Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Белки-маркеры генетических систем 9
1.2. Генетический контроль биосинтеза белков клейковины 16
1.3. Полиморфизм глиадина мягких пшениц, выявленный по электрофоре-тическим спектрам белков в крахмальном и в полиакриламидном гелях 20
1.4. Генетическая сопряжённость показателей качества муки мягкой пшеницы с определёнными блоками глиадина 24
1.5. Влияние ржаной транслокации на хлебопекарные показатели качества зерна 29
1.6. Компонентный состав глютенинов. Значение глютенинов в формировании качества зерна 34
1.7. Использование белковых маркеров в селекции твёрдых пшениц 39
Глава 2. Условия, материалы и методы исследований 44
2.1. Почвенно-климатические условия 44,
2.2. Материалы и методы исследований 48
Глава 3. Аллельное разнообразие глиадинкодирующих локусов, выявленное в сортах озимой мягкой пшеницы с использованием двух методик электрофореза 52
Глава 4. Сопряжённость аллелей глиадинкодирующих локусов и их сочетаний с качеством зерна озимой мягкой пшеницы 72
4.1. Связь глиадиновых аллелей с показателями качества зерна озимой мягкой пшеницы 72
4.2. Изучение связи сочетаний аллелей глиадинкодирующих локусов и качества зерна озимой мягкой пшеницы за годы исследований 90
4.3. Влияние транслокации 1BL/1RS на качество зерна озимой мягкой пшеницы 103
4.4. Биохимические и технологические особенности зерна озимой мягкой пшеницы, повреждённого клопом-черепашкой 114
Глава 5. Полиморфизм высокомолекулярных глютенинов, выявленный в сортах озимой мягкой пшеницы краснодарской селекции 120
Глава 6. Исследование полиморфизма глиадинов озимой твёрдой пшеницы 126
Выводы 136
Предложения для селекционной практики 138
Список использованной литературы 139
- Белки-маркеры генетических систем
- Аллельное разнообразие глиадинкодирующих локусов, выявленное в сортах озимой мягкой пшеницы с использованием двух методик электрофореза
- Изучение связи сочетаний аллелей глиадинкодирующих локусов и качества зерна озимой мягкой пшеницы за годы исследований
- Исследование полиморфизма глиадинов озимой твёрдой пшеницы
Введение к работе
Актуальность темы. За период почти в сто лет урожайность озимой пшеницы увеличилась более чем в два раза. Однако за счёт снижения интенсификации технологий возделывания зерновых отмечается ухудшение качества зерна. В этой связи, важное значение для сельскохозяйственного производства имеет его селекционное улучшение.
Успех селекции на качество и её результативность может быть повышена за счёт внедрения метода электрофореза в селекционные программы уже на ранних её этапах, что позволит отбирать генотипы с определёнными аллелями глиадинкодирующих локусов, сопряжёнными с хозяйственно-ценными признаками.
Глиадины и глютенины, образуя клейковинный комплекс, непосредственно связаны со многими показателями качества зерна, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров по этому признаку [Созинов и др., 1975; Попереля, 1980; Конарев, 1983; Копусь, 1998; Неудачин и др., 2001 и др.]. Множественный аллелизм, кодоминантность наследования, независимость от условий выращивания делают эти маркеры эффективными.
В основном связь компонентного состава глиадинов с качеством муки выявлена для аллелей глиадинкодирующих локусов мягкой пшеницы, идентифицированных при электрофорезе в крахмальном геле (КГ), в то время как для аллелей, выявленных в полиакриламидном геле (ПААГ) она изучена меньше. Сопряжённость особенностей компонентного состава клейковинных белков твёрдой пшеницы с основными показателями качества зерна также недостаточно отражена в литературе. Актуальными остаются вопросы по оценке связи отдельных аллелей глиадинкодирующих локусов и их сочетаний и аллелей глютенинкодирующих локусов с качеством зерна озимой мягкой и озимой твёрдой пшеницы в меняющихся условиях среды.
Цель и задачи исследований Цель исследований заключается в изучении полиморфизма озимой мягкой и твёрдой пшеницы по аллелям глиадинкодирующих и глютенинкодирующих локусов для выявления аллелей, имеющих ценность при селекции на качество зерна.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- Изучить полиморфизм сортов и линий озимой мягкой пшеницы селек
ции КНИИСХ, а также коллекционных образцов по аллелям глиадинко
дирующих и глютенинкодирующих локусов.
