Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Продуктивность крупного рогатого скота и факторы на неё влияющие 6
1.2 Понятие о ДНК- полиморфизме и MAS-селекции 11
1.3 Полиморфизм гена гормона роста (ГР) и его влияние на продуктивность 16
2. Материалы и методы 24
2.1 Материал исследования 24
2.2 Метод полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПНР) для выявления полиморфизма гена ГР 27
2.3 Методы статистической обработки 30
3. Результаты и обсуждение 31
3.1 Распространенность аллелей и генотипов гена ГР у различных пород крупного рогатого скота в республике Башкортостан 31
3.2 Биохимические показатели крови телят в зависимости от генотипов по гену ГР 39
3.3 Молочная продуктивность коров с разными генотипами по гену ГР 45
3.4. Особенности роста и развития телят бестужевской и черно-пестрой пород в
зависимости от генотипа по гену ГР 63
3.5 Экономическое обоснование результатов исследований 88
Выводы 91
Предложения производству 92
Библиография
- Понятие о ДНК- полиморфизме и MAS-селекции
- Полиморфизм гена гормона роста (ГР) и его влияние на продуктивность
- Метод полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПНР) для выявления полиморфизма гена ГР
- Биохимические показатели крови телят в зависимости от генотипов по гену ГР
Введение к работе
Актуальность работы. Гормон роста (ГР) представляет собой гормон белковой природы, который принимает участие в инициации и поддержании лактации у млекопитающих и может рассматриваться как потенциальный генетический маркер молочной продуктивности крупного рогатого скота (к.р.с). Однако сведения о полиморфизме генов из данного семейства крайне ограничены.
При исследовании ДНК-полиморфизма гена соматотропина у крупного рогатого скота, показано, что полиморфный Mspl-сайт, локализованный в интроне III гена ГР, информативен для изучения связей с признаками молочной продуктивности. В ряде работ была показана ассоциация Мзр1(-)-аллеля с высоким уровнем жирности молока, а также повышением процента белка в молоке. Однако в других работах эта ассоциация не подтвердилась. Для Alul-полиморфизма гена ГР у голштинского канадского скота была описана ассоциация с молочной продуктивностью (Sabour, Lin, 1996) (Нуклеотидная замена, приводящая к появлению полиморфного сайта для эндонуклеазы Alul, приводит к замене в белковом продукте аминокислоты Val на Leu). Показана также корреляция генотипа W с большим выходом гормона роста в крови. (Lucy et al., 1993; Lee et al., 1993; Grochowska et al., 1999).
Активное участие продуктов гена соматотропного гормона в формировании признака молочной продуктивности служит основанием для продолжения поиска значимых ассоциаций полиморфных вариантов данного гена с конкретными параметрами молочной продуктивности и создании на их основе тест-систем, пригодных для использования в генетико-селекционной работе. Российские породы практически не изучены в этом отношении. Также остается мало изученным вопрос о влиянии селекционного давления на распространение частот аллелей генов пролактина и соматотропина в стадах крупного рогатого скота. Все эти вопросы нуждаются в дальнейшем исследовании.
Работа выполнена в рамках ГНТП АН РБ «Оптимизация
функционирования и использование потенциала биологических систем РБ
(подпрограмма «Эколого-биологические основы сохранения биоразнообразия и устойчивости экосистем РБ») по теме «Полиморфизм генов каппа-казеина и соматотропина в связи с продуктивностью крупного рогатого скота РБ», а также при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (Поволжье, № проекта 08-04-97069) по теме «Молекулярно-генетические маркеры в селекции крупного рогатого скота в РБ».
