Введение к работе
Актуальность темы. Для условий Беларуси л'лпии представляют несомненный интерес как важная декоративная культура. Почвенногклиматические условия республики в целом благоприятны для возделывания многих форм лилий, в особенности сортов раздела Азиатские Гибриды. Главным фактором, сдерживающим распространение лилий в Беларуси, является отсутствие посадочного материала современных сортов. Традиционные методы размножения не позволяют получить достаточное количество качественного посадочного материала. Кроме того, в этом случае существует опасность распространения с посадочным материалом бактериальных, грибных и вирусных заболеваний, представляющих большую опасность для культуры. Поэтому как дополнение к традиционным методам размножения во многих странах рассматривают метод in vitro. Этот метод позволяет более эффективно и быстро размножать растения вне зависимости от погодных условий и сезона, обходиться без маточных насаждений, а также препятствовать распространению заболеваний с посадочным материалом.
В научной литературе, как правило, обсуждаются отдельные вопросы микроклонального размножения лилий, касающиеся только первого этапа - введения в культуру in vitro (Иванова, 1989; Leshem et al., 1982; Niimi, 1984 и др.). Исследования различных авторов по ряду вопросов микроклонального размножения лилий носят довольно противоречивый характер. Большинство работ посвящено изучению размножения ценных в декоративном и коммерческом отношениях сортов из разделов Длинноцветковые и Восточные, которые в условиях Беларуси являются недостаточно зимостойкими. Основные элементы технологии микроклонального размножения Азиатских Гибридов, представляющих наибольший интерес для республики, изучены недостаточно.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Белорусской сельскохозяйственной академии.
Дель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка основных элементов технологии производства посадочного материала Азиатских Гибридов лилий методом культуры тканей.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Отработать эффективную методику получения стерильной культуры лилий.
-
Оптимизировать условия культивирования зксплантов лилий на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения (подбор экзогенных гормонов, состава питательной среды, условий культиви-
рования маточных растений, изучение происхождения и оптимальных сроков изолирования эксплантов, условий освещенности, способов расположения экспланта на питательной среде и др.).
3. Исследовать процесс адаптации и доращивания пробирочных растений в условиях in vivo.
Научная новизна. Проведено систематическое изучение процесса микроклонального размножения Азиатских Гибридов лилий и впервые в республике разработаны основные элементы технологии производства посадочного материала лилий методом in vitro. Ряд вопросов, связанных с условиями культивирования маточных растений, происхождением и сроками изолирования эксплантов, подбором вида и концентрации фитогормонов, состава питательной среды, условиями адаптации и доращивания регенерантов in vivo изучены впервые. В работе впервые исследовано влияние эпибрассинолида на процесс пролиферации лилий в культуре in vitro. Изучены различные субстраты для адаптации растений после культуры in vitro и доращивания микрорастений. Установлена неравнозначность аммонийного и нитратного азота для доращиваемых растений.
Показано, что при размножении различных форм лилий in vitrc предпочтительной является питательная среда Мурасиге - Скуга-с повышенны}.! содержанием сахарозы (60 г/л). Выявлен наиболее эффективный регулятор роста - сс-нафтилуксусная кислота (НУК) в концентрации 0,1 - 1.0 мг/л. Оптимальная концентрация фитогормона зависич прежде всего от сортовых особенностей, а также происхождения і срока изолирования эксплантов. 6 - бензиламинопурин не оказываем положительного действия на экспланты лилий. Эпибрассинолид ускоряет регенерацию и повышает коэффициент размножения, хотя и в меньшей степени, чем НУК, однако стимулирует интенсивный каллусогенез что при размножении лилий по предлагаемой схеме является нежелательным. Экспланты внутренних чешуи луковицы по способности регенерировать луковички не уступают, а в ряде случаев и превосходя1 экспланты внешних чешуи. Доказана необходимость создавать услови для регенерации крупных луковичек при микроразмножении лилий. Ус тановлено, что оптимальный уровень освещенности для культивирова ния эксплантов лилий составляет 1000 люкс. Отработана методик адаптации микрорастений лилий в условиях in vivo и доращивания и в различных субстратах в пленочных теплицах. Обращается внимали на необходимость использования для подкормок микрорастений лили
іммонииного азота. Ионы хлора не оказывают заметного ингибирующего іействия на доращиваемые после культуры in vitro растения лилий.