Оценить связь отдельных аллелей глиадинкодирующих локусов и их сочетаний, а также глютенинкодирующих локусов с качеством зерна озимой мягкой пшеницы, в меняющихся условиях среды.
Исследовать полиморфизм сортов и линий озимой твёрдой пшеницы селекции КНИИСХ, а также коллекционных образцов по аллелям глиадинкодирующих локусов.
- Выявить аллели глиадинкодирующих локусов, связанные с высоким ка
чеством зерна озимой твёрдой пшеницы.
Научная новизна.
Изучено разнообразие по аллелям глиадинкодирующих локусов у 94 сортов озимой мягкой пшеницы селекции КНИИСХ с помощью двух методик электрофореза в крахмальном (КГ) и полиакриламидном гелях (ПААГ) и проведено сопоставление аллелей, выявленных при электрофорезе на различных гелевых носителях.
Впервые изучена сопряжённость отдельных аллелей глиадинкодирующих локусов хромосом, а также их сочетаний с качеством зерна озимой мягкой пшеницы в условиях Западного Предкавказья. При электрофорезе в полиакриламидном геле впервые идентифицирован не описанный ранее в каталоге для ПААГ аллель по глиадинкодирующему локусу Gli-Al, связанный с высоким качеством.
Впервые выявлены сочетания аллелей, присутствие которых в генотипе, нивелирует отрицательное влияние ржаной транслокации 1BL/1RS на качество зерна.
Глубоко изучен полиморфизм сортов озимой мягкой пшеницы селекции КНИИСХ по аллелям глютенинкодирующих локусов, а также оценена связь этих аллелей с качеством зерна в условиях Западного Предкавказья.
Впервые идентифицированы аллели глиадинкодирующих локусов у 84 сортов озимой твёрдой пшеницы с использованием электрофореза в крахмальном (КГ) и полиакриламидном геле (ПААГ). Практическая значимость работы.
Установлена относительная ценность аллелей в определении качества у озимых мягких и твёрдых пшениц. Даны рекомендации практической селекции по использованию отдельных аллелей глиадинкодирующих локусов при подборе пар для гибридизации и оценке селекционного материала.
Для всех сортов озимой мягкой и озимой твёрдой пшеницы краснодарской селекции определены формулы глиадина, которые используются для сортовой идентификации и определения сортовой чистоты семян. Основные положения, выносимые на защиту:
Использование двух методик электрофореза в КГ и в ПААГ позволило выявить высокий полиморфизм сортов и линий озимой мягкой пшеницы селекции КНИИСХ по аллелям глиадинкодирующих локусов.
Аллели глиадинкодирующих локусов GM-1A14 (Gli-AlI), GM-1A12 (Gli-Al b*), Gld-1A10 (Gli-Alg), GM-1D4 (Gli-Dlj) сопряжены с высоким качеством зерна озимой мягкой пшеницы.
Присутствие в генотипах с ржаной транслокацией 1BL/1RS, аллеля Gld-1D4(GU-Dlj) снижает её отрицательное влияние на качество зерна.
В сортах селекции КНИИСХ выявлен низкий полиморфизм по аллелям глютенинкодирующих локусов. В изучаемых сортах доминируют аллели глютенинкодирующих локусов, связанные с высокими показателями качества зерна (Glu Ala (1), Glu Alb (2*), Glu Bib (7+8), Glu Blc (7+9), Glu Did (5+10)).
5. Исследование полиморфизма сортов и линий озимой твёрдой пшеницы по аллелям глиадинкодирующих локусов с помощью электрофореза в КГ и ПААГ позволило сопоставить некоторые аллели, выявленные с помощью двух методик.
Апробация работы и публикация результатов исследований.
Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на научно-методических советах Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко в 2004-2010 гг.; на пятой и шестой региональных конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», 2003 -2004гг и на первой всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», 2007г в Кубанском государственном аграрном университете, г. Краснодар.
По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе три работы в научных изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации. На один сорт мягкой пшеницы и один сорт твёрдой пшеницы получены авторские свидетельства и патенты.
Объём и структура диссертации.
Диссертация изложена на 167 страницах печатного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций для селекционной практики, списка литературы из 228 источников, в том числе 75 на иностранном языке. Работа содержит 42 таблицы и 20 рисунков.
