свеклы по морфологическим признакам семян трудно. Поэтому сейчас ведутся активные исследования по поиску новых генетических маркеров у сахарной свеклы.
Большие перспективы открылись при использовании в качестве маркеров генов, контролирующих синтез отдельных белков и ферментов. Как правило, биохимические маркеры имеют простое наследование, четкое феноти-пическое проявление и кодоминантный тип наследования. Последнее свойство принципиально отличает биохимические признаки от признаков окраски, так как позволяет контролировать опыления в обоих направлениях скрещивания.
К настоящему времени молекулярно-генетические маркеры (запасные белки, изоферменты, ДНК-маркеры) нашли широкое применение в селекции
зерновых культур (Конарев, Гаврилюк, Губарева, 1970 а,б,в; Конарев, 1983, 1998; Попереля, Созинов, 1977, Созинов, Попереля, 1979 Созинов, 1985, 1993).
Однако на сахарной свекле генетическое маркирование не получило до сих пор всестороннего распространения в селекционной практике. Данные вопросы изучены недостаточным образом.
Наличие разнообразного и всесторонне изученного исходного материала, является основополагающим условием эффективности селекционной работы. При этом поиск новых маркеров, облегчающих проведение генетического анализа селекционных материалов и ускоряющих процесс по их созданию, играет особое значение. В этой связи использование молекулярно-генетического маркирования в практической селекции сахарной свеклы является одной из важных и актуальных проблем.
Поэтому методы маркирования селекционных материалов с использованием белковых маркеров, направленные на идентификацию биотипов, прогнозирование генетической совместимости и контроль гибридизации у сахарной свеклы потребовали активной разработки. Особенно широко эти исследования были проведены в Новосибирске в ИЦиГ СОАН и во ВНИИСС в Рамони (Воронежская область).
Для сахарной свеклы перспективно использование в качестве биохимических маркеров генов, определяющих синтез отдельных ферментов.
Преимущество использования изоферментов как фенотипических маркеров по сравнению с генетически обусловленными морфологическими признаками связано с тем, что ферменты являются прямыми продуктами активности генов и поэтому менее подвержены влиянию внешней среды (Scan-dalios, 1974).
Изоферменты кодируются конкретными генами и имеют кодоминант-ный тип наследования, что дает возможность маркировать не только контролирующие их локусы, но и тесно сцепленные с ними блоки генов. Это делает
12 их весьма удобными для проведения генетических экспериментов (Корочкин,
Серов, Пудовкин, 1977; Левитес, 1986).
Сведения, касающиеся изучения ферментов у сахарной свеклы можно разделить на три группы. Первая - данные о генетическом контроле ферментов. В настоящее время у сахарной свеклы изучен генетический контроль более десяти ферментов. Вторая группа - данные о генетическом полиморфизме. К третьей группе относятся сведения по изучению свойств ферментов в связи с различными физиологическими состояниями растений (Левитес, 1984).
К настоящему моменту у сахарной свеклы в пяти из девяти известных групп сцепления имеется по 2-3 маркерных гена (Денисова, 1999). Так, Сме-дом с соавторами выявлено сцепление локуса Idh-1 с локусом красной окраски гипокотиля (Smed, Van Geyt, Oleo, 1989). Показано сцепленное наследование структурного локуса алкогольдегидрогеназы, гена несовместимости и летального гена у сахарной свеклы (Малецкий, Коновалов, Агафонов, 1987; Коновалов, 2001).
Изоферментиые маркеры внесли большой вклад в изучение филогении в роде Beta (Abe Jun, Nakashima Hiroshi, Isuda Chikahiro, 1987; Wagner, Gim-bel, Wrickle , 1989; Abe Jim, 1991). С помощью изоферментов проведено тестирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Jung, Wehling, Zoplien, 1986).
Последующие исследования показали, что изоферментный состав у растений сахарной свеклы сортоспецифичен и не зависит от условий выращивания (Федулова, 1995).
Было предложено использовать изоферменты для идентификации сортов сахарной свеклы в селекции, семеноводстве и сортоиспытании на основе частоты встречаемости маркерных генов (А.с. №1672999,1999).
Вместе с тем литературные данные об использовании молекулярно-генетических маркеров при создании и поддержании исходного и селекцион-
13 ного материала сахарной свеклы ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данного вопроса.
Наибольшее распространение в качестве маркеров у сахарной свеклы получили запасные белки семян - 1 IS глобулины. Доказана стабильность их состава в различных условиях произрастания растений, проверена их изменчивость в общей пробе и в индивидуальных генотипах. В результате элек-трофоретического изучения 11S глобулина показано, что белковые маркеры могут быть использованы для идентификации геномов на видовом и линейном уровне, прогнозирования генетической совместимости и контроля гиб-ридности семян при межвидовой гибридизации (Лесневич, Борисюк, Болело-ва, 1988; Лесневич, 1990; Корниенко, 1990; Лисицына, Лисицын, 1990; Лесневич, 1999).
