Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Современные аспекты маркерной селекции 10
1.2. Современные представления о метаболизме липидов 13
1.3. Роль гормона лептина в формировании фенотипа жирового обмена 23
1.4. Структурная и функциональная характеристика гена оЪ 29
1.5. Мутации и полиморфизмы в гене лептина и их ассоциации с патологическими фенотипами 40
II. Материалы и методы исследования 46
2.1. Методика забора крови 46
2.2. Выделение ДНК 46
2.3. ПЦР-ПДРФ анализ 48
2.4. Проведение полимеразно-цепной реакции (ПЦР) 48
2.5. Проведение рестрикции 51
2.6. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) 51
2.7. Окраска геля 52
2.8. Обработка результатов анализа электрофореза 52
2.9. Методика выделения липидов методом Блайя-Дайера 53
2.10. Фракционирование липидов в тонких слоях силикагеля и их количественное определение 53
2.11. Определение содержания диеновых и триеновых коньюгатов в липидах плазмы крови 55
2.12. ТБК-тест для измерения концентрации вторичных продуктов перекисного окисления липидов 55
2.13. Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК 56
2.14. Секвенирование регуляторной области гена оЪ 57
2.15. Оценка фенотипа 57
2.16. Статистическая обработка 58
III. Результаты собственных исследований 59
3.1. Изучение структурно-функциональной организации гена оЪ 60
3.2. Проведение филогенетического анализа гена оЪ 66
3.3. Изучение мутационной изменчивости гена оЪ 72
3.4. Изучение патогенетического значения мутации С3469Т у свиней 81
3.5. Моделирование методом молекулярной механики взаимодействий ДНК-липид с промотором гена оЪ свиньи 85
Обсуждение результатов собственных исследований 90
Выводы 97
Практические рекомендации 99
Список использованных источников
- Роль гормона лептина в формировании фенотипа жирового обмена
- Проведение электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
- Секвенирование регуляторной области гена оЪ
- Изучение мутационной изменчивости гена оЪ
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Мировые достижения в области молекулярной генетики и ее передовой отрасли знаний геномики дают новые возможности для интенсивного развития селекции, разработке новых методов совершенствования существующих и выведения новых высокопродуктивных пород сельскохозяйственных животных (Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., 2005; Мысик А., 2006).
Современные молекулярно-генетические методы позволяют характеризовать генотипы сельскохозяйственных животных по ДНК-маркерам – генам и геномным локусам, важным в биологическом и хозяйственном отношении. На основании исследования генетических маркеров, определяющих полезные качества сельскохозяйственных животных, выявляются четкие корреляции между особенностями генотипа по тому или иному гену (набору генов) и конкретному проявлению признака (Кленовицкий П. М., Моисейкина Л. Г. и др., 1997).
В настоящее время основная стратегия развития свиноводства связана с получением животных с мясом высокого качества и низким содержанием жира. Перспективным геном-кандидатом для оценки «постности» мяса является ген лептина (ob), белковый продукт которого гормон лептин участвует в регуляции липидного обмена.
Лептин – это белковый гормон, образуемый преимущественно адипоцитами. Лептин выступает как центральный регулятор массы жира в организме, функционирующий путем снижения количества потребляемой пищи и увеличения расхода энергии. Он также вовлечен в индукцию резистентности к инсулину, что приводит в дальнейшем к модификации метаболических эффектов инсулина (Tritos N., 1997, Urbanski H. F., 2001).
Липидный обмен представляет собой сложный комплекс переплетающихся реакций, находящихся под влиянием различных регуляторных факторов. Ключевая роль лептиновой регуляции липидного обмена на организменном уровне позволяет выявлять четкие ассоциации между наличием различных аллельных вариантов гена лептина и параметрами липидного обмена, связанными с избыточным накоплением жира в подкожной клетчатке (Панков Ю. А., 1996; Панкрушина А. Н., Толстых К. Ю., 2008).