Белки-маркеры генетических систем
Все жизненно важные свойства и функции организма связаны с двумя классами полимеров: белками и нуклеиновыми кислотами. Соответственно, в различных молекулярно-биологических и генетических исследованиях наиболее широко используют: белковые маркеры и ДНК-маркеры [Хавкин, 1997; Календарь, Глазко, 2002; Хлёсткина, Салина, 2006].
Важнейшими областями применения указанных маркеров в прикладной генетике, селекции и семеноводстве являются: оценка генетического разнообразия культурных растений и их дикорастущих сородичей, идентификация генотипов, реконструкция родословных, подбор родительских пар и оценка потомства, изучение природы и картирования качественных и количественных локусов продуктивности и устойчивости растений [Хавкин, 1997; Календарь, Глазко, 2002; Драгович, 2008].
Для успешного применения в перечисленных областях, маркеры должны обладать определёнными свойствами и отвечать ряду требований [Календарь, Глазко, 2002]:
1) доступность фенотипических проявлений аллельных вариантов для идентификации у разных особей;
2) отличимость аллельных замещений в одном локусе от таковых в других локусах;
3) доступность существенной части аллельных замещений в каждом изучаемом локусе для идентификации:
4) изучаемые локусы должны представлять случайную выборку генов в отношении их физиологических эффектов и степени изменчивости;
5) равномерность распределения по локализации в геноме;
6) лёгкая выявляемость, воспроизводимость и дешевизна;
7) возможность автоматизации выявления генетических маркеров; 8) относительная нейтральность.
Маркеров, отвечающих всем этим требованиям - не существует. Поэтому, необходимо проанализировать ДНК-маркеры и биохимические маркеры (в частности электрофоретические варианты запасных белков пшеницы) с целью выявления их достоинств и недостатков применительно к научной селекции.
МАРКЕРЫ ДНК
P.K.Gupta с соавторами предложил следующую классификацию ДНК-маркеров:
1. ДНК - маркеры, основанные на Саузернблот - гибридизации (RFLP);
2. ДНК - маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции -ПЦР (RAPD, ISSR, AFIP и SSR);
3. ДНК - маркеры, основанные на секвенировании и использовании ДНК-чипов (SNP) [Gupta et. al., 1999].
Преимуществами RFLP-маркеров является то, что они подобно белковым маркерам кодоминантны, что позволяет различать гомо - и гетерозигота, универсальны и высоко воспроизводимы. При использовании в селекционном процессе главное достоинство RFLP-маркеров - это возможность определить положение маркируемых агрономически важных генов или признаков на молекулярных картах. К недостаткам этих маркеров можно отнести: большие затраты труда и ресурсов на составление молекулярных карт; для анализа необходимы значительные количества ДНК; метод требует тщательной очистки ДНК от белка, РНК и других веществ; значительных расходов требует приобретение реактивов и материалов, обеспечение мер безопасности при работе с радиоактивными материалами. Из-за этих причин RFLP-анализ проводят в немногих крупных лабораториях [Хавкин, 1997].
Вторая группа ДНК — маркеров, выявляемых с помощью полимеразной цепной реакции - ПЦР (PCR-polymerase chain reaction) позволяет амплифи-цировать участки генома, которые соответствуют случайно или предварительно выбранным праймерам - затравочным последовательностям ДНК. В сравнении с RFLP-анализом ПЦР - анализ требует выделения значительно меньшего количества ДНК из растительных тканей, однако последняя должна быть свободна от загрязнения ДНК грибов и бактерий. Отпадает нужда в работе с радиактивными изотопами. Недостатками RAPD- метода, входящего в эту группу можно считать «анонимность» амплифицированных фрагментов, которые трудно связать с конкретными локусами генома, фрагменты различной природы могут совпадать по подвижности и сливаться при электрофорезе, а доминантная природа RAPD-зондов не позволяет выявлять гетерогенность. Выявляемый полиморфизм с помощью ISSR-анализа, как правило, выше и более чётко воспроизводим, по сравнению с RAPD-анализом, так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго. В отличие от RAPD- маркеров SSRs-маркёры - наследуются кодоминантно и, соответственно, удобны для выявления гетерозигот по данному локусу [Календарь, Глазко, 2002]. AFLP -маркеры технически сложны и требуют большего количества ДНК, но тем не менее получили в настоящее время широкое распространение, так как определение последовательности выделенных таким образом фрагментов, даёт много новой информации о природе генов и организации их непосредственного окружения [Хавкин, 1997].