Анализ литературных источников позволяет заключить, что существуют все необходимые предпосылки для широкого использования белковых маркеров в селекции. Однако их применение пока еще не стало повсеместным.
Новые перспективы открываются в связи с возможностью использования в качестве молекулярно-генетических маркеров клонированных последовательностей ДНК, с помощью которых можно выявлять различия между генотипами.
Самым важным для селекции и генетики растений является ПЦР - анализ, который определяет молекулярно - генетический полиморфизм и может исследовать ДНК - специфичность и особенность генотипа (Сиволап, 2003).
Применение ДНК-технологий позволяет существенно расширить возможность традиционной селекции. Увеличению генетического разнообразия и вовлечению новых генов и аллелей в процесс селекции способствуют методы ДНК-генотипирования культурных растений и их диких сородичей, создание карт сцепления и физических карт генома с помощью ДНК-маркеров и клонирование генов на основе этих карт (mapbased gene cloning), а также конструирование новых генотипов растений "методами генетической
14 инженерии. Методы ДНК-генотипироБания и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker-assisted selection-MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно-ценных генов и локусов количественных признаков (quantitative trait loci - QTLs) в процессе селекции и обеспечить создание новых сортов с целым комплексом заданных свойств. Совокупность всех этих технологий получила название молекулярной селекции (molecular breeding, molecular selection) (Хавкин, 2003). Строго говоря, молекулярными маркерами являются не только фрагменты ДНК, но и запасные белки и изоферменты, если известен характер их наследования и картированы кодирующие гены.
За последние 5-7 лет в области молекулярной селекции целого ряда культур произошли решительные перемены; генетическая модификация растений стала практической технологией, и трансгенные сорта растений занимают сейчас свыше 50 млн га сельскохозяйственных земель; во многих странах стали общедоступными новые высокоразрешающие методы ДШС-генотипирования, основанные на полимеразнои цепной реакции (ПЦР); на основе ПЦР-ироизводных ДНК-маркеров созданы генетические карты десятков видов экономически важных растений; клонированы сотни ключевых генов, определяющих агрономически важные признаки у ведущих сельскохозяйственных культур; все увереннее обсуждается роль ДНК-технологий в ускорении процесса селекции; охране авторских прав селекционеров и защите продукции растениеводства от возможных фальсификаций (Хавкин, 1997; Кочиева, 1999).
Анализ литературных источников показал, что у сахарной свеклы для идентификации нормальной и стерильной цитоплазмы используются мито-хондриальные фрагменты ДНК. Стерильные и фертильные растения отличаются друг от друга низкомолекулярными суперсгжрализованными молекулами мтДНК, что было показано многими исследователями (Powling, 1981; Mandolino, Cocclii, Ranolli, 1988; Дударева и др., 1988; Комарницкий и др., 1988; Hallden, Lind, Bringelsson, 1989; Satom e.a., 1991; Dikalova e.a., 1997; Хворостов и др., 1997; 1998; Senda Mineo, O.Yasuguki, Tetsuo, 1998).
15 Оценка степени генетической изменчивости свеклы на основании анализа RFLP и таксономии рода Beta позволила подтвердить современную таксономию секции Beta vulgaris (Mita е.а., 1991; Raybould, Mogg, Clarke, 1996; Yulong, Brian, John, 1998 и др.) Впоследствии схожие данные были получены Л.В.Шаїок с коллегами (2003) в результате изучения полиморфизма рода Beta с помощью ПЦР-анализа.
Представляют интерес результаты работ по созданию генетической карты генома сахарной свеклы, включающей данные по сцеплению 248 ПДРФ (РРЬР)-маркеров и 50 маркеров RAPD (Barzen е.а., 1995; Uphoff, Wricke, 1995; Shondelmaier, Steinrucken, Jung, 1996; Schmidt, Helsop-Harison, 1996). Исследования в этой области продолжаются и в настоящее время (Kraft, 2001).
Большое практическое значение имеют работы английских и итальянских исследователей по созданию и картированию молекулярных (RFLP и RAPD) маркеров, сцепленных с устойчивостью к ризомании (Redtearr, Asher, 1997; Ciorio, Gallitele, Carriero, 1997).
Польскими учеными проведена идентификация генотипов свеклы по RAPD-маркерам (Baranski е.а., 1995). Полученные данные подтвердили высокий уровень информативности RAPD-анализа, в частности, при проведении родословного тестирования отдельных сортов и линий.
