Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Территориальная, зоологическая и производственная классификация овец 9
1.2. История и современное состояние изученности генетических маркеров в мире, СНГ и Российской Федерации 13
1.3. Группы крови овец: история их изучения и номенклатура 16
1.4. Системы групп крови у овец 24
1.5. Полиморфизм белков и ферментов крови у овец 33
1.6. Общность различных биологических структур овец иродственных групп 37
1.7. Микросателлиты и их использование для оценки биоразнообразия животных 43
1.7.1. Краткая история по терминологии и номенклатуре микросателлитов 43
1.7.2. Распределение микросателлитов по геному 44
1.7.3. Функциональная роль микросателлитов 46
1.7.4. Мутационные механизмы изменений в микросателлитах 48
1.7.5. Применение микросателлитов для исследования сельскохозяйственных животных 50
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 58
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 67
3.1. Характеристика моноспецифических сывороток у овец, использованных в процессе проведения исследований 67
3.2. Получение моноспецифических сывороток для идентификации антигенов систем групп крови у овец 70
3.3. Общность эритроцитарных антигенов, аллелей и генотипов у различных видов жвачных животных 75
3.4. Аллелофонд и генетическая структура различных пород овец 86
3.4.1. Характеристика современного состояния изученности аллелофонда у овец 86
3.4.2. История исследования аллелофонда пород овец на территории бывшего СССР 89
3.4.3. Аллелофонд у тонкорунных пород овец 92
3.4.4. Аллелофонд у полутонкорунных пород овец 100
3.4.5. Генетические особенности у овец различных типов цигайской породы 101
3.5. Аллелофонд у овец исчезнувшей опаринской породы по различным генетическим маркерам 111
3.6. Эволюционно-генетический анализ становления некоторых полутонкорунных пород овец 116
3.7. Использование генетических маркеров в овцеводстве 125
3.7.1. Генетический контроль достоверности происхождения ягнят 125
3.7.2. Определение фенотипов и генотипов овец по группам крови 127
3.7.3. Проверка баранов-производителей по качеству потомства 129
3.8. Определение зиготности у различных видов жвачных животных 132
3.9. Микросателлитный анализ эволюционно-генетических связей у различных пород овец 141
3.10. Эффективность использования генетических маркеров у овец 148
Обсуждение 155
Выводы 165
Практические предложения 169
Список использованной литературы
- Территориальная, зоологическая и производственная классификация овец
- Группы крови овец: история их изучения и номенклатура
- Характеристика моноспецифических сывороток у овец, использованных в процессе проведения исследований
- Эволюционно-генетический анализ становления некоторых полутонкорунных пород овец
Введение к работе
Актуальность темы. Открытие большого класса генетических маркеров коренным образом изменило общую ситуацию в исследовании генома животных. В процессе создания маркирующих тест-систем использовались различные методические подходы: иммунологические, химические, биохимические и молекулярные. Благодаря им появился инструмент для описания наследственной изменчивости, определения достоверности происхождения потомства и генетических расстояний между различными популяциями, оценки аллелофонда у различных видов и пород, установления связи с рядом физиологических и биохимических процессов в организме у сельскохозяйственных животных.
Классификация современного набора генетических маркеров у овец включает 11 различных типов полиморфных систем крови и молока (COGNOSAG Workshop Report, 1992; Марзанов Н.С., 1994; Lauvergne J.J. et al., 1996; Cockett N.E. et al., 2001; Марзанов H.C. и др., 2002; 2004; 2006). Множественность аллелей, высокая гетерозиготность, кодоминантное выражение и менделирующий характер наследования, привели к широкому их использованию в качестве генетических маркеров у крупного рогатого скота, лошадей, свиней. Вместе с тем, с помощью генетических маркеров, до сих пор не проведена оценка аллелофонда у различных пород овец Российской Федерации и сопредельных стран, для решения различных задач в области генетики и селекции овец (Nguyen Т.С., Bunch T.D., 1990; Ansari Н.А. et al., 1996; Broad Т.Е. et al., 1997; Gortari M.J. de et al., 1998; Marzanov N.S., 2002; Marzanov N.S. et al, 2005).
Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке технологии генетического маркирования для повышения эффективности селекционной работы в овцеводстве. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Разработать технологию использования маркирующих систем в
разведении овец.
Дать характеристику тонкорунным, полутонкорунным и грубошерстным породам овец по встречаемости антигенов, аллелей и генотипам групп крови, полиморфных белков и микросателлитам.
Определить общность антигенов групп крови у жвачных животных: овец, коз, крупного рогатого скота, яков, овцебыков, сайгаков и верблюдов.
4. Провести кластерный анализ с целью определения генетических
дистанций у различных пород овец по группам крови.
Провести анализ происхождения и исторических связей пород овец на территории России и сопредельных стран на основе микросателлитного анализа.
Провести оценку встречаемости моно- и дизиготности у жвачных животных.
7. Усовершенствовать методику получения реагентов групп крови у овец.
Научная новизна работы. Впервые выполнены исследования аллелофонда у тонкорунных, полутонкорунных и грубошерстных овец по полиморфным локусам белков, группам крови и микросателлитам. В процессе популяционно-генетического анализа установлен различный уровень полиморфности, гомо - и гетерозиготности пород. Показано, что генетическая вариабельность в стадах, широко разводимых и локальных пород, может быть разной по одним системам (полиморфные белки и группы крови), сходной по другим локусам (микросателлиты).
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные позволили выдвинуть предположения о путях создания и эволюции пород овец. Разработана методология получения объективных данных по дивергенции пород. Определена общность антигенов, аллелей и генотипов у различных видов жвачных животных, что позволило показать наибольшую
7 близость между парами овца-коза и крупный рогатый скот-як, получить и использовать реагенты для аттестации овец по группам крови.
Специалисты получили новый инструмент для повышения качества и эффективности селекции животных, проверки баранов-производителей по качеству потомства. Предложена технология использования маркирующих систем при оценке аллелофонда, определении достоверности происхождения ягнят, выявлении моно- и дизиготности у потомков 4-х видов жвачных животных, характеристике эволюционно-генетических связей между породами.
Основные положения, выносимые на защиту;
- Методология аттестации пород овец с использованием групп крови,
полиморфных белков и микросателлитов.
Выявление генетических маркеров для характеристики аллелофонда овец различной продуктивной направленности.
Оценка генетического разнообразия у пород овец Российской Федерации и сопредельных стран. Установление происхождения и историко-генетических связей между ними.
- Диагностика общности эритроцитарных антигенов для установления
эволюционных связей у жвачных животных.
- Методы повышения эффективности использования генетических маркеров
в селекции овец.
Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на ученых советах и совещаниях во ВНИИплем (2001-2006); Материалы диссертации были представлены: на международной научно-практической конференции по проблемам «Повышения конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения (Быково, 2003); II международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологические производства экологически
8 безопасных продуктов животноводства (Дубровицы, 2003); на 6-й международной конференции по мериносовому овцеводству (Будапешт, Венгрия, 2002); 28-й международной конференции по генетике животных (Геттинген, Германия, 2002); III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2004), а также на международном научно-практическом семинаре по темам: 1.«Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». 2.«Генетические маркеры в селекции животных» (Быково, 2005); в трудах конференции "Сохранение генетических ресурсов" (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 научных работ. Из них 12 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации, в 2-х монографиях и методической рекомендации. Остальные 11 работ были изданы в трудах всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Материал изложен на 192 страницах компьютерного текста, содержит 36 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает 244 источника, в т.ч. 116 - на иностранных языках.
Территориальная, зоологическая и производственная классификация овец
Овцы разводятся в 169 странах мира, т.е. во всех конти / нентах или как еще принято говорить - пяти зоогеографических областях (голарктическая, неотропическая, афро-мадагаскарская, ориентальная, антарктико - австралийская), на которые поделен земной шар (Оливан М.П., 1999).