На основе методов RAPD, ISSR, AFLP, SSR созданы новые типы молекулярных маркеров, использующих последовательности ретротранспозонов для анализа геномов. К методам, основанным на использовании ретротранспозонов, относятся IRAP, REMAP, SSAP, RBIP. RBIP - метод, в отличие от трёх остальных методов, имеет кодоминантный тип наследования, что позволяет использовать его для анализа гетерозиготных популяций, так как будут амплифицироваться оба аллеля данного локуса, но этот метод дорог и трудоёмок.
В третью группу по классификации ДНК-маркеров входят SNP — маркеры. Их достоинством является возможность автоматизировать и в десятки раз повысить производительность анализа генотипов. Кроме того на основе этих маркеров можно создать молекулярно - генетические карты очень высокой плотности, которые необходимы для выделения и изучения генов, ответственных за устойчивость к различным заболеваниям, а также других агрономически важных генов растений. Также SNP - маркеры благодаря своим преимуществам могут найти широкое применение для паспортизации сортов [Хлёсткина, Салина, 2006].
Практическое применение молекулярных маркеров (ДНК-маркеров) для создания новых высокопродуктивных и пластичных сортов сельскохозяйственных культур пока ещё сильно отстаёт от потенциальных возможностей. Это связано с относительно высокими первоначальными затратами на оборудование молекулярно-генетических лабораторий и недостаточной тех-нологизацией методов, многие из которых надёжны только в руках высококвалифицированных работников. Использование молекулярных маркеров в настоящее время, может быть рекомендован в случаях, когда невозможно использовать метод электрофореза запасных белков, который менее трудоёмок, дешевле и более стабилен [Хавкин,1997; Кудрявцев, 2007].
Аллельное разнообразие глиадинкодирующих локусов, выявленное в сортах озимой мягкой пшеницы с использованием двух методик электрофореза
Глиадины пшеницы эффективно используются в качестве генетических маркеров в Краснодарском НИИСХ им. П.П.Лукьяненко.
В КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко существует возможность проводить электрофоретический анализ сортов и линий мягкой и твёрдой пшеницы с помощью двух методик:
1. Электрофорезом глиадинов в крахмальном геле (КГ). Методика разработана в Селекционно-генетическом институте (СГИ, Одесса);
2. Электрофорезом глиадинов в полиакриламидном геле (ПААГ). Методика разработана Институтом общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (ИОГен, Москва).
А.А. Поморцев считает, что при выборе методики анализа запасных белков пшеницы надо учитывать:
- высокую воспроизводимость результатов;
- максимальное выявление различий между сортами;
- методика должна быть быстрой, дешёвой, удобной (использовать мало манипуляций, оборудования и ядовитых реактивов);
-регистрация результатов должна быть простой, надёжной и объективной [Поморцев, Лялина, 2003].
В КНИИСХ, селекционерами наиболее широко используются данные, полученные с помощью электрофореза в КГ, так как эта методика соответствует всем требованиям, указанным выше. Кроме того, как отмечают Мета-ковский и Копусь именно для аллелей, выявляемых в КГ, исследована связь с проявлением хозяйственно значимых признаков пшеницы [Метаковкий, Копусь, 1991]. Использование в КНИИСХ методики электрофореза глиадинов в ПААГ, обусловлено стремлением получить дополнительную электрофорети ческую характеристику перспективных линий на более ранних этапах селекции и районированных сортов, тем более, что для определения сортовой чистоты семян стандартизирована именно эта методика. Также нами изучена связь между некоторыми аллелями, выявленными в ПААГ и показателями качества зерна.
В табл. 3.1 представлены сравнения некоторых условий электрофореза по двум методикам.
Обе методики имеют ряд сходств и различий в подготовке материала и проведении электрофореза. К сходствам относятся:
-выделение белков 70% спиртом
- использование алюминий-лактатного буфера с рН 3,1
-электрофорез длится 3-3,5 часа
Предпочтение использования в КНИИСХ методики электрофореза запасных белков в КГ объясняют следующие её достоинства:
- дешевизна;
-крахмал в отличие от акриламида не ядовит;
-аллельные варианты блоков глиадина записываются в виде цифр, которые легче воспринимаются и запоминаются, чем буквы (форма записи аллелей, выявленных в ПААГ).