По данным международного института исследований сахарной свеклы (I1RB, Бельгия) на основе современных компьютерных технологий с использованием ДНК-маркеров создан информационный банк данных по генетическим ресурсам сахарной свеклы (Genneier, Frese, 2001).
Однако сравнительно медленная интеграция MAS в селекционные программы определяется многими причинами, среди которых следует отметить высокие первоначальные затраты на развитие ДНК-технологий, трудности выявления полезных ДНК-маркеров селектируемых признаков и особенно проблему полигенных признаков. Тем не менее, MAS быстро развивается, лабораторные методы ДНК-анализа и их приборное и программное обеспе-
чение совершенствуется, удельные затраты быстро снижаются и практические результаты становятся все более многочисленными. Создание геномных библиотек и полное секвенироваиие геномов существенно облегчает поиск и использование ДНК-маркеров генов и признаков. В итоге из вспомогательного инструмента селекционеров MAS сможет стать фактором, который существенно изменит не только технологию, но и идеологию селекции (Gupta е.а., 1999; Barr е.а., Dreher е.а., 2000; Dudley, 2002; Ribaut е.а., Ribaut, Hoisington, 1998; Stuber, Polacco, Senior, 1999; Young, 1999; Young, Mudge, 2002).
Таким образом, анализ литературных источников свидетельствует о большой теоретической и практической значимости в селекции различных методов генетического маркирования.
Однако наибольшее распространение получили в качестве генетических маркеров запасные белки и изоферменты из-за относительной дешевизны и быстроты проведения анализов.
Это предполагает разработку для сахарной свеклы методов ускоренного получения нового исходного материала с использованием генетического маркирования для практического использования их в селекционном процессе.
Все вышеизложенное определило важность и актуальность настоящей работы, в ходе которой предполагалось более детальное изучение закономерностей молекулярно-генетического маркирования и использование их в селекционной работе по сахарной свекле. Решению данной проблемы и были посвящены наши исследования.
В связи с этим большую актуальность приобретает разработка методов молекулярно-генетического маркирования для практического использования в селекционном процессе сахарной свеклы, включая отборы при создании исходного материала и оценку при гибридизации.
Цель наших исследований заключалась в теоретическом обосновании принципов молекулярно-генетического марісирования генома сахарной свеклы, как научной основы при подборе родительских компонентов и проведе-
17 ний идентификации и регистрации линий, сортов и гибридов для повышения
эффективности селекции данной сельскохозяйственной культуры.
Для реализации данной проблемы было предусмотрено решение следующих задач:
L Изучить экспрессию, полиморфизм маркерных генов у сахарной свеклы и их сопряженность с хозяйственно-полезными признаками.
Оценить степень гомозиготносте инбредных линии и провести контроль гибридизации с использованием изоферментных спектров.
Разработать принцип подбора родительских компонентов для скрещивания на основе генетических расстояний.
Создать гибриды сахарной свеклы с использованием генетически маркированных линий, отвечающие требованиям современного сельскохозяйственного производства.
Разработать способ идентификации сортов сахарной свеклы по изо-ферментным маркерам.
6. Разработать научно-методологические основы информационных
технологий для идентификации и регистрации сортов и гибридов сахарной
свеклы.
Научная новизна исследований. Впервые установлены научно-методические приемы проведения амплификации последовательностей геномной ДНК сахарной свеклы с помощью ПНР с произвольно выбранными праимерами. Эти исследования имеют значение в практической селекции при отборе и идентификации ценных генотипов. Показано, что использование праймеров к последовательностям ДНК позволяет определять гомозигот-ность инбредных линий, идентифицировать родительские формы и их гибриды. Методом полимеразной цепной реакции с праимерами на 35 S промотор-доказана трансгенная природа четырех регенерантов сахарной свеклы, несущих ген rs дефензина редьки, определяющий устойчивость к фитопатогенам.
18 Разработан критерий оценки степени гомозиготносте инбредных линий
сахарной свеклы на основе индекса Iiz, что позволяет использовать его для
контроля процесса создания линий.
Впервые на сахарной свекле выявлена достоверная положительная связь изоферментных локусов, контролирующих НАД-зависимую малатде-гидрогеназу и малик-фермент, с массой корнеплода, что вносит определенный вклад в совершенствование методов отбора.
Оценка генетических взаимоотношений селекционных материалов сахарной свеклы по изоферментным и белковым маркерам позволила выявить степень их генетического родства. Это явилось основой для разработки метода подбора пар для гибридизации, использование которого позволяет создавать высокопродуктивные гибриды, обладающие гетерозисним эффектом.