В свиноводстве ген лептина рассматривается как перспективный ген-кандидат для оценки эффективности роста, жирности и использования кормов (Jin L. et al., 2000., Mantzoros C.S., 1999).
Ген, кодирующий лептин, называется геном ожирения (ob gene) (Аметов А. С., 2005, Бубнова М. Г., 2005; Кучер А. Г., 2005). Мутации в гене ob вызывают нарушение обмена веществ и приводят к накоплению избыточного веса у свиней. Они характеризуются повышенным отложением в жировой ткани, чрезмерным потреблением пищи, низкой физической активностью, снижением энергетического обмена, нарушением баланса энергии, изменением в сторону увеличения толщины шпика (Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., 2005).
Ген ob является геном экономической важности, так как он отвечает за важнейшие хозяйственно-полезные признаки, определяющих коммерческую стоимость, а именно, потребление пищи, толщину жира свиньи, рост и воспроизводство. К тому же, поиск полиморфизмов в этом гене нацелен на изменения, связанные с производительными и репродуктивными особенностями (Фильченков А. А., 2007).
Однако выявленные мутации в гене лептина у свиньи не отражают всего разнообразия известных мутаций в этом гене у хорошо изученных в генетическом плане организмов человека и мыши. Сведений о влиянии на фенотип свиньи мутаций в гене лептина явно недостаточно, поскольку существуют проблемы в знаниях о геноме этого организма и взаимосвязи мутаций с конкретными фенотипическими признаками. Изучение структурных особенностей и регулируемости гена лептина как элемента генома свиньи и влияние мутаций в гене на фенотип свиньи является актуальным направлением для биологических, сельскохозяйственных наук и практики.
Интерес к лептину, как гормональному регулятору липидного обмена не угасает до настоящего времени.
1.2. Цель и задачи исследования.
Целью исследования являлось изучение структурно-функциональной организации гена лептина и влияние точковой мутации С3469Т на липидный компонент плазмы крови и некоторые показатели жирового обмена у свиней.
В задачи исследования входило:
1. Изучить структурную организацию гена лептина, а также провести филогенетический анализ происхождения гена лептина с целью определения степени его гомологии у некоторых видов млекопитающих.
2. Изучить мутационную изменчивость гена лептина, используя базы данных NCBI, HumBio, Pubmed, результаты секвенирования и частоты встречаемости мутации С3469Т в выборке свиней ЗАО «Талина».
3. Изучить влияние точковой мутации С3469Т в гене ob на липидный компонент плазмы крови и на показатели фенотипа жирового обмена у свиней.
4. С помощью компьютерного анализа исследовать влияние липидов на транскрипцию гена ob.
1.3. Научная новизна работы.
Проведены сравнительные исследования структурно-функциональной особенности генов ob у человека, мыши и свиньи. Показана высокая степень гомологии генов лептина у различающихся в эволюционном плане животных, выявлена возможность сравнения известных мутаций в гене лептина человека, мыши и генома свиней. Определены частоты встречаемости генотипов и аллелей гена лептина по точковой мутации С3469Т в выборке свиней ЗАО «Талина» Республики Мордовия. Впервые проанализированы особенности спектра липидов плазмы крови свиней, которые являются носителями точковой мутации С3469Т. Выявлена связь желательного генотипа ТТ, промежуточного СТ и нежелательного СС с характером спектра липидов плазмы крови. Впервые выявлены перестройки в составе липидов при наличии точковой мутации С3469Т в гене лептина в сторону уменьшения содержания в плазме крови свиней суммарных фосфолипидов, триацилглицеролов, а также увеличения уровня эфиров холестерина. Установлено резкое падение уровня диацилглицеролов и свободных жирных кислот в плазме крови свиней. Впервые показано, что у носителей точковой мутации С3469Т липиды плазмы крови характеризуются высоким уровнем окисленности. Изучена мутационная изменчивость гена лептина свиней, выявлены аллельные варианты гена, которые могут влиять на фенотип жирового обмена. Впервые с помощью компьютерного анализа сделано предположение о влиянии липидов на транскрипцию гена ob лептина свиней.