Необходимо отметить, что каталоги аллельных вариантов глиадинко-дирующих локусов, составленные с использованием результатов полученных с помощью различных гелевых носителей (КГ и ПААГ) различаются между собой.
Обозначение локусов и аллелей, включённых в каталог, созданный на основе ПААГ, соответствует международным требованиям. Согласно международным стандартам локус обозначается тремя латинскими буквами (GH), затем идут прописная буква, обозначающая геном (А, В или D), порядковый номер локуса (1-если локусы расположены на хромосомах первой гомеоло-гической группы, и 2-если на хромосомах шестой гомеологической группы) и строчная буква, обозначающая аллель.
Обозначение локусов и аллелей, контролирующих состав электрофоре-тических компонентов, получаемых в КГ, другое: локус обозначается как Gld, затем указывается номер хромосомы (1 или 6), буква, обозначающая геном (А, В и D) и номер аллеля.
При сопоставлении аллелей глиадинкодирующих локусов, выявленных разными методиками надо отметить, что номера аллелей по первым трём ло-кусам у одних и тех же сортов иногда совпадают, однако наблюдаются и различия в обозначениях.
Достаточно часто одному аллелю в одном каталоге соответствуют несколько аллелей в другом каталоге. Это связано с тем, что тяжёлые фракции глиадина лучше разделяются в крахмальном геле, поэтому в ю-зоне электро-форетического спектра в крахмале наблюдается больше, чем в ПААГ, минорных компонентов, различающих аллели локусов первой гомеологическои группы хромосом (табл. 3.2, табл. 3.3,табл. 3.4) .
И наоборот, средние и лёгкие фракции лучше разрешаются в ПААГ, что позволяет вычленить большее по сравнению с крахмальным гелем количество аллелей по локусам, расположенным на шестых хромосомах (табл. 3.5, табл. 3.6, табл. 3.7).
Аллелю Gli-Alb по ПААГ-каталогу соответствует три аллеля по КГ-каталогу - Gld -1А4, Gld -1А7, Gld -1А12. При изучении электрофореграмм, полученных на полиакриламидном геле, действительно, сорта Кума и Безостая 1 имеют одинаковый набор компонентов, контролируемых хромосомой 1А(рис. 3.1)
Аллель Gld -1А12 по КГ-каталогу, соответствует аллелю Gli-Alb по ПААГ-каталогу. Однако необходимо отметить, что все сорта, имеющие при электрофорезе в крахмальном геле аллель Gld -1А12, в полиакриламидном геле имеют не только компоненты аллеля Gli-Alb, но и дополнительный компонент, не обозначенный в имеющемся каталоге (рис. 3.2).
Таким образом, при электрофорезе в полиакриламидном геле можно различить аллели, соответствующие аллелям Gld -1А4 и Gld -1А12 по КГ-каталогу. Аллель, соответствующий аллелю Gld -1А12 по КГ-каталогу, мы отмечаем как Gli-Alb .
Изучение связи сочетаний аллелей глиадинкодирующих локусов и качества зерна озимой мягкой пшеницы за годы исследований
В период 2003-2009 гг. нами были проанализированы 3691 образец (в том числе 2863 образца по предшественнику пар) озимой мягкой пшеницы по показателям качества и компонентному составу глиадина. Условия выращивания, в частности погодные условия, а также повреждение зерна клопом-черепашкой повлияли на качество зерна пшеницы. Результаты наших исследований по варьированию технологических показателей по годам отражены в таблице (табл. 4.2.1).
Показатель натуры зерна изменялся от 772 г/л (2007г) до 827г/л (2005г). Пониженное количество белка и клейковины зерна в 2005 ив 2008 годах вероятно и объясняет уменьшение объёмного выхода хлеба (588 и 585 см3 соответственно). Наименьший показатель объёмного выхода хлеба наблюдался в 2006 г (583см3), это связано с высоким поражением зерна клопом черепашкой, которое привело к высокому разжижению теста - 94 е.ф.. В 2009 году также повреждение зерна клопом черепашкой было значительным, что ухудшило показатель ИДК — 81 е.п., и разжижения теста- 139 е.ф.. Однако высокие показатели количества белка и клейковины обеспечили высокий объёмный выход хлеба 640 см . Наивысшим показатель ИДК был в 2008 году (83 е.п.), Снижение качества клейковины зерна, выращенного в этом году, является следствием сильных дождей, которые пришлись на уборку.