Создан и включен в Государственный реестр селекционных достижений России и с 2001 года допущен к использованшо по Поволжскому и Центрально-Черноземному регионам гибрид РМС-90, (А.С. № 31185, 2001, в соавторстве) с использованием маркированной по изоферментному составу гамма-линии у -РФ-2113, превышающий стандарт по урожайности на 18,6% и сбору сахара на 17,3%.
Получены новые данные по полиморфизму сортов-популяций сахарной свеклы по семи изоферментным локусам. На основе полученных результатов разработан способ идентификации сортов по частотам встречаемости ал-лельных вариантов ферментов (А. С. №1672999, 1991, в соавторстве), позволяющий определять сортовую чистоту при семенном контроле и проводить идентификацию их в сортоиспытании.
Экспериментально установлены различия селекционного материала сахарной свеклы по запасному белку 1 IS глобулину при его идентификации по критерию идентичности, что углубляет теоретические представления о значении 11S глобулина запасного белка семян в оценке генофонда сахарной свеклы. Установлено, что низкий уровень полиморфизма глобулинов ин-
19 бредных линий (1-2 типа электрофоретического спектра) может быть критерием оценки их генетической чистоты.
Впервые создана информационная система с электронной базой данных, осуществляющая хранение результатов электрофоретического анализа и расчет критериев идентичности при сравнении генотипов сахарной свеклы по белковым маркерам, что имеет важное теоретическое и прикладное значение в селекционно-семеноводческой работе.
Практическая ценность и реализация результатов исследований.
Модифицированная методика выделения геномной ДНК сахарной свеклы и проведения ГТЦР анализа может найти широкое применение в селекции сахарной свеклы для проведения генотинирования селекционных материалов, сортов, гибридов и идентификации трансгенных форм.
Предложен критерий оценки селекционных материалов сахарной свеклы - индекс изоферментной гомозиготносте Iiz, который может быть использован в селекции для выделения и отбора линий с высокой степенью генетической выравненное, в пределах от 0,85 до 0,91.
На основе установленных генетических расстояний разработан метод подбора родительских компонентов, который может служить принципиальной основой создания новых высокопродуктивных сортов и гибридов.
Наиболее перспективные маркированные по изо ферментному составу линии зарегистрированы в селекцентре ВНИИСС в качестве нового исходного материала и использованы, как компоненты гибрида РМС-90.
Выявленные различия сортов и гибридов по типам электрофоретиче-ских спектров запасного белка и изоферментных локусов и частотам их встречаемости являются основой для проведения их надежной идентификации и паспортизации, и вносят существенный вклад в развитие методов селекционного отбора.
Разработанные методические рекомендации по проведению паспортизации на основе информационных технологий могут найти широкое приме-
20 некие для оперативного управления информацией в селекции, семеноводстве
и сортоиспытании.
Разработанные в процессе исследований методические подходы апробированы и могут использоваться в селекции, семеноводстве и сортоиспытании сельскохозяйственных культур, а также быть включены в программы по биологии, генетике, селекции в высших и средних учебных заведениях.
Положения, выносимые на защиту:
- экспериментальное обоснование использования изоферментов в каче
стве генетических маркеров при оценке селекционных материалов, позво
ляющее проводить отбор гомозиготных линий и контролировать процесс
гибридизации.
научное обоснование и реализация метода подбора родительских компонентов для гибридизации на основе генетических расстояний, способствующего получению гибридов, обладающих гетерозисным эффектом.
использование генетического маркирования в процессе создания новых гибридов, обеспечивающих высокую продуктивность.
информационная технология на основе генетического маркирования, позволяющая проводить идентификацию и паспортизацию линий, сортов и гибридов сахарной свеклы в селекции, семеноводстве и сортоиспытании, что будет способствовать повышению эффективности этих процессов.
Электрофоретическое фракционирование глобулинов
Полученные типы электрофоретических спектров различаются минимум по одному четко идентифицируемому компоненту яли по интенсивности окрашивания одного из них. Затем определяли частоту встречаемости каждого типа в установленной выборке семян. Каждый селекционный номер характеризовали по наличию основных типов спектра и частоте их встречаемости в установленной выборке (Конарев, 2001).
Количественное содержание общего белка в семенах сахарной свеклы определяли по Лоури (ЗемлянухинД975). Метод основан на образовании комплексного окрашенного соединения в результате взаимодействия белка со щелочным раствором сульфата меди (биуретовая реакция), вольфраматом и молибдатом натрия (реакция Фолина на тирозиновые и цистеиновые радикалы).
Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма по ДНК-маркерам использовали полимеразнута цепную реакцию с произвольными праймерами по общепринятой методике (Sagai-Maroof е.а., 1984; Дрейнер, Скотт, Армитидж, 1991), модифицированную нами для сахарной свеклы (подробное описание которой представлено в экспериментальной части).