Положения, выносимые на защиту:
1 Структурные особенности гена ob свиньи как основа лептиновой регуляции липидного обмена у свиньи.
2 Влияние точковой мутации С3469Т в гене ob свиней на спектр липидов и связь ее с окислением липидов в плазме крови.
3 Влияние липидов на транскрипцию гена ob.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования генотипов и фенотипов свиней вносят вклад в решение задач молекулярно-генетического мониторинга сельскохозяйственных животных для оценки генетического резерва и формирования новых пород. Теоретическое значение имеет определение путей влияния полиморфноаллельных вариантов гена на липидный гомеостаз и на организм в целом, в связи с перестройками в спектре липидов крови и их окисленности.
Практическая значимость работы заключается в выявлении и ограничении распространения точковой мутации С3469Т в выборке свиней, что позволяет анализировать новые аспекты регуляторной активности лептина, связанные со снижением хозяйственно-полезных признаков у свиней. Полученные в работе результаты могут служить основой для создания генетической базы, характеризующей репродуктивные и продуктивные качества племенного ядра свиней в Мордовии. Полученные результаты в дальнейшем могут быть использованы для создания молекулярно-генетической базы, характеризующей хозяйственно-полезные признаки свиней. Материалы, представленные в диссертации рекомендуем использовать при чтении лекций, проведения практических занятий и написания методических рекомендаций по соответствующим разделам генетики сельскохозяйственных животных, разведения и селекции, и морфологии животных.
1.5. Структура и объем диссертации.
Роль гормона лептина в формировании фенотипа жирового обмена
В настоящее время одной из ключевых проблем генетики сельскохозяйственных животных является недостаточная информация по частной генетике различных видов, малое количество экспериментальных данных о популяционно-генетическои изменчивости в процессах селекции, о возможных механизмах такой изменчивости. Решение этих задач в значительной мере могло бы упростить генетическое маркирование животных с желательным развитием комплексов признаков продуктивности, их раннюю диагностику и ускорить селекционную работу (Готфрид Б., Кройслих X., 1995; Зиновьева Н. А., 2005).
Маркерная селекция представляет собой современный молекулярно-генетический метод селекции животных, в сельском хозяйстве. Принципиальным отличием от традиционной селекции здесь является отбор животных в систему скрещивания на генетическом уровне, т.е. на уровне генов, их маркерного значения для разведения и выведения новых пород. Она широко внедряется в животноводство развитых стран мира, таких как Голландия, Франция, Англия, которые являются в настоящее время передовыми в области сельского хозяйства и интенсивно используют современные методы молекулярной биологии в работе над выведением новых пород.
Выделяют несколько групп генетических маркеров. Первая, наиболее развитая - иммуногенетические маркеры. Хотя не все антигенные детерминанты являются конкретными продуктами структурных генов, возможно выявление тех аллельных вариантов данного структурного гена; к антигенным детерминантам продукта которого имеются антитела (Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., 2005).
Следующий вид наиболее выраженных генетических маркеров - это биохимические маркеры. Белок - продукт, как правило, одного гена: аллельные варианты наследуются кодоминантно, не зависят от окружающей среды, являются относительно стабильными» в онтогенезе, и благодаря» детальной изученности биохимических функций большинства из них, белки, выступают в ролине только маркеров структурных генов, но и уникального генетического своеобразия конкретных звеньев, охватывающих сложно организованную сеть общего метаболизма.
И особенно стоит выделить широко распространившуюся группу генетических маркеров - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (Зиновьева Н. А., Гладырь Е. А., Эрнст Л. К., 2001).
Для данного вида маркеров характерна генетическая маркировка структурного гена на уровне ДНК, которая в большинстве случаев может быть связана не с феном - продуктом этого гена, а с закономерностями эволюционного процесса, протекающего в самой ДНК.