Другие показатели также ухудшились (сила муки и объёмный выход хлеба), несмотря на то, что весенне-летние погодные условия 2008 года способствовали формированию хорошего качества зерна. Сила муки за последние 4 года значительно снизилась, наивысшим этот показатель был в 2004 году, а самым низким в 2009. В 2003 и 2004 годах все показатели достаточно высокие, что сказалось на хорошей общей хлебопекарной оценке (4,3 и 4,2 соответственно). Самым низким этот показатель был в 2006 году - 3,7 , как следствие поражения зерна клопом черепашкой. Также показатели эластич ности (3,1) и пористости (2,8) оказались самыми низкими в 2006 году по сравнению с другими годами.
Нами выявлено, что в наибольшей степени с параметрами качества связаны аллели глиадинкодирующих локусов хромосом первой гомеологиче-ской группы. Интересно проследить стабильность этой связи по годам.
Так анализ коллекционного и селекционного материала за период 2003-2009 годы показал неоднозначную связь сочетаний аллелей глиадинкодирующих локусов с содержанием белка в зерне (табл. 4.2.1).Нами были проанализированы только те сочетания аллелей глиадинкодирующих локусов, которые имели не менее 16 образцов в выборке. Показатель содержания белка в зерне в среднем за 7 лет обладал низкой изменчивостью (V=3,l - 9,5 %) (табл. 4.2.4). Образцы с сочетанием 2.4.1. - в КГ (o.g.b. - в ПААГ), 10.1.1.(g.b.b.) и 10.3.1.(g.l.b.) имели самое низкое среди изученных образцов среднее за 7 лет значение содержания белка 12,6 %, 12,7 % и 12,5% соответственно.
Необходимо отметить, что коэффициенты вариации у таких сочетаний самые высокие. У сочетания 2.4.1.(o.g.b.) он был 9,5%, у сочетания 10.1.1.(g.b.b.) - 9,4% и у сочетания 10.3.1.(g.l.b.)- 8,2%. Действительно среднее значение этого показателя у сочетания 2.4.1.(o.g.b.) варьировало от 10,7% в 2006 году до 14,0% в 2007 году. У образцов с сочетанием 10.1.1. (g.b.b.) среднее содержание белка в зерне в 2003 году составило всего 10,4%). Наивысшим этот показатель также оказался в 2007 году - 13,9%. Таким образом, при оптимальных условиях выращивания генотипы с такими сочетаниями могут формировать зерно с содержанием белка 14,0%, но при ухудшении этих условий этот показатель резко снизится.
Генотипы с сочетаниями 3.1.7. (f.b.g.), 4.1.4.(b.b.j.) и 4.3.2. (b.l.f.) имели самые низкие коэффициенты вариации (3,2%), 3,2% и 3,1 % соответственно), при высоком содержании белка в зерне (14,0% ,13,4%) и 13,7%) соответственно). Следовательно, эти генотипы могут стабильно формировать зерно с содержанием белка на уровне ценных и сильных пшениц в различные годы.
Так, средний показатель содержания белка в зерне у образцов с сочетанием 3.1.7. (f.b.g.) изменялся от 13,2% в 2003 году до 14,8% в 2007 году, а с сочетанием 4.3.2. (b.l.f.) от 13,0% в 2005 году до 14,3 % в 2007 году.
Достаточно высокие коэффициенты вариации наблюдались у генотипов с сочетаниями аллелей 4.3.4. (b.l.j.) - 6,2%, 5.1.7. (a.b.g.) — 6,3% 10.3.5. (g.l.g.) — 6,2%, при высоком показателе содержания белка. Генотипы с такими сочетаниями нестабильно формируют зерно с высоким содержанием белка. Действительно средний показатель содержания зерна в разные годы варьировал у образцов с сочетанием 4.3.4. (b.l.j.) от 12,6% в 2008 году до 15,2% в 2004 году. Наивысшим средний показатель содержания белка за 7 лет был у образцов с сочетанием 14.3.4. (l.l.j.) - 14,6% (по годам он варьировал от 13,3% в 2008 году до 15,9 в 2004 году). Коэффициент вариации при этом составил 5,7%.