Содержание сахара и массу корнеплода у свеклы определяли на автоматической линии «Венема» методом холодной дигестии.
Показатель сходства селекционных материалов сахарной свеклы по изоферментным локусам и запасному белку вычисляли по методике Л.А. Животовского (1982). Критерий идентичности соответствует распределению %2. В качестве морф использовали частоты генотипов маркерных ферментных локусов и типов электрофоретических спектров 11S глобулинов. Генетические расстояния между популяциями и инбредными линиями вычисляли по М. Нею QSTei, 1978) и на основании критерия сходства г, предложенного Л. А. Животовским (1982).
Для изучения родственных отношений между сортами, гибридами и линиями сахарной свеклы были построены дендрограммы методом кластерного анализа с помощью программы Statistica 6.0.
Создание электронной базы даннвтх осуществляли в объектно-ориентированном пакете средств визуальной разработки программного обеспечения C++ Builder 6.0.
Результаты экспериментальных данных по продуктивности линий и гибридов обрабатывали методом дисперсионного анализа.
Достоверность полученных данных оценивали с использованием критерия Фишера (Доспехов, 1973). Коэффициенты регрессии между различными признаками определяли по методикам Г. Ф. Лакина (1980).
В тексте диссертационной работы используются следующие условные обозначения:
IN - потомство от самоопыления в п поколении; GN - потомство от сибсового скрещивания в п поколении; Fi - гибрид первого поколения; Р - поликросс.
Изоферменты и контролирующие их гены обозначали согласно принятой Международной комиссией номенклатуре (IUPAC-IUB..., 1971). Для обозначения аллельных генов и соответствующих им изоферментов применяли буквенную символику. Например, Adli 1-F и Adh 1-S обозначали аллельные гены, контролирующие соответственно быстрый (fast F) и медленный (slow S) варианты фермента алкогольдегидрогеназы (Schwartz, 1966; Левитес, 1985).
Органная специфика экспрессии белков и изоферментов в онтогенезе сахарной свеклы
Перспективными маркерами для сахарной свеклы оказались функциональные белки или изоферменты (Левитес, 1986; Федулова, 1995), по которым можно характеризовать активность контролирующих их структурных генов.
Изофермеитами называются генетически детерминированные множественные молекулярные формы ферментов, присутствующие в однм и том же организме, обладающие одинаковой субстратной специфичностью,но разли 62 чающиеся по своим физико-химическим свойствам: подвижности в электрическом поле, удельной активности, локализации в клетке, реакции на активаторы и ингибиторы. Наибольшее практическое значение имеют различия в подвижности изоферментов в электрическом поле.
Изоферменты были открыты при использовании двух методов элек-тр офоретического разделения белков и гистохимического окрашивания элек-трофореграмм (Hunter, Markert, 1957; Markert, MoUer, 1959).Изучение генетики ферментов у растений было начато в 1960 г. работой Д. Шварца, установившего генетический контроль эстеразы у кукурузы (Swartz, 1960). Анализ изоферментов стал важным экспериментальным методом современной генетики.
По определению каждый тип субъединиц изоферментов продуцируется особым геном независимо от того, кодируется ли фермент множественными локусами. Следовательно, если: обнаружены субъединицы какого-то определенного типа, то это не просто означает, что есть ген, кодирующий их, но, что этот ген активно экснрессируется. Таким образом, субъединица изофер-мента служит маркером своего гена. С теоретической точки зрения это не есть свойство именно изоферментов, так как любой полипептид - это маркер кодирующего его гена. Однако на практике генетические варианты фермента со специфической каталитической активностью обнаружить гораздо легче, чем генетические варианты неферментных белков. Использование изоферментов в качестве маркеров настолько широко распространено в современной биохимической генетике, что гипотезу «один ген-один фермент», выдвинутую лауреатами Нобелевской премии Бидлом и Татумом, можно перефразировать как «один ген-одна субъединица фермента».
Использование изоферментов в качестве генетических маркеров удобно в силе следующих обстоятельств: 1. Изоферменты можно определять в малом объеме и при этом анализировать много проб одновременно. 2. Аллельные изоферменты проявляются кодоминантио; это означает, что один аллель не маскирует другой. Следовательно, у гетерозигот присутствуют оба типа субъединиц изофермента, а у гомозигот - только один. Таким образом, о генотипе особи можно судить по фенотипическому признаку - спектру изоферментов. В этом смысле изоферменты имеют преимущества перед классическими генетическими маркерами (вариации окраски или морфологических свойств), так как в случае классических маркеров один аллель может доминировать над другими, потому у гетерозигот предпочтительно проявится именно он. Стало быть, особь с доминантным фенотипом может быть гомозиготной по доминантному аллелго, а может быть гетерозиготной с одним рецессивным, то есть замаскированным аллелем. Для того, чтобы определить какая из этих двух возможностей соответствует действительности, требуются обширные исследования на нескольких поколениях потомков, что крайне неудобно, особенно если речь идет об организмах с большой продолжительностью жизни.