По зоологической классификации овцы относятся к классу млекопитающих (Mammalia), отряду парнокопытных (Artiodactyla), подотряду жвачных (Ruminantia), семейству полорогих (Bovidae), подсемейству козоовец (Caprini), роду овец (Ovis). Трудности в систематике рода Ovis возникают из-за большой фенотипической вариабельности и широкого ареала распространения его представителей. Ситуация прояснилась при анализе кариотипа видов овец (Марзанов Н.С., 1991).
Домашние овцы относятся к виду Ovis aries L. Считается, их предком является дикий горный баран - муфлон, распространенный от гор Кавказа, островов Средиземного моря до Центральной Азии. Наиболее крупные его формы встречаются на востоке и носят название архаров и аргали (Ovis аттоп L.), далее на запад в Средней и Передней Азии можно встретить уриалов (Ovis vignei L.), в Малой Азии обитают азиатские муфлоны (Ovis orientalis L.\ а в Европе - муфлоны европейские (Ovis musimon L.), отличающиеся наименьшими размерами. Однако, несмотря на то, что между этими формами имеются не только внешние, но и кариотипические отличия, у архаров диплоидный набор представлен 56, у уриалов - 58, у муфлонов -54 хромосомами, все они способны скрещиваться между собой и давать плодовитое потомство. Поэтому статус разных горных баранов этой группы окончательно не определен. Иногда их всех, включая и Ovis aries L., относят к одному виду с несколькими хромосомными расами (Wilson D.E., Reeder D.M., 1993). Поскольку у домашних овец диплоидный набор представлен 54 хромосомами, естественно предположить, что их родоначальниками были муфлоны - формы, распространенные как раз в очагах древних цивилизаций, Средиземноморье и Малой Азии, а уриалы, архары и аргали должны быть исключены из числа прямых предков домашних овец (Воронцов Н.Н., 1975; Воронцов Н.Н., Гаспарян К.М., 1988; Кленовицкий П.М. и др., 1999; Кленовицкий П.М. и др., 2004).
Наиболее близкий к овцам род животных - козы (Сарга). Среди сельскохозяйственных животных, овцы и козы выделяются в группу мелкого рогатого скота.
Овцы разводятся практически во всех странах мира. По данным ФАО общая численность овец в мире составила 1060,2 млн. голов, jar всех пяти зоогеографических областях насчитывается 1484 породы овец (World Watch List for domestic animal diversity, 2000). По континентам поголовье овец распределяется следующим образом:
Африка - 127,440 млн. голов, 147 пород, что составляет 12% от всей разводимой в мире популяции овец и 11% от всех разводимых пород овец. Овцеводством занимаются в 51 странах и регионах Африки;
Азия и Тихоокеанские острова - 408,098 млн. голов, 233 породы, что составляет 39% от мировой популяции овец и 18% от всех разводимых пород овец. Овцеводство распространено в 53 странах и регионах Азии;
Европа - 185,035 млн. голов, 629 пород, что составляет 18% от всех разводимых овец и 48% от всех разводимых пород овец. Овцеводством занимаются в 52 странах и регионах Европы;
Латинская Америка и Карибские острова - 89,372 млн. голов, 42 породы, что составляет 8% от всей мировой популяции овец и 3% от разводимых пород. Овцеводством занимаются в 47 странах и регионах Латинской Америки;
Ближний Восток - 242,770 млн. голов, разводится 201 порода, что составляет 23% от всей мировой популяции овец и 15% от всех разводимых в мире пород овец. Овцеводство распространено в 25 странах и регионах Ближнего Востока;
Северная Америка и Канада - 7,891 млн. голов, разводится 61 порода, что составляет 1% от всей мировой популяции овец и 5% от всех разводимых пород.
Австралия - 126,500 млн. голов, разводится 23 породы, что составляет 12% от мировой популяции овец и 2% от разводимых пород.