Полиморфизм ДНК проходит тестирование разнообразными способами, которое может включать, в том числе и прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК. Хотя на практике же чаще всего пользуются обработкой ДНК рестрицирующими эндонуклеазами с дальнейшим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин фрагментов рестрикции.
Выявление молекулярно-генетических маркеров, которые напрямую могли бы быть ассоциировании с развитием желательных и полезных признаков продуктивности в определенных средовых условиях, и является основной задачей современных исследований в науке нашей страны, так, и за рубежом (Зиновьева Н. А., Гладырь Е. А., Эрнст Л. К., 2001):
В зависимости от того, какая ДНК, на каком уровне и какими методами анализируется, выделяют три основных типа полиморфизма ДНК (Булат., Мироненко., 1993).
Полиморфизм по длине рестриктных фрагментов ДНК (restriction fragment length polymorphism; русский эквивалент - ПДРФ). Данный вид полиморфизма обусловлен изменениями в ДНК, которые приводят к выявлению сайтов узнавания для рестриктаз, и определяется методами рестрикции, гель-электрофореза и блот-гибридизации.
Полиморфизм последовательности ДНК (sequence polymorphism); При сиквенировании1 анализируют и сравнивают между собой гомологичные участкиї ДНК размером в несколько тысяч пар нуклеотидов (п.н.). Полиморфизм обусловлен характерными изменениями в« нуклеотидной6 последовательности и выявляется в ходе сиквенирования.
Полиморфизм по длине и структуре амплифицированной в ПНР ДНК. Полиморфизм характеризуется изменениями, как самой нуклеотидной последовательности, так и малых участков ДНК, комплементарных олигопраймерам, или изменением взаимного расположения этих участков, фланкирующих определенный участок ДНК. Генодиагностика — наиболее перспективная, интенсивно прогрессирующая технология как фундаментальной, так и прикладной биотехнологии, одной» из областей применения которой является разведение и селекция сельскохозяйственных животных (Зиновьева Н. А. и др., 2002).
Безусловно, различия в показателях продуктивности между отдельными животными, линиями, породами обусловлены с одной стороны средовыми (факторы внешней среды), с другой стороны, генетическими факторами. Большинство всех хозяйственно-полезных признаков сельскохозяйственных животных относится к полигенным признакам, что определяет генетически их количественный уровень целым рядом генов (локусов), которые располагаются по всему генотипу. Такие локусы получили название локусов количественных признаков, QTL (Quantotative Trait Loci s).
Генетический полиморфизм выявляется как на фенотипическом, биохимическом, хромосомном, молекулярном, так и на генном уровне.
В случае молекулярно-генетического полиморфизма стоит отметить, что речь заходит об изменениях в структуре ДНК, обусловленных разнообразными типами и видами мутаций. Наиболее распространенный, тип полиморфизма обусловлен точковыми мутациями. Термин «точковая мутация» означает локальное изменение в нуклеотидной последовательности ДНК, обусловленное заменой одного азотистого основания на другое.
Проведение электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
Лептин оказывает и иные виды воздействия! на организм. В частности, гормон участвует в регуляции возобновления костной ткани. В экспериментах над мышами внутримозговые инъекции лептина (в области желудочков) приводили к снижению плотности костной массы, что нельзя рассматривать как благоприятное действие при применении лептин-индуцированной диеты (Щеплягина Л. А., 2005, Инюшкина Е. М., 2006). Кроме того, при повышении уровня лептина стимулируется выработка гормонов щитовидной железы, соматотропного и половых гормонов, подавляется активность гипофизарно-адреналовой системы. За счет прямого или опосредованного через другие гормоны действия лептин влияет на гемопоэз и иммунитет, а также регулирует репродуктивную функцию (через систему гипоталамус-гипофиз-гонады). Кроме активации проапоптотических факторов, лептин способен блокировать действие эндогенных ингибиторов апоптоза. Необходимо подчеркнуть, что вызываемый лептином апоптоз адипоцитов носит временный характер, и включающиеся защитные механизмы, в том числе развитие резистентности к лептин-зависимому апоптозу, блокируют дальнейшую гибель клеток живой ткани (Fantuzzi G., 2000).