3. С помощью из о ферментного анализа удается выявить небольшие мутации, незаметные при визуальном наблюдении. Варианты окраски и аномальные морфологические признаки нередко связаны с полным: исчезновением кодируемого данным геном фермента или неферментного белка. Полное отсутствие какого-то белка должно существенно нарушать обмен веществ, так что особь будет отклоняться от нормы не только внешне, но скорее всего и биохимически. Что касается используемых в настоящее время в качестве генетических маркеров изоферментов, то они отличаются друг от друга физико-химическими свойствами, в частности зарядом и электрофоре-тической подвижностью, но все они в той или иной мере ферментативно активны, иначе их нельзя было бы выявить как изоферменты.
4. В силу сложности обмена веществ морфологические свойства - это обычный результат взаимодействия многих генных локусов. Определяя же активность гена по содержанию кодируемого им полипептида можно более точно анализировать отдельные гевные локусы и при этом избежать проблем, связанных с влиянием других локусов.
Сведения, касающиеся изучения ферментов у сахарной свеклы, можно разделить на три группы:
- данные о генетическом контроле ферментов.
- данные о генетическом полиморфизме;
- сведения по изучению свойств ферментов в связи с различными физиологическими состояниями растения.
У сахарной свеклы выявлены локусы Ме-1 и Ме-2, контролирующие малек-фермент (Левитес, 1976а; б), Mdlil и Mdh2 НАД-зависимую малатде-гидрогеназу (Левитес, Юдина, Малещсий, 1980); acph-І - кислую фосфтазу (Монастырева, Левитес, Реимерс, 1984), Adh-1-алькогольдегидрогеназу (Малещсий, Коновалов, 1985), Асо-1, 6Pgd-2, контролирующие аконитазу и 6 фосфоглюкомутазу (Филатов, 1993); Ніс 1, Ndh 3, Idh 3, контролирующие гексокиназу, HADH-дегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу (Денисова, 199); Gdh 1, контролирующий глутамадегидрогеназу (Коновалов, 1987); Gpi 2 , котролирующий глюкозофосфатизомеразу (Geyt, Smed, 1984; Smed е.а., 1989).
К настоящему моменту у сахарной свеклы в пяти из девяти известных групп сцепления имеется по 2-3 маркерных гена, причем в двух из них вообще нет ферментных генов (Коновалов, 1994; Денисова, 1999).
Известно, что некоторые гены, детерминирующие изоферменты, могут экспрессироваться только в определенных тканях или на определенных стадиях онтогенеза. Кроме того, для многих систем возможна посттрансляционная модификация. Критериями такой специфичности является отсутствие или присутствие полос, изменение электрофоретической подвижности и изменение активности зон фермента.
Использование генетического маркирования в процессе создания гомозиготных линий сахарной свеклы
Генетическое маркирование гаплоидов. За последние годы убедительно показано, что ферменты могут служить прекрасными маркерами в исследованиях широкого круга генетических и селекционных программ (Newton, 1983; Scandalios, 1983). Они используются с большим успехом в качестве маркеров в культуре тканей и генетике соматических клеток, в выяснении проблем, связанных с укоренением и витрификацией микроклонов (Berthon е.а., 1987; Gas-par, Couman, 1987); для выяснения гибридной природы новых форм после использования эмбриокультуры и соматической гибридизации (Де Расе, 1988; Srned, Van Geyt, Oleo, 1989; Told, Kameya, Abe, 1990; Wijbrandi, 1990), сома-клонального варьирования и клеточного мутагенеза (Bretted е.а., 1986; Davies е.а., 1986; Scliutze, 1988), а также причин, обуславливающих эмбриогенное и неэмбриогенное развитие гаметофита или соматических тканей (Cliawla, 1988; Chen, Lutlie, 1987; Coppens e.a., 1983; Everet, 1985; Francz, 1989; Kay, Basile, 1987; Lutz, Wong, 1985; Stirn, Jacobson, 1987; Warm, 1988), в исследованиях мо-носомных линий, полученных в результате отдаленной гибридизации (Topfer, GronenboiT, Schell, 1989; Van Geyt, 1988).
Известно, что запасные белки (зеины, гордеины, глобулины и др.) в последние годы являются биохимическими маркерами в изучении ряда процессов при культивировании in vitro и генетической инженерии в целом (Атанасов, 1988).