Цель работы. Изучение полиморфизма гена гормона роста как маркера молочной продуктивности у коров черно-пестрой, бестужевской и симментальской пород, исследование роста и развития молодняка черно-пестрой и бестужевской породы в зависимости от их генотипической принадлежности к различным аллельным вариантам гена ГР.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи;
Исследовать полиморфизм гена гормона роста по двум маркерам, локализованным в разных областях гена (ПЦР-ПДРФ с использованием рестрицирующих эндонуклеаз Mspl и Alul);
Оценить частоты аллелей и генотипов по тестируемым локусам по каждому аллельному варианту;
Провести анализ биохимических показателей крови телят в зависимости от генотипа ГР;
Провести поиск ассоциаций полиморфных вариантов гена ГР с различными признаками молочной продуктивности.
Провести поиск ассоциаций роста и развития телят бестужевской и черно-пестрой пород в зависимости от генотипа ГР;
Научная новизна работы. Впервые в республике Башкортостан была проведена оценка частот встречаемости генов и генотипов по двум локусам гена ГР (CD и VL) у плановых пород (черно-пестрой, бестужевской и симментальской) крупного рогатого скота.
Изучен биохимический состав крови у телят с разными генотипами по гену ГР. Проведён анализ ассоциаций выявленных генотипов по двум локусам гена ГР (CD и VL) с молочной продуктивностью у плановых пород РБ. Дана оценка роста и развития телят в зависимости от генотипов по гену ГР.
Научно-практическая значимость. Участие продуктов гена соматотропного гормона в формировании признака молочной продуктивности может служить основанием для продолжения поиска значимых ассоциаций полиморфных вариантов данного гена с конкретными параметрами молочной продуктивности и создании на их основе тест-систем, пригодных для использования в генетико-селекционной работе.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований
были доложены и обсуждены период 2005-2008гг на Всероссийской научно-
практической конференции «Перспективы агропромышленного производства
регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта
«Развитие АПК» (Уфа, 2006), Международной научно-практической
конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы повышения
продуктивности с.-х. животных в изменившихся условиях хозяйствования и
экологии» (Ульяновск, 2008), Международной научной конференции
«Современные методы генетики и селекции в животноводстве» (С.-Петербург-
Пушкин, ВНИИГРЖ, 2007), III Международной научно-практической
конференции «Аграрная наука - сельскому хозяйству» (Барнаул, 2008), II
Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука в
XXI веке: проблемы и перспективы» (Саратов, 2008), II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов « Молодежная наука и АПК: Проблемы и перспективы» (Уфа, 2008).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 9 научных трудов, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном перечнем ВАК (журнал «Зоотехния»).
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их
обсуждение, выводы, предложения производству, библиографию и
приложения. Работа содержит 120 страниц машинописного текста, 33
таблицы, 35 рисунков. Библиографический список включает 152
наименования, в том числе 19 зарубежных авторов. Приложения включают 10 таблиц.
Понятие о ДНК- полиморфизме и MAS-селекции
Понятие о ДНК- полиморфизме и MAS-селекции Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило, заключаются в незначительных вариациях его "генетического" кода. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, интронах, регуляторных участках и т.д. Тем не менее, вариации, затрагивающие кодирующие фрагменты генов и отражающиеся на аминокислотной последовательности их продуктов, встречаются относительно редко и не имеют отношения к анализируемой конкретной проблеме, для которой в первую очередь важны возможные последствия полиморфизма нитронов и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Анализ данного феномена в существенной степени зависит от того, насколько вариабельны собственные функции белка, кодируемого различными аллелями, что справедливо и в отношении ферментов образования и метаболизма стероидных гормонов.
Локус называется полиморфным, если в популяции существуют два или более аллеля этого локуса. Однако, если один из аллелей имеет очень высокую частоту, скажем, 0,99 или больше, то высока вероятность того, что ни одна другая аллель не будет присутствовать в выборке, взятой из популяции, если только эта выборка не будет очень большой. Таким образом, обычно локус определяется как полиморфный, если частота наиболее распространенного аллеля меньше 0,99. Такое деление носит весьма условный характер и в литературе можно найти другие критерии полиморфности (Nei М., Li W.-H., 1979).