Лептин, по-видимому, необходим для созревания репродуктивной оси, на это указывает его способность восстанавливать половую зрелость и плодовитость у оЪ/оЪ мышей и усиливать репродуктивное поведение у грызунов. Лептин стимулирует высвобождение гонадотропина и ингибирует инсулин-подобное ростовым фактором обусловленное высвобождение эстрадиола фолликулярными клетками (Fedorcsa Р., 2003).
Лептин может играть важную роль в развитии. Показано его участие в формировании плаценты. Он и его рецепторы широко экспрессируются в плодных тканях и стимулируют гематопоэз и ангиогенез. Лептин также участвует в развитии мозга (Hegyi К., 2004).
Гены мыши и человека были исследованы в 1994 году группой ученых из Рокфеллеровского университета в Нью-Йорке с использованием методов позиционного клонирования. С использованием обратно-транскриптной ПЦР (ОТ-ПЦР) на основе РНК, выделенной из жировой ткани человека, была создана клонотека кДНК, из которой выделена и секвенирована кДНК оЪ (Ahima R., 2000).
Сравнение нуклеотидных последовательностей кДНК оЪ мыши и человека выявило высокую гомологию их кодирующих областей (84% одинаковых остатков в аминокислотных последовательностях) и только 30% гомологии в протяженных З -некодирующих участках кДНК. Синтезируемый белок имел сигнальный пептид, который отщеплялся от белка и состоял из 21 п.о., а секретируемый продукт состоял из 146 п.о. и содержал дисульфидный мостик между цистеином в 117 положении и С-концевым остатком цистеина.
На основе методов рекомбинантных ДНК были созданы биотехнологические системы для синтеза активного белка оЪ в дрожжах и E.coli, что позволило нарабатывать секретируемый в кровь белок в количестве достаточном для изучения его биологических свойств, получения антисыворотки к белку оЪ и разработки методов его количественного определения в плазме (Funahashi Н., 2000, Banks W. А., 2004).
Схема гена ob. I, II, III - экзоны; заштрихована кодирующая область гена. Цифры сверху - нумерация нуклеотидных остатков в кДНК оЪ\ цифры снизу - аминокислотные остатки в пептиде Имеется; только один: ген оЪ у человека протяженностью? 20й тыс. пар оснований и локализуется он на хромосоме 7q31,3 (GenBank, BEAST); Еен содержит три экзона и два интрона. Первый интрон (10;6 тыс. то:)-располагается? в 5 -нетранслируемой области; зач 29 п.о. до стартового; кодона ATG. Второй интрош (-2,3 тыс.. п.о.) локализуется в кодоне остаткауОіп-49 Расшифрованы величина его молекулы (160кД) и; аминокислотный состав; изучено какой фрагмент полипептидной цепочки ингибирует потребление пищи: фрагмент 22-56 является активным фрагментом лептина; фрагмент 116-167 лишь незначительно ингибирует потребление пищи; пептид 57-92 не оказывает влияния на аппетит (Galbraith., 1981).
Поэтому у мышей, например, в результате альтернативного сплайсинга примерно 30% секретируемого продукта гена об не содержит остатка Gin в 49 положении. Кодон глутамина (ЄАС) располагается в: гене ob в 3 -акцепторном сайте сплайсинга и имеет акцепторную последовательность AG, поэтому он может попадать как в составе экзона, так ив интрон, и при трансляции двух разных мРНК синтезируются два белка ob, содержащие соответственно 146 или 145 п.о. 5 -фланкирующая энхансерная область гена ob состоит из 172 п.о. и содержит последовательность, подобную TATA (TATAGA), несколько cis-регуляторных элементов, включающих три последовательности GC типа (GGGCGC), место связывания факторов транскрипции АР-2 и ССААЕ последовательность — место связывания белка энхансера (Gong D. W., 1996).