Экспрессия 7S и 11S запасных белков глобулинов в соматических зародышах люцерны исследована с учетом влияния различных углеродных источников и ауксина 2,4-Д. Сделан вывод, что существует положительная корреляция между стадиями развития зародышей и накоплением запасных белков, что позволяет маркировать некоторые фазы развития, связанные с созреванием соматических зародышей. Использование запасных белков может быть критерием начала прорастания. Количество накопленных запасных белков могло бы быть показателем нормального развития соматических зародышей, так как из исследований видно, что количество 11S запасных белков в соматических зародышах по сравнению с зиготическими уменьшается (Stuart, Henke, 1985; 1988).
В исследованиях белков семян ели (Picea glauca) установлена тесная зависимость между эмбриогеиной способностью каллусных тканей и содержанием запасных белков (Roberts, 1981). Работы по изучению накопления запасных белков в соматических зародышах, полученных культивированием in vitro микроспор Brassica napus, показали увеличение накопленных белков и их транс-криптов в период фазы «торпеда». Сходство белкового состава соматических и зиготических зародышей позволяет использовать зародыши из микроспор в исследованиях по биохимии и генетической регуляции в семенах рапса (Taylor, 1990).
В литературе имеются также сообщения об изменении состава глиадинов, связанном с сомаклональной изменчивостью (Cooper, 1986; Maddock, 1985).
Все вышеизложенное послужило основой для изучения возможности использования изоферментов в качестве молекулярно-генетических маркеров при создании гомозиготных линий методом гиногенеза.
Генетическое маркирование по изоферментным спектрам было использовано нами при создании исходного материала сахарной свеклы путем индуцирования гаштоидии in vitro. Данный метод основан на культивировании неошто-дотворенньгх семяпочек на питательной среде, формировании гаплоидных линяй и переводе их на диплоидный уровень путем колхицинирования (Знаменская, Жужжалова, Подвигина, 1993; Знаменская, 1999; Подвигина, 2003). Это один из перспективных на сегодняшний день способов, дающий возможность в течение короткого срока, с точки зрения селекционного процесса, получить гомозиготный материал практически по всем генам (Знаменская, 1999).
Для индукции гаплоидии донорские растения сахарной свеклы были промаркированы нами по составу изоферментиых локусов: Ме-1, Idh-1, Gdh-1. Изоферментныи анализ исходных растений показал, что три растения из восьми были гомозиготны по трем изученным изоферментным локусам, а остальные имели гетерозиготные генотипы, хотя бы по одному маркерному гену.
В процессе индуцирования неоплодотворенных семяпочек в культуре in vitro получено 17 реституционных линий (Подвигина, 2003). В результате проведенных исследований выявлено, что донорские генотипы, гетерозиготные по изоферментным локусам, сформировали наибольшее количество гаплоидных регенерантов - 64,7% от общего количества полученных микроклонов (табл. 37). Таблица 37 - Характеристика донорских растений и гаплоидных регенерантов по изоферментному составу (1993-1994 гг.) Flanra данные находят подтверждения в экспериментах других исследователей (Zagorska е.а., 1998; Chekurov, 1999; Подвигина, 2003), отмечавших повышение выхода гаплоидных регенерантов у гетерозиготного материала в сравнении с линейным. Подтверждение гаплоидного происхождения регенерантов явились результаты маркирования их по конкретным структурным генам. Исследуемые нами регенеранты показали стопроцентную гемизиготность по составу изофер-ментных локусов: Ме-1, Idh-1, Gdli-1 (Федулова, Подвигииа, 1994). Полученные данные согласуются с результатами исследований, проведенными Е.В. Левитесом и Т.И. Новожиловой (Levites, Novojilova, 1977) на кукурузе, отмечавших, что истинные гаплоиды на электрофореграмме имели один изофермент алкогольдегидрогеназы, характерный для материнской линии. Как известно, гаплоидные растения не способны давать потомство, так как при отсутствии гомологичных хромосом нарушено прохождение мейоза, что в результате приводит к формированию нежизнеспособных гамет (Бурма-кита, 1994; Батыгина, 1987). Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения переводят на более высокий уровень плоидности.
Метод кластерного анализа в изучении происхождения сортов и гибридов сахарной свеклы
Уже давно существует проблема освоения и расширения генетических ресурсов селекции. Актуальность ее неуклонно растет в связи с интенсификацией селекции и постоянной необходимостью оздоровления и обогащения сортового генофонда. Это предвидел еще Н.И. Вавилов (1966): он был одним из первых, кто принял меры к мобилизации, сохранению и всестороннему изучению существующего сортового и видового разнообразия сельскохозяйственных растений. Основанная им мировая коллекция культурных растении и их диких сородичей в ВИРе содержит сейчас более 350 тысяч образцов и включает в себя богатейший фонд для селекции. В ней наряду с районированными сортами и сортами-шедеврами имеются стародавние сорта, староместные, сортовые популяции (сорта народной селекции), многочисленные сородичи и, прежде всего, виды, принимавшие непосредственное участие в формировании культурных растений (Жуковский, 1971; Брежнев, Коровина, 1981).