Развитие техники анализа нуклеиновых кислот позволяло перенести исследование генетического полиморфизма на уровень ДНК, что позволяет выявить все возможные варианты конкретного гена (Глазко В.И. и др., 2001). В середине 80-х годов 20 века появился совершенно новый класс генетических маркеров, основанный на явлении полиморфизма ДНК.
Полиморфизм ДНК — это различия в чередовании нуклеотидов которые наблюдаются у различных особей одного вида (Глазко В.И., 1988).
Благодаря развитию методов выделения, клонирования и разрезания (рестрикции) генов, сформировалось целое направление под названием ДНК — технологий (Глазко В.И., Доманский Н.Н., Созинов А.А., 1998; Глазко В.И., Дунин И.М., 2001).
ДНК—технологии широко используются для разработки методов селекции с помощью молекулярно-генетических маркеров - MAS, то есть маркирования главных генов количественных признаков — QTL; сохранения биоразнообразия с использованием молекулярно-генетических маркеров; разработки генетически обоснованных программ разведения и подбора родительских форм животных, изучения генетических механизмов развития и предупреждения различных заболеваний.
В настоящее время в популяционно-генетических исследованиях наиболее широко используются следующие типы ДНК-маркеров:
1. Полиморфизм по длине рестриктных фрагментов ДНК (известная аббревиатура - RFPLs: restriction fragment length polymorphisms; русский эквивалент - ПДРФ). Анализу и сравнению подлежат гомологичные фрагменты геномной, эписомной и иной ДНК размером до 30 - 50 п.н., иногда до нескольких миллионов п.н. Полиморфизм обусловлен изменениями в ДНК, приводящими к появлению (исчезновению или изменению взаиморасположению) сайтов узнавания для рестриктаз, и выявляется методами рестрикции, гель — электрофореза и блот-гибридизации. ПДРФ -широко распространенное явление. Соответствующие аллельные материалы могут быть использованы как маркеры отдельных локусов хромосом. Некоторые из таких генов, тесно сцепленных с аллельными вариантами ПДРФ, могут участвовать в детерминировании признаков продуктивности. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании многих биологических и экономически важных признаков. Использование ПДРФ позволило в короткие сроки существенно заполнить генетические карты различных видов, включая человека, растений и видов домашних животных.
Полиморфизм гена гормона роста (ГР) и его влияние на продуктивность
Соматотропин — один из главных регуляторов развития млекопитающих (Журавель Е.В., Лисовский И Л., 1997). Гормон роста у всех видов млекопитающих представляет собой одиночный пептид с молекулярной массой около 22000.
Гормон роста (GH), пролактин (PRL, лактогенный гормон, маммотропин) и хорионический соматомаммотропин (плацентарный лактоген, PL) представляют собой семейство белковых гормонов, обладающих значительной гомологией последовательностей. Их молекулы у разных видов насчитывают 190-199 аминокислотных остатков. Все три гормона оказывают сходное действие: обладают рост-стимулирующей и лактогенной активностью. Считается, что гены гормона роста и пролактина появились в результате дупликации общего предкового гена около 400 миллионов лет назад (Бакл Дж. Гормоны животных, 1986) и затем эволюционировали самостоятельно, располагаясь на разных хромосомах, например, у человека на 6 и 17 хромосомах, соответственно.
GH и PRL продуцируются передней долей гипофиза и принимают участие в регуляции лактации. На синтез GH влияет множество химический соединений — например, эстрогены, дофамин, сератонин, полипептиды, гормоны кишечника, гамма-аминомасляная кислота и её производные.
У человека соматотропин состоит из 191 аминокислотного остатка, имеет два дисульфидных мостика и различаются лишь по 29 остаткам в цепи. Концентрация гормона роста (ГР) в гипофизе 5-15 мг/г.