Ген мыши ob кодирует транскрипт в 4.5 т.п.н. с высоко законсервированными последовательностями для 167 аминокислот открытой рамки считывания. Ген об мыши и человека локализован в 6 хромосоме. Ген состоит из 3 экзонов, разделенных двумя нитронами. Кодирующая область для Ob белка расположена в экзоне 2 и 3 (Hegyi К., 2004., Isse N., 1995).
Идентифицировано несколько регуляторных элементов; в промоторе ob, включая элементы отвечающие на цАМФ-И глюкокортикоид, ССАТТ/энхансер и SP-1 связывающий сайт. Сайт, отвечающий за адипозо-спецйфическую экспрессию и за регулируемую экспрессию в ответ на изменение запаса жира или баланса энергии, не идентифицирован. Продукт ob - секретируемый белок, обнаруживающий высокую гомологию у разных видов. Так, лептин человека на 84% идентичен мышиному и на 83% крысиному лептину (Kennes Y. М., 2001). Лептин синтезируется в основном, но не исключительно, белой жировой тканью и циркулирует в крови в виде 16-кДа белка. Имеется строгая позитивная корреляция между лептиновой мРНК и уровнем белка в адипозной ткани и уровнем циркулирующего лептина. Более того лептин содержит внутрицепочечные дисульфидные мостики, которые, по-видимому, необходимы для его биологической активности.
Структура гена лептина свиньи в настоящее время мало изучена. Ген ob свиньи локализован в 18ql3-q21(pnc. 1.4.5). Сравнительное исследование известных последовательностей ДНК показало высокое соответствие между свиным и человеческим лептином (93%), и свиным и мышиным (92%). Это указывает на то, что структурная часть (экзоны и интроны) гена ob очень консервативна. Ген рецептора лептина свиньи локализован в 6q33-q35 (GenBank, BLAST).
Секвенирование регуляторной области гена оЪ
Расчеты проводили с помощью метода молекулярной механики ММ+ с применением программы HyperChem ТМ 7.0 Molecular Modeling System фирмы Hypercude США. В этом методе полная энергия (Еполн) молекулярной системы представляется в виде суммы вкладов от растяжения химических связей (ER) и деформации валентных углов (EQ) относительно стандартных значений R0 и Q0, энергии торсионных взаимодействий (Еторс), энергии электростатических связей (Ее), ван-дер-ваальсовых (Евдв) взаимодействий между валентно несвязанными атомами и энергии водородных связей (ЕН).
Молекулярное моделирование - это эмпирический метод. Параметры силового поля выбирают таким образом, чтобы воспроизвести строение и свойства достаточно широкого класса органических веществ (Стручков В.А. и др., 2001).
С использованием молекулярной механики для фрагментов двойной спирали ДНК, для свободных жирных кислот, фосфолипидов, а также комплексов этих молекул (комплексов ДНК-лиганд) проведена полная оптимизация геометрии и определены значения энергии связи (Есвязн) лигандов с ДНК. Для ДНК взята В-форма без молекул воды, а для выполнения условия электронейтральности системы, добавлены-ионышатрия.
Энергия связи ДНК с лигандами определялась как разность полных энергий комплекса ДНК-лиганд и изолированных молекул. С учетом геометрических особенностей В-формы ДНК в рамках модели двойной спирали, молекулы лигандов были размещены в малой или большой бороздке, и, соответственно, оценивались энергии связи лигандов1 при комплексообразовании с малой или большой бороздкой ДНК. Во всех случаях для насыщенных частей углеводородных цепей лигандов была взята полностью заторможенная (шахматная) конформация.
Секвенирование ДНК проводили на праймерах, использованных на праймерах, использованных для амплификации, с применением набора ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Продукты реакции анализировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosistems, США).
Нуклеотидную последовательность промоторной области гена оЪ лептина нумеровали согласно последовательности GenBank: AF492499.2. Распознавание сайтов связывания транскрипционных факторов проводили с помощью программы TESS (Shug, 2008). Оценку частоты сочетаний ОНП проводили с использованием данных проекта Нартар, доступ к которым осуществляли через геномный браузер UCSC (http: //genome.ucsc.edu/) и базу данных dbSNP (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez).