На территории Российской Федерации разводятся 40 пород овец: 15 тонкорунных, из них 4 шерстного направления (грозненская, сальская, ставропольская, манычский меринос); 7 шерстно-мясного направления (алтайская; асканийская; кавказская; забайкальская; красноярская; советский меринос; южно-уральская) и 4 мясошерстного направления (дагестанская горная; волгоградская; вятская; прекос) (Marzanov N.S., 2002).
Всего в России 11 полутонкорунных пород, из них 1 шерстно-мясная (цигайская) и 8 мясошерстных, включая 5 длинношерстных (горноалтайская; линкольн; куйбышевская; русская длинношерстная; ромни-марш; северокавказская мясошерстная), 3 короткошерстные (горьковская; опаринская; латвийская темноголовая) и советская мясошерстная 3 типа корридель (кавказский и сибирский).
Группы крови овец: история их изучения и номенклатура
Открытие К. Ландштейнером в 1900 году антигенного различия человеческой крови и Ф. Бернштейном в 1924 г. законов генетического контроля АВО системы является начальной точкой иммуногенетических исследований. В 1936 г. М. Ирвин в результате изучения наследования эритроцитарных антигенов у голубей на основе семейного анализа предложил новый термин "иммуногенетика". В начале 1942 г. он показал наследование многих антигенов групп крови у крупного рогатого скота. Эти активные исследования вызвали международный интерес к изучению групп крови домашних животных и их применению в практике животноводства. Решающим в этом вопросе явились работы С. Стормонта и его учеников Б.А. Расмусена, Л.М. Спрея и И. Сузуки, которым с помощью алло - и ксеноиммунизации с применением реакции гемолиза удалось обнаружить большое количество антигенов групп крови у овец (табл. 2).
Я. Ренделю и Е.М. Такер мы обязаны сведениями по серологии и генетике растворимых антигенов групп крови, доказывающими, что некоторые антигены групп крови возникают вначале в сыворотке, а затем, абсорбируются на эритроцитах овец. Д.О. Шмид с соавт. исследовали лектины и протектины (вещества растительного и животного происхождения) - будущие источники специфических реагентов к антигенам групп крови овец (табл. 2).
В результате использования данных методик в эритроцитах овец было обнаружено более 100 антигенных факторов. Антигенные факторы животного строго наследственно обусловлены и не меняются в течение жизни. У потомков обнаруживаются лишь те антигены, которые были у их родителей. Они располагаются на поверхности эритроцитов и представляют собой сложные соединения в виде полисахаридов или липопротеинов.
Исследования показали, что у овец преобладают не агглютинины, за исключением анти - Da, а антитела типа гемолизинов (Hall J.G., 1975). В настоящее время с учетом экспериментальных известно 16 генетических систем групп крови у овец, из них 7 (А, В, С, D, М, R, I) признаны после нескольких международных сравнительных испытаний сывороток-реагентов, проведенных по линии МОГЖ (Nguyen Т.С., 1979). Вначале системы у овец были описаны в соответствии с классификацией групп крови крупного рогатого скота, с 1973 г. принята новая классификация. Было решено обозначение систем не изменять, за исключением R-О, которые решили сократить до R. Шесть установленных систем групп крови были обозначены буквами: А, В, С, D, М и R. Антигенные факторы внутри систем А, В, С, D и М были обозначены малыми буквами латинского алфавита а, Ь, с ... и т.д. Отсутствующий фактор был обозначен - (-). В R -системе, выявляемой естественными антителами, было решено фактор R обозначить как и систему, а символ О оставить за О антигеном. Под генетической системой групп крови следует понимать совокупность антигенов групп крови, контролируемых аллелями одного локуса. Каждая генетическая система крови объединяет эритроцитарные антигены, наследуемые по определенным закономерностям. Это дает возможность на основании наследования открываемых антигенов вносить их в ту или иную систему (Stormont С. et al., 1951). Антигены, относящиеся к различным системам, наследуются независимо друг от друга, а факторы, входящие в одну систему, являются аллеломорфами. Сумма всех факторов составляет тип крови организма. К настоящему времени у овец лучше изучено 9 генетических систем (А, В, С, D, М, R, I, F30, F41), различающихся между собой как количеством антигенов, так и числом соответствующих им аллелей (Nguyen Т.С., 1979).