Гормон соматотропин необходим для постнатального роста и для нормализации углеводного, липидного, азотного и минерального обмена. ГР стимулирует транспорт аминокислот в мышечные клетки и, кроме того, усиливает синтез белка, причем независимо от влияния на транспорт аминокислот. У животных, получающих ГР, возникает положительный азотный баланс, что отражает общее повышение белкового синтеза и снижение содержания аминокислот и мочевины в плазме и моче. Указанные изменения сопровождаются повышением уровня синтеза РНК и ДНК в отдельных тканях. В этом отношении действие ГР сходно с некоторыми эффектами инсулина (Naj S., Fradholm et. al., 1993).
В плане влияния на углеводный обмен гормон роста является антагонистом инсулина. Гипергликемия, возникающая после введения ГР, -результат сочетания сниженной периферической утилизации глюкозы и ее повышенной продукции печенью в процессе глюконеогенеза. Действуя на печень, ГР увеличивает содержание в ней гликогена, вероятно, вследствие активации глюконеогенеза из аминокислот. ГР может вызывать нарушение некоторых стадий гликолиза, а также торможение транспорта глюкозы. Обусловлен ли данный эффект результатом подавления гликолиза, пока не установлено. Ингибирование гликолиза в мышцах может быть также связано с мобилизацией жирных кислот из триацилглицероловых резервов. При длительном введении ГР существует опасность возникновения сахарного диабета (Бакл Дж., 1986).
ГР активно участвуют в минеральном обмене, способствует положительному балансу кальция, магния, фосфата и вызывает задержку Na, К и С]. ГР оказывает также пролактинподобное действие, связываясь с лактогенными рецепторами и поэтому обладает способностью к стимуляции молочных желез и лактогенеза. Соматотропный гормон обладает ярко выраженной видоспецифичностью. Это свойство соматотропина отличает его от большинства известных гормонов (в частности, пролактина и плацентарного соматотропина) и делает практически уникальным в эндокринной системе.
В настоящее время во многих странах гормон роста (GH) человека и животных получают на основе методов генетической инженерии и применяют, в частности, в медицине для лечения карликовости, заживления ран и переломов костей, а в сельском хозяйстве — для увеличения продуктивности скота. Применение гормона ведёт к увеличению мышечной и снижению жировой массы тела.
Рецептор гормона роста (GHR) относится к семейству цитокиновых рецепторов. Этот класс рецепторов представлен 15 членами, включая рецепторы эритропоэтина, пролактина, нескольких интердейкинов, лептина и др. (Waters et al., 1999). GHR играет главную роль в регуляции действия гормона роста и, таким образом, может рассматриваться как очевидный кандидатный ген, ассоциированный с признаками молочной продуктивности. В настоящее время принято считать, что причина видовой специфичности эффектов ГР заключается в изменчивости его линейной структуры у представителей разных таксономических групп и в строгой видовой специфичности сродства рецепторов соматотропина к структуре гормона данной таксономической единицы (Кветной И., 1988).
Метод полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПНР) для выявления полиморфизма гена ГР
Кровь у животных брали из яремной вены в количестве 5-8 мл. В качестве консерванта использовали стерильный раствор глюцира. ДНК из крови выделяли по стандартному фенол-хлороформному методу с использованием лизиса клеток крови 10%-ным SDS в присутствии протеиназы К и депротеинизацию фенол-хлороформом и последующим осаждением этанолом, как описано Р.Маниатис (1989). Образцы ДНК хранились в виде водного раствора при 20С.
Смесь для ПЦР содержала по 1 мкл препарата ДНК, по 1 мкл каждого праймера, по 1 мкл dNTP и 2,5 мкл буфера для амплификации, 17,5 мкл воды, а также по 1 мкл полимеразы («Сибэнзим» Новосибирск). Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия). Для определения полиморфизма C/D и L/V вариантов гормона роста использовали соответственно рестриктазы Mspl и Alul. Рестрикция велась в течение ночи в объеме 10 мкл. Электрофорез продуктов рестрикции проводили в 7,5 % полиакриламидном геле в буфере 0,5 X ТВЕ. Изображения гелей фиксировали с помощью видеосистемы «DNA-analyser» и прилагаемого к ней программного обеспечения «DNA-Imager» и «Gel-Analysis» в версии 1.0.