Оценка фенотипа производилась по результатам регулярной бонитировки свиней на свинокомплексах Агрохолдинга «Талина». В расчет принимались такие параметры, как" вес животного, длина туши, сроки достижения 100 кг животного, толщина подкожного шпика, а также производительность хряков. Для проведения промеров пользовались специальными линейными таблицами, а при определении толщины шпика использовали универсальный шпикомер.
Расчет генного равновесия по закону Харди-Вайнберга, выполняли для определения, сохранено ли генное равновесие в данной популяции животных по исследованному локусу, или оно нарушено.
Соотношение фактических частот генотипов теоретически ожидаемым определяли по критерию х Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики и корреляционного анализа с применением программ Stat2, Fstat. Вычисляли среднюю арифметическую выборочной совокупности (М), ошибку средней арифметической (т). Достоверность различия определяли в каждой серии по отношению к исходному значению (р
Важнейшая проблема генетики сельскохозяйственных животных — формирование специализированных фенотипов, имеющих желаемые хозяйственно-полезные признаки. Актуальность данной проблемы- для свиноводства связана с селекцией животных мясного направления на высокое качество мяса с относительно низким уровнем жирности. Решение данной проблемы связано с развитием генетических технологий, используемых маркерной селекцией. Маркерная селекция широко применяется в развитых европейских странах, которые и являются лидерами в данной области исследования (Зиновьева Н. А., 2001, Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., 2005).
В тоже время, проблема формирования специализированных фенотипов свиней, несмотря на свою актуальность, остается малоизученной (Craig J. А., 2005).
В плане известных однонуклеотидных полиморфных маркеров свинья также остается крайне малоизученным объектом. В базе данных dbSNP на январь 2010г. имеется информация всего лишь о 8512 одноклеотидных полиморфизмах (ОНП) в геноме свиньи Sus scrofa, в то время как для крупного рогатого скота Bos tanrus их число составляет 2210641, для человека Homo sapiens (при сопоставимом размере генома) — 25003333. В 2009г. компания Illumina (США) выпустила в продажу биочип PorcineSNP60 для генотипирования 60 тыс. ОНП свиньи, однако подробная информация по ним пока не внесена в общедоступные базы данных (Ramos et al., 2009).
В этой связи особое значение имеет изучение структурно-функциональной организации генов - маркеров количественных признаков свиней. Биоинформатический подход позволяет получить значительный объем информации, которая может быть впоследствии проверена экспериментально. Для этих целей разработан целый пакет программ, имеющий особую важность при анализе и гомологии геномов высших животных (GenBank, BLAST).
Нами изучен ген лептина в связи с его значимостью в маркерной селекции и животноводствеВажнейшей задачей маркерной селекции является улучшение фенотипа пород сельскохозяйственных животных путем концентрирования в популяции желательных аллелей генов, способствующих проявлению хозяйственно-полезных признаков (Зиновьева Н. А., 2001., Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., 2005).
В связи с интенсивным развитием маркерной селекции значительный интерес представляют исследования проявления мутантных или аллельных вариантов гена в фенотипе сельскохозяйственных животных. Причем акцент делается на конкретные гены, участвующие в формировании определенного признака. Основная стратегия развития свиноводства связана с получением животных с мясом высокого качества и низким содержанием жира. В этой связи перспективными генами-кандидатами для оценки эффективности роста и жирности являются лептин и лептиновый рецептор (Silveira А. С, 1988).
Структура гена оЪ в настоящее время изучена не полно. Используя программу NCBI и BLAST, нами была определена нуклеотидная последовательность, размеры экзонов и интронов, а также промоторная область гена оЪ Sus scrofa, Homo sapiens, Mus musculus (рис. 3.1).