Изучение групп крови овец начато в 20-х годах Bialosuknia W., Kaczkowski В. (1923), которые дифференцировали овец по серологическим различиям их крови. При использовании реакции агглютинации они установили три группы крови, которые обозначили: А, В, О. Впоследствии Andersen Т. (1938) подтвердил эти результаты, но сменил обозначение фактора А групп крови на R, a Rendel J. et al. (1954) описали генетическую взаимосвязь между факторами R
Характеристика моноспецифических сывороток у овец, использованных в процессе проведения исследований
Характеристика моноспецифических сывороток у овец, использованных в процессе проведения исследований. За последние 30 лет популяционно-генетическии анализ с использованием различных генетических маркеров находит широкое применение в овцеводстве Российской Федерации и других странах мира при характеристике аллелофонда, оценке производителей по качеству потомства, диагностике моно - и дизиготных двоен, определении связи с хозяйственно-полезными признаками, генетическом мониторинге аллелофонда у широко разводимых и локальных пород (рис. 3).
Накопленные знания по генетическим маркерам позволили предложить следующую методологию по использованию маркирующих систем крови у овец: создание референтного стада (международного или отдельного внутри какого-либо государства), состоящая из различных пород и поколений, аттестация его по различным локусам, периодическое проведение международных сравнительных испытаний по известным или новым системам и типам экспериментальных образцов, поиск QTL-генов, картирование генов, создание карты генома у овец и других видов Ovis, оценка их биоразнообразия. Обычно такие работы проводятся под эгидой Международного общества по генетике животных (МОГЖ) или других международных организаций, таких как ЕАЖ, ЕЭС, ФАО и т.д. К сожалению, наша страна далека для проведения многих молекулярно-генетических исследований, которые могут со временем принести пользу не только самой отрасли овцеводства в плане сохранения биоразнообраия, но и оказать непосредственное влияние на получаемую продуктивность.
В нашей работе были использованы антигенные характеристики по следующим системам групп крови: А -, В -, С -, D -, М -, R - и I. Одновременно нами при проведении исследований активно применяли полиморфные системы белков и микросателлиты. По группам крови аттестацию различных пород овец проводили диагностикумами прошедшими неоднократно Международные сравнительные испытания (Мюнхен, ФРГ, 1980; Краков, Польша, 1996) и соответствовали следующим критериям:
1. Были аллоиммунными, то есть, получены на основе аллоиммунизации различных пород овец. Исключением являлись антисыворотки анти-R и анти-0 (R система) которые были получены из неиммунных гетерофильных сывороток коз, крупного рогатого скота и яка. Сыворотка-реагент анти-Са (С-система) была получена аллоиммунизацией коз оренбургской породы совместно с к.б.н. С.Г. Канатбаевым в Уральской области Республики Казахстан.
2. Обладали: в силу чего реагировала с определенным антигеном, что неоднократно было подтверждено семейным анализом на породах ромни-марш (ГПЗ «Котовский» Рязанской области) и цигайской заволжского типа из ГПЗ «Алтайский» Саратовской области на поголовье 942 овец. (сродством), то есть способностью быстро или медленно соединяться с антигеном. Результаты данного явления мы видели в процессе постановки реакции гемолиза и агглютинации и при читке результатов.
Проведенные исследования на 45 породах и помесях овец показали, что наиболее оптимальным температурным режимом при исследовании групп крови у овец является 32±3С.
В процессе проведенных исследований было установлено, наиболее оптимальным для реакции гемолиза и агглютинации является рН=7.