В качестве маркера молекулярных масс использовали маркеры: pUC19/MspI (908, 659, 656, 521, 403, 281, 257, 226,100), PBR322/AluI (501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, ПО, 67, 34, 26), предоставленные фирмой «СибЭнзим».
Для анализа динамики признаков продуктивности использовалась компьютерная программа «Statistica» в версии 5.1. При помощи этой программы расчитывались средние арифметические величины (М±т), средние квадратические отклонения (а), коэффициенты вариации (Cv) и корреляции (г). Достоверность различий средних величин между сравниваемыми группами оценивали по критерию Стьюдента (Плохинский Н.А., 1970.) с использованием программы EXCEL.
Экономическая эффективность выращивания молодняка была рассчитана по данным учёта всех затрат на выращивание и полученной суммы от реализации продукции.
Частоту генотипов рассчитывали по формуле: п.. N где Р; - частота і-генотипа; пі - число животных, имеющих данный генотип; N — общее число обследованных животных. Частоту генов рассчитывали по формуле: т 2 (СС) +LV(CD) 2Vr(DD)+LV(CD) 44 IN V(M) 2N где LL, СС, DD - количество животных с гомозиготными генотипами по соответствующим локусам; LV, CD - количество животных с гетерозиготными генотипами по соответствующим локусам.
Целью настоящего раздела является сравнительный анализ частот генов и генотипов по C/D и L/V локусам гена гормона роста в выборках плановых пород крупного рогатого скота республики Башкортостан.
На рисунке 4 представлена электрофореграмма различных генотипов по L/V и C/D локусам гена соматотропина, выявленных методом ПЦР-ПДРФ. 12 3 4 5 М 6 Рисунок 4 Электрофоретическое разделение в 7,5% ПААГе продуктов рестрикции изученных аллелей соматотропина 1 -3 варианты L/V аллелей (1-генотип LL, 2-генотип LV, 3-генотип VV), 4-6 варианты C/D аллелей (4 - генотип СС, 5- генотип CD, 6- генотип DD). В качестве маркера молекулярных масс использованы фрагменты pUClWMspI.
На рисунке 4 видно, что рестрикционные фрагменты, полученные при помощи рестриктазы Mspl, по C/D локусу соматотропина, для генотипа СС составляют 612 и 93, для генотипа DD —705, а для гетерозиготного генотипа CD - 705, 612 и 93. Мелкие фрагменты длиной 63 п.н. на электрофореграмме не видны. По L/V локусу рестрикционные фрагменты (Alul) представлены для генотипа LL ампликонами 265 и 96 п.н.; для W -265 и 147 п.н. и для гетерозиготного генотипа LV - 265, 147 и 96 п.н. Фрагмент длиной 51 п.н. на электрофореграмме не заметен из-за слабого окрашивания. В таблице 2 представлены частоты генов и генотипов CD- и LV-локусов соматотропного гормона в исследованных группах коров бестужевской и черно-пестрой пород.
Биохимические показатели крови телят в зависимости от генотипов по гену ГР
Цель исследования состояла в том, чтобы выявить влияние различных генотипов гена гормона роста на некоторые биохимические показатели крови телят бестужевской и чёрно-пёстрой пород.
Изучалось содержание лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы, общего белка и его фракций (альбуминов, 6 , р- и у-глобулинов), а также фосфора и кальция. Определение данных показателей проводилось в возрасте 3 месяца по общепринятым методикам (4), как указано в разделе 2.
В таблице 5 представлены биохимические показатели телят черно-пестрой и бестужевской пород.