Практическая значимость полученных результатов. Разработаны >сновные элементы технологии массового размножения лилий методом in vitro от получения стерильной культуры до доращивания растений і условиях in vivo. Предлагаемая методика позволяет размножать лиши с высоким коэффициентом - до миллиона штук в год и более от эдной маточной луковицы при последующем двухлетнем доращивании до товарной луковицы. Технология отличается относительной простотой и «дат быть использована в биотехяологических лабораториях для массового производства оздоровленного посадочного материала хозяйственно ценных сортов, а также в селекции лилий для сохранения и размножения особо ценных генотипов.
Экономическая значимость полученных результатов; Эффективность предлагаемой методики микроразмножения лилий заключается в следующем: 1) высокий коэффициент размножения; 2) сокращение сроков поступления товарных луковиц новых сортов в производство; 3) отсутствие потребности в дорогостоящих маточных насаждениях;- 4) высокое качество посадочного материала, свободного от инфекции. Анализ экономической эффективности микроразмножения лилий показал, что предлагаемая технология является высокорентабельной (на один рубль затрат приходится 5.52 рубля чистого дохода при объеме производства один миллион луковиц).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения: основные элементы технологии производства посадочного материала лилий на основе метода in vitro.
-
Оптимизация этапа введения в стерильную культуру эксплантов лилий (использование гипохлорита кальция как наиболее эффективного антисептика; перспективность применения провокационных питательных сред Зао и Мурасиге - Скуга с молочным альбумином для быстрого и полного выявления инфекции на начальных этапах культивирования; возможность и целесообразность использования в качестве источника эксплантов как внешних, так и внутренних чешуи луковицы).
-
Совершенствование этапа размножения лилий in vitro ( преимущества использования для размножения крупных луковичек; необходимость увеличения концентрации сахарозы как на первом, так и на втором этапах до 60 г/л; приемлемость различных вариантов ориентации эксплантов на поверхности питательной среды; использование НУК
б концентрации 0.1-1 мг/л как наиболее эффективного фитогормона для регенерации луковичек на первом и втором этапач культивирования; оптимизация условий освещенности на первом и втором этапах на уровне 1000 люкс).
3. Разработка методики переноса и доращивания микрорастений в условиях in vivo (пригодность верхового торфа или его смесей с песком и перлитом в качестве субстрата для адаптации лилий ; успешное культивирование доращиваемых микрорастений лилий в различных субстратах на основе верхового торфа либо почвы; предпочтительное использование аммонийного азота для подкормки доращиваемых регенерантов лилий).
Личный вклад соискателя. Соискатель участвовал в разработке программы и методики исследований, подготовке к публикации статей и тезисов докладов, самостоятельно выполнил все экспериментальные исследования, провел статистическую обработку данных и анализ полученных результатов.
Апробация результатов диссертации. Материалы исследований были представлены и доложены : на научной конференции к 155 - летию Белорусской сельхозакадемии (Горки, 1995), республиканской конференции "Современные проблемы генетики и селекциии" (Минск, 1995), IV конференции "Брассиностероиды - биорациональные экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений" (Минск, 1995), международной конференции, посвященной 150 - летию со дня рождения М.В. Рытова "М.В. Рытов - выдающийся агробиолог, философ и педагог" (Горки, 1996), Second International Symposium "Breeding, propagation in vitro and disease resistance of horticultural plants" (Salaspils, Latvia, 1996).
Опубликованность результатов. Основные положения диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 2 - в сборниках научных статей, 2 - в материалах конференций,3 - в тезисах докладов.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, шести глав, выводов, приложения и списка использованных источников. Общий объем диссертации составляет 133 страницы, включает 27 таблиц и 9 рисунков. Перечень использованных литературных источников включает в себя 234 источника, в том числе 131 на иностранных языках.
МАТЕРИАЛ И ШВДЙКА ИССЛЕДОВАНИЙ В диссертационной работе рассматриваются результаты экспери-
ментов по размножению in vitro Азиатских Гибрвдов лилий, которые представляют наибольший практический интерес для условий Беларуси. Основные эксперименты" по разработке технологии микроклонального размножения выполнены на сортах Медуница и Эстафета, луковицы которых получены во ВНИИС им. И.В. Мичурина. В отдельных экспериментах использовались сорта Болгария, Виринея, Волхова, Мичуринская Ода, Пелеринка и Эмилия (луковицы приобретены там же), а также Арктика, Sun Ray и Trojan (луковицы получены в ЦБС АН Беларуси).