Все использованные диагностикумы по группам крови имели высокие титры и составляли 1:10 - 1:64. Исключением являлись антисыворотки анти-Da, анти-R, анти-О, которые обладали титром в пределах от Н (цельные сыворотки) до 1:4. Как видно из приведенных данных все сыворотки использовали в определенных разведениях. Это было связано еще и с тем, что исключали "эффект прозоны", когда высоко титражная сыворотка в силу каких-то причин при малом разведении не реагирует на соответствующий антиген, хотя он присутствует на оболочке эритроцитов исследуемого животного.
Эволюционно-генетический анализ становления некоторых полутонкорунных пород овец
Расположение на дендрограмме кластеров анализируемых половозрастных групп заволжского типа представлено на рис. 5. Установлено, что наибольшее генетическое сходство отмечается между баранчиками и овцематками, затем идут ярочки и отдельно от всей этой группы племенные бараны-производители. Возможно эта ситуация подтверждает высокую степень отбора на племя баранов и вместе с тем вклада в потомство одинаковых генов обоими полами в силу высокой консолидированности популяции заволжского типа. Мы предполагаем, что со временем в результате отбора баранчиков на племя, генетическое расстояние между мужскими и женскими особями увеличится. Такое ведение селекционной работы позволит в дальнейшем поддерживать разнородность внутри стада ПЗ «Алтайском» и исключать инбридинг.
В процессе проведенного анализа цигайских овец из ПЗ "Алгайский" Саратовской области, ГПЗ "Славное" Крымской области Республики Украина и ГПЗ "Элита-Александерфельд" Кагульского района Республики Молдова установлены различия в частотах встречаемости антигенов (табл. 23).
Однако видно, что по суммарной встречаемости антигенов 7 систем групп крови наибольшей близостью обладают российская и украинская популяции и более удаленной от них - молдавские овцы. Более четко это видно из полученной дендрограммы на рис. 6. Она показывает общность происхождения российских и украинских овец от завезенных в свое время болгарскими переселенцами цигайской породы. И наоборот, молдавские овцы более отдаленные от двух сравниваемых шерстно-мясных типов создавались на основе румынского корня цигая, с привлечением в последние годы племенных животных из Украины.
Уровень гомозиготности по исследованной популяции заволжского типа цигайской породы составил - 0,581, что аналогично такой консолидированной породе каким является тексель (0,579) (Марзанов Н.С., 1994). По своему генетическому профилю заволжский тип в какой-то мере повторяет цигайские популяции Украины и Молдовы, что говорит о «растянутости» цигайской породы и небольшом времени дивергенции заволжского типа от двух других популяций.
Вместе с тем по ПЗ " Алгайский" возможна тенденция утончения шерсти, что видно из данных М-системы баранов-производителей и ярок, чей вклад более весомый в силу используемой технологии искусственного осеменения и смены поколений. Ма антиген, ассоциированный с величиной тонины шерсти, ниже по сравнению с другими анализируемыми типами животных (Марзанов Н.С., 1991).
Таким образом, впервые на большом поголовье проведена аттестация заволжского типа цигайской породы по 8 полиморфным системам групп крови и белков, изучен аллелофонд данной популяции по частоте встречаемости антигенов, аллелей и генотипов. На основе проведенных исследований констатируем, что заволжский тип цигайской породы овец в ПЗ"Алгайский" Саратовской области представляет собой хорошо консолидированную популяцию с определенным генетическим потенциалом и его можно использовать без дополнительного ввоза баранов извне.
Из полученной дендрограммы на рис. 6 следует, что шерстно-мясной заволжский тип близок по своим генетическим особенностям аналогичному типу из ГПЗ «Славное» республики Украина, что объясняется историческим происхождением в виде единого болгарского корня и однонаправленностью селекционной работы. В отличие от них овцы ГПЗ "Элита-Александерфельд" республики Молдова были созданы в типе шерстно-мясо-молочного и имеют иной, достаточно глубокий румынский корень цигайской породы.