Анализ биохимических показателей крови 3-х месячных телят бестужевской и чёрно-пёстрой пород показал, что в целом, без разделения на генотипы, породы довольно значительно различаются между собой по активности щелочной фосфатазы (9,4±1,23 и 6,11±1Д5 соответственно у бестужевских и чёрно-пёстрых телят; ta=l,66; р 0,1), а также по содержанию а- и у-глобулинов (0,66±0,03 и 0,46±0,12; 0,81±0,15 и 1,28±0,29 соответственно; td=l,46; р 0,1). Как видно, эти различия являются недостоверными. По остальным изученным биохимическим показателям крови не отмечено существенных межпородных различий. У бестужевских телят несколько более высокое содержание лейкоцитов (8Д9±0,71 и 7,67±0,49), эритроцитов (6,33±0,37 и 5,77±0,35), а также фосфора (7,61±0,47 и 6,67±0,33). Косвенным образом эти данные могут указывать на более интенсивно протекающие обменные биохимические процессы. Вместе с тем более низкое содержание у них у-глобулинов, по-видимому, может свидетельствовать о более низком иммунном статусе (С.Г.Исламова, А.Г. Маннапов, 2004).
В таблице 6 представлены данные о биохимических показателях крови телят черно-пестрой и бестужевской пород в зависимости от генотипа по CD-локусу ГР.
Можно отметить, что у бестужевских телят генотипы CD и DD достоверно различаются между собой по содержанию эритроцитов (6,55 ±0,14 и 5,67±0,19; td=3,82; р 0,001), гемоглобина (122,4±2,18 и 103,1±2,8 ; td=6,l; р 0,01); td=3,82; р 0,001), соответственно.
У животных с гетерозиготными генотипами CD эти показатели выше. Активность фермента АсАТ выше в крови телят с гомозиготными генотипами СС (0,55±0,01) и несколько ниже у двух (CD и DD) других генотипов (0,48±0,02 и 0,46±0,04; td=2,2; р 0,05).
Содержание же фермента АлАТ, хотя он также как и АсАТ отражает интенсивность белкового обмена, напротив, выше у телят с гомозиготными генотипами DD (0,2±0,08) и ниже у генотипов СС (0,17±0,02) и CD (0,14±0,01).Эти различия являются достоверными - td=9,2; р 0,001.
Самое высокое содержание у-глобулинов наблюдается у бестужевских телят с генотипом СС (1,22±0,2); самое низкое — у телят с генотипом DD (0,58±0,3), а телята с гетерозиготным генотипом CD имеют среднее содержание у-глобулинов (0,74±0,1). От генотипа также зависит и содержание d-глобулинов. Так, самый высокий его уровень отмечается у телят с гетерозиготным генотипом CD (0,74±0,13), а самый низкий — у телят с гомозиготным генотипом DD (0,37±0,28). По Р-глобулинам не отмечается различий в содержании между тремя группами телят бестужевской породы.
У телят черно-пестрой породы, так же как и бестужевских, самое низкое содержание эритроцитов и гемоглобина отмечается в группе с гомозиготными генотипами DD. Если по содержанию эритроцитов 3 группы черно-пестрых телят отличаются между собой недостоверно (1(1=1,61; р 0,1), то по гемоглобину эти различия достоверны. Так, в крови телят с генотипами СС самое высокое содержание гемоглобина (144,5±2,4); у гетерозигот CD более низкое (116,4±2,8; td=8,03; р 0,01), а у гомозигот DD (5,45±1,23) и DD (4,42±0,32). По содержанию у- глобулинов отмечается закономерность, описанная для бестужевских телят, а именно их содержание несколько (td=0,88, р 0,1) выше в группе телят с генотипами СС (2,00±0,68) и ниже у телят с генотипами DD (1,23±0,56).
Более высоким содержанием кальция, как у черно-пестрых, так и бестужевских телят, характеризуются генотипы СС. Так достоверность различий у черно-пестрой породы составляет 5,4 ( р 0,001), а бестужевской — 1,96 (р 0,05). Поскольку ГР влияет на обмен кальция (Калашникова Л.А., 1999) можно предположить, что наличие в генотипе животных двух аллелей С ассоциируется с более интенсивным обменом этого макроэлемента и может влиять на интенсивность роста телят.