Показатель содержания клейковины также изменялся по годам у образцов с различными сочетаниями аллелей по - разному (табл. 4.2.2.).
Самым низким средний показатель содержания клейковины был у генотипов с сочетанием 10.3.1. (g.l.b.) - 23,5%. При этом коэффициент вариации у генотипов с этим сочетанием достаточно высокий (10,0%) по сравнению с другими.
У генотипов с сочетанием 2.4.1. (o.g.b.) средний показатель содержания клейковины составил 24,4%, однако в 2007 году этот показатель достиг 28,2%. Коэффициент вариации у данного сочетания самый высокий по сравнению с другими и составляет 11,9%. Это свидетельствует о нестабильности этого признака у генотипов с данным сочетанием по годам. Однако, при оптимальных условиях выращивания генотипы с такими сочетаниями могут формировать зерно на уровне сильных пшениц. Также высокий коэффициент вариации определён у генотипов с сочетанием 10.1.1. (g.b.b.) - 11,8%. Размах варьирования среднего показателя содержания клейковины по годам у гено-, типов с данным сочетанием самый высокий. Так в 2003 году среднее значение этого признака составило 19,5%, а в 2007 году достигло 28,0%.
Исследование полиморфизма глиадинов озимой твёрдой пшеницы
Синтез запасного белка зерна твёрдой пшеницы — глиадина, также как и мягкой, контролируется локусами тесно сцепленных генов, расположенными на коротких плечах хромосом первой и шестой гомеологических групп [Payne et al., 1984]. Глиадинкодирующие локусы твёрдых пшениц характеризуются множественным аллелизмом. Электрофоретические компоненты, контролируемые одним аллелем, наследуются единым блоком как менделев-ский признак. Аллели глиадинкодирующих локусов могут эффективно использоваться в качестве генетических маркеров, т.к. они наследуются кодо-минантно и независимы от условий выращивания [Созинов и др., 1987; Кудрявцев и др., 1993]. Существует несколько каталогов блоков компонентов глиадина, в которых каждый аллель глиадинкодирующего локуса обозначен буквой [Кудрявцев, 2007; Мельникова, 2010] или цифрой [Копусь, 1998]. Такое различие в обозначении аллелей, а соответственно и каталогов, вызвано тем, что электрофоретический анализ проводится в одних учреждениях на крахмальном геле (КГ), а в других на полиакриламидном (ПААГ).
Все районированные сорта твёрдой пшеницы селекции КНИИСХ были проанализированы методом электрофореза глиадина в крахмальном и полиакриламидном гелях (табл. 6.1). Обозначение аллельных вариантов блоков компонентов глиадина в каталоге, составленном на основе данных полученных при электрофорезе в ПААГ, соответствует международным правилам. Тремя латинскими буквами (GH) обозначается локус, прописная буква обозначает геном (А, В и D), далее указывается порядковый номер локуса (локусы на хромосомах первой гомеологической группы обозначаются цифрой 1, а на хромосомах шестой гомеологической группы 2), латинская буква d обозначает, что данный блок обнаружен у твёрдой пшеницы (durum), строчная латинская буква обозначает конкретный аллель [Кудрявцев, 2007]. Запись локусов и аллелей при использовании каталога, составленного на основе данных полученных при электрофорезе в КГ, отличается. Локус обозначается - Gld , затем следует номер хромосомы, на которой находится локус (1 или 6), буква, обозначающая геном (А, В или D) и номер аллеля [Копусь, 1998].
Количество идентифицированных аллелей глиадинкодирующих локусов зафиксированных в ПААГ- каталоге значительно выше, чем в КГ-каталоге.
Необходимо отметить, что районированные сорта озимой твёрдой пшеницы селекции КНИИСХ различаются по формулам глиадина, исключениями являются сорта Алёна и Золотко, которые имеют одинаковую формулу как в КГ, так и в ПААГ-е. Сорт Уния имеет два биотипа, а остальные сорта селекции КНИИСХ гомогенные.