В качестве эксплантов на первом этапе микроразмножения использовались луковичные чешуи, подготовленные по следующей методике. Здоровые, без явных механических повреждений чешуи отделялись от. донца луковицы, тщательно промывались водой и не менее 0,5 часа обрабатывались в 0,01 % растворе детергента Tween-20. После этого чешуи погружались на несколько секунд в 70 % этиловый спирт, а затем стерилизовались в 3-5 %-ном растворе гипохлорита кальция в течение 20 минут. После стерилизации они в условиях ламинара ополаскивались 4 раза автоклавированной дистиллированной водой. Апикальная часть чешуи в связи с низкой способностью к регенерации луковичек для размножения не использовалась. Остальная часть чешуи делилась на экспланты размером около 1,5 см2 и высаживалась в пробирки на стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) или её модификацию, дополненные сахарозой и фитогормонами в зависимости от эксперимента,рН 5,7-5,8, концентрация агара 5,5-6,0 г/л. Для быстрого выявления инфекции экспланты высаживались на питательную среду Зао и среду МС, дополненную молочным альбумином. Экспланты культивировались по одному в пробирках при температуре 22-24С, длине дня 16 часов и освещенности 1000 люкс. Через 3 недели после начала культивирования инфицированные экспланты выбраковывались. Через 8 недель от момента посадки проводился учет следующих параметров: процент регенерировавших эксплантов, количество регенерировавших луковичек на каждом экспланте, их масса, количество и длина корней, количество и длина листьев. Все эксперименты в культуре in vitro проводились в трехкратней повторности по 10 эксплантов на повторность, а в опытах по подбору антисептиков и провокационных питательных сред - по 100 эксплантов на повторность.
Культивирование на втором этапе микроразмножения осуществлялось в банках объемом 250 мл с винтовыми крышками по 10 эксплантов в каждой. В качестве питательной среды использовалась МС, допол-
ненная сахарозой и гормонами в зависимости от эксперимента. Условия культивирования аналогичны первому этапу. Пассаж длился восемь недель. Учитывались те же показатели, что и на первом этапе.
Для прохождения этапа адаптации и доращивания в нестерильных
условиях регенеранты высаживались в различные субстраты на основе
торфа "Двина" (торф, торф + песок 1:1, торф + перлит 1:1). Опыт
проводился с сортами Медуница и Эстафета в трехкратной повторности
по 50 растений на одну повторность . Использовались деревянные
ящики, которые на 2/3 заполнялись субстратом. После высадки реге-
нерантов ящики накрывались полиэтиленовой пленкой и устанавлива
лись в культуральной комнате. В течение 40 дней проводился посто
янный уход, состоящий из регулярного увлажнения опрыскивателем,
полива и проветривания во избежание развития инфекции. Температура
составляла 22-24С, освещенность 2000-3000 люкс. Последние 10 дней
растения постепенно адаптировались к естественной влажности возду
ха и более высокой освещенности. По истечении 40 дней учитывался
процент сохранившихся растений и общий прирост сырой массы в про
центах. '
После адаптации in vivo растения высаживались для доращивания на гряды длиной 70 и шириной 60 см по схеме 5 х 10 см. Опыт проводился в трехкратной повторности, на одну повторность бралось 10 растений.' Культивирование осуществлялось в пленочной теплице с 20.06 по 1.10.1995 года. Изучены различные субстраты на основе верхового торфа и почвы (торф, торф + почва 1:1, торф + песок 1:1, почва, почва + песок 1:1) на пригодность использования их для доращивания .микрорастений лилий. Использовались торф "Двина" и легкосуглинистая дерново - карбонатная почва, содержащая 3.15 Z гумуса, 12.3 мг азота, 14.7 мг калия и 43.6 мг фосфора в расчете на 100 г почвы, рН 6.6. Эксперимент проводился с сортами Медуница и Эстафета. Также изучено влияние различных форм минеральных удобрений на рост и развитие доращиваемых микрорастений лилий. Опыт проводился с сортами Пелеринка и Эмилия. Схема посадки, число повтор-ностей и растений на делянке аналогичны первому эксперименту. Субстрат - смесь почвы с песком (1:1). Проведено четыре подкормки с интервалом 15 дней раствором минеральных удобрений, исходя из гектарной дозы N120P140K150 (Ботяновский и др., 1984). В проведенном нами эксперименте варианты опыта не отличались по суммарной дозе NPK, но вносимые удобрения имели разные формы катионов и ани-
онов (вариант 1 - азот в аммонийной форме, вариант 2 - азот в нитратной ферме, вариант 3 - удобрения содержащие хлор , вариант 4 .-удобрения не содержащие хлора). В период культивирования проводился постоянный уход: прополки, рыхление, полив водой по мере необходимости. По окончании указанного периода учитывалась средняя масса луковиц.
Результаты экспериментов обрабатывались методом дисперсионного анализа.