Основной генофонд в селекции любого сельскохозяйственного растения заключен в пределах вида, которому оно принадлежит и представители которого генетически полностью совместимы. Генофонд вида слагается из генных пулов сортов, сортовых (культивируемых) и естественных (дикорастущих) популяций. Объем генофонда и ограждающие его продуктивные границы у каждого сорта или сортовой популяции определяют селекционеры и поддерживают и охраняют семеноводы. Сортовой, популяционный, или первичный генофонд включает генетическую изменчивость в пределах сорта или популяции и выражается в наличии свойственных ему генотипов. Раскрытие и эффективное использование его в селекции может быть возможным с привлечением к генетическому анализу метода белковых маркеров (Конарев, 1998).
Коренное селекционное улучшение количественных признаков должно базироваться на всем генофонде вида или даже рода и трибы.
К настоящему времени выведено и культивируется большое количество сортов и гибридов сахарной свеклы. Для интенсификации селекционного процесса и решения некоторых проблем семеноводства возникла необходимость в разработке методов, позволяющих точно и за сравнительно короткое время идентифицировать отдельные сорта и составляющие их генотипы.
Для дифференциации сортов сахарной свеклы, выяснения их происхождения применяются различные сочетания агрономических и ботанических характеристик, основными из которых являются морфологические особенности вегетативных и генеративных органов растений. Однако степень выражения тех или иных морфологических признаков сильно зависит от условий окружающей среды. Поэтому в последнее время для решения названных проблем все шире проводятся исследования различных белков как ферментативной, так и нефер-мативной природы (Fedak, 1974; Bassiri, 1976). Дифференциация различных сортов и гибридов сахарной свеклы на генетико-биохимической основе может оказать существенную помощь при решении практических проблем селекции этой культуры.
Как известно, большинство сортов сахарной свеклы представляют собой сложные популяции, слагающиеся из огромного числа биотипов, различающихся между собой по биологическим, физиологическим, химическим, морфологическим и другим признакам (Мазлумов, 1970; 1996). При этом случайно сложившиеся соотношения аллелей будут сохраняться в последующих поколениях при отсутствии отбора, или изменяться при наличии отбора по данному локусу.
Большой интерес в связи с этим представляет количественная оценка степени различия между сортами по комплексу важнейших биологических и хозяйственных признаков (Перфильев, Лебедев, Тихонов, 1979).
Уникальным генофондом в селекции сахарной свеклы являются много-семянные сорта-популяции, которых за период с 1923 по 1973 год было создано и районировано более 200. Высокая продуктивность и сахаристость многоростковых сортов, хорошие технологические качества, устойчивость к болезням и другие ценные признаки позволяют использовать их при создании новых форм свеклы - одноростковой, полиплоидной, гибридов на стерильной основе и др. Они необходимы для поддержания и улучшения районированных сортов и гибридов (Мазлумов, 1970; Якименко, Сушков, Юсубов, 1992).
В связи с этим представляют определенный интерес исследования по выявлению генетических взаимоотношений в генофонде сахарной свеклы для использования этих данных в селекционном процессе при создании новых селекционных материалов.
В результате проведенных нами экспериментов (Федулова, Жужжалова, Корниенко, 1994) были обнаружены наибольшие генетические различия у сортов Уладовская 752 улучшенная, Межотненская 070 и Межотненская 104 почти со всеми изученными сростноплодными популяциями. Среднее значение DN составило у них 0,225; 0,163; 0,333 соответственно (табл.54).
Анализируя данные таблицы, следует отметить, что наибольшая генетическая дивергенция выявлена у сортов: Льговская 078 и Межотненская 104 (DN=0,444); Межотненская 104 и Рамонская 036 (DN=0,419); Уладовская 752 улучшенная и Межотненская 070 (DN=0,389); Межотненская 104 и Рамонская 931 (DN=0,330). Подобные генетические взаимоотношения связаны вероятно, с происхождением данных материалов. Так, при выведении сортов Ме-жотненской опытно-селекционной станции Латвийского НИИ земледелия в гибридизации были использованы нецветушные немецкие и польские сорта, что существенным образом повлияло на изменение генетической структуры. Таблица 54 - Генетические различия между сростноплодными сортами сахар ной свеклы (1993-1994 гг.)