Сопоставление аллелей глиадинкодирующих локусов, идентифицированных с помощью двух методик (табл. 6.2) показало, что также как и у мягких пшениц, одному аллелю в одном каталоге могут соответствовать несколько аллелей другого каталога. Так аллелю Gli Alde по ПААГ — каталогу соответствовали аллели Gld 1А8 и Gld 1А13 по КГ-каталогу, также аллелю Gli Blde по ПААГ - каталогу соответствовали два аллеля по КГ-каталогу Gld lBlnGldlBlT.
Что касается аллелей глиадинкодирующих локусов хромосом шестой гомеологической группы, то здесь наблюдается обратная картина. Так аллелю Gld 6АЗт по КГ-каталогу соответствует два аллеля по ПААГ- каталогу (Gli A2dg, Gli A2dgb), а аллелю Gld 6В2т по КГ-каталогу соответствует три аллеля по ПААГ каталогу (Gli B2dh, Gli B2dhe, Gli B2dl). Следовательно также как и у мягких пшениц тяжёлые фракции глиадина лучше разделяются в крахмальном геле, поэтому в со-зоне электрофоретического спектра в крахмале наблюдается больше, чем в ПААГ, минорных компонентов, контролируемых локусами генов хромосом первой гомеологической группы. И наоборот, средние и лёгкие фракции глиадина лучше разделяются в ПААГ, что позволяет идентифицировать большее, чем в крахмальном геле, количество аллелей глиадинкодирующих локусов хромосом шестой гомеологическои группы.
Из многочисленных литературных источников известна сопряжённость компонентного состава глиадинов твёрдой пшеницы с качеством зерна [Kos-molak et al., 1980; Aurtran, 1989; Голик, 1996; Копусь, 1998; Васильчук, 2001; Кудрявцев, 2007 и др.).
За рубежом в качестве маркеров макаронных свойств используются электрофоретические компоненты 45 и 42, принадлежащие к группе у — глиадинов, контролируемые генами, локализованными в хромосоме 1В [Demidaux et al., 1978, Du Cros et al., 1983]. Считается, что генотипы с компонентом у42 имеют низкое качество клейковины и слабые макаронные свойства, а генотипы с компонентом у45 - высокие макаронные свойства зерна и сильную клейковину [Kosmolak et al., 1980; Du Cros et al., 1982; A.M. Кудрявцев и др., 1993; Bushuk, 1998; Голик 2008 и др.].
Мы проанализировали все районированные сорта озимой твёрдой пшеницы, а также коллекционные образцы и идентифицировали различные у- компоненты в их электрофоретических спектрах (рис. 6.1).
Всего было проанализировано 84 образца. Оказалось, что вместо компонентов у42 и у45 в электрофоретических спектрах твёрдых пшениц встречаются и другие у- компоненты. У двенадцати генотипов у- компоненты имеют более высокую электрофоретическую подвижность, чем у45 и определяется нами как у47. Такой у- компонент присутствует в электрофоретиче-ском спектре сорта Крупинка селекции КНИИСХ. У девятнадцати генотипов выявлен у- компонент, одинаковый по подвижности с соответствующим компонентом сорта озимой мягкой пшеницы Безостая 1, поэтому мы этот у-компонент обозначили как у Б-1. Таким образом, компоненты у42 и у45 не являются обязательными компонентами в электрофоретическом спектре сортов твёрдой пшеницы, а, следовательно, они не могут давать полную информацию о качестве зерна.
В электрофоретических спектрах сортов КНИИСХ в основном преобладает у- компонент Б-1, который является одним из компонентов блока Gli Blde, по ПААГ - каталогу. Этот блок, наряду с блоком Gli Bldd, включающем в себя компонент у47, вероятно унаследован от мягких пшениц. Компо-нентный состав блока Gli Bl е аналогичен компонентному составу блока Gli-Blb, идентифицированному в каталоге для мягких пшениц, а блок Gli Bl d соответствует блоку Gli-Bld по ПААГ-каталогу для мягких пшениц. Компонент у42, связанный с низкими макаронными свойствами, присутствует только в одном сорте краснодарской селекции Уния, причём в одном из биотипов. Компонент у45, связанный с высокими макаронными свойствами, обнаружен в электрофоретических спектрах трёх сортов селекции КНИИСХ, это Кермен, Ласка и Соло. Интересно, что компонент у45 может входить в разные блоки (табл. 6.4) как по ПААГ - каталогу (Gli Bld b, Gli Bld с и др.), так и по КГ-каталогу (Gld 1В4т и Gld ІВнов.1).