Изучение мутационной изменчивости гена оЪ
Наличие точковой мутации С3469Т в гене оЪ в гомозиготном состоянии (генотип СС) приводит к более глубоким изменениям в содержании суммарных фосфолипидов и этерифицированного холестерина. Очевидно, что перестройки в спектре липидов являются важной характеристикой фенотипа свиней, носителей точковой мутации С3469Т в гене оЬ.
Липидный обмен в организме находится под множественным регуляторным контролем со многими прямыми и обратными связями регуляции (Бутрова С. А., 2001). Поэтому изменение одного из компонентов данной системы, а в данном случае это касается важнейшего регулятора -гормона лептина, должно неизбежно вести к каскадным изменениям в спектре липидов клеток и тканей. А поскольку липиды играют важнейшую роль в организме и биоэнергетике, как структурно-функциональные компоненты клеток и их мембран, поставщики сигнальных и биологически активных молекул, то изменения в липидном компоненте могут приводить к серьезным функциональным нарушениям в организме.
Проведенные опыты по определению индекса окисленности липидов показали, что индекс окисленности диеновых коньюгатов для генотипа СС составляет 1,0, что на 59% и 69,7% превышает значения для животных с генотипами ТТ и ТС (рис. 3.18).
Малоновый диальдегид является вторичным продуктом процесса перекисного окисления липидов и обладает токсичным действием. Поэтому накопление малонового диальдегида является деструктивным фактором, приводящим к дестабилизации биологических процессов при различных заболеваниях. Определение малонового диальдегида проводили в кислой среде и при нагревании, где он реагирует с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием окрашенного комплекса, регистрируемого методами спектрофотометрии или спектрофлуориметрии.
Содержание малонового диальдегида (МДА) превышало контрольные показатели на 98,76 % у животных с генотипом ТС и на 272,67 % у животных с генотипом СС (табл. 3.12).
Измерение Ре2+-индуцированного уровня ТБК-активных продуктов показало, что в этих условиях отмечается увеличение их на 10,5 % у животных с генотипом ТС и на 59,6 % - с генотипом СС.
Полученные данные позволяют говорить об изначально высоком уровне вторичных, наиболее токсичных продуктов-перекисного окисления, липидов «у животных - носителей точковой мутации С3469Т в гене ob свиней.
В связи с тем, что липидный компонент крови обладает высокой информативностью и наглядностью по отношению к протекающим в организме процессам, динамика молекулярных изменений в составе липидов2 плазмы крови может служить одним из важнейших критериев оценки глубины метаболических перестроек, в том числе и о патологической направленности.
По-видимому, количественные изменения фондов основных липидов и высокий уровень пероксидации липидов свидетельствуют о нарушении регуляции липидного метаболизма в связи с наличием мутантого аллеля гена ob свиней.
Целью исследования являлось компьютерное моделирование взаимодействия липидов с промоторной областью гена ob свиньи, а также исследование взаимодействия липидов с ключевыми элементами промоторной области гена. В качестве таковых были выбраны сайты связывания с ТВР, sp2, С/ЕВР белками. При исследовании использованы следующие липиды: линолевая кислота, пальмитиновая кислота, арахидоновая кислота, холестерин, ТАГ (1- пальмитоил-2-линолеил-З-арахидонат).
При исследовании использован программный пакет HyperChem 7.0. Методом молекулярной механики Мт+ просчитан выигрыш энергии при образовании комплекса ДНК + липид. В ходе исследования ДНК представлялась устойчивой структурой, не меняющей свою структуру при взаимодействии с липидами. Е (конф) находилась как разница между полной энергией свободного липида и полной энергии липида в комплексе с ДНК. Результаты исследования представлены в таблице 3.13.
Можно предположить, что, имеется возможность взаимосвязи Е (конф) и Е(связи). Из полученных данных прослеживается достаточно четкое изменение Е (связи) от одного липида к другому в различных сайтах связывания.. Из рисунка 3.19 видно, что при взаимодействии липидов с большинством сайтов транскрипции минимальное значение Е(связи) характерно для связи холестерола с GC-2 сайтом, а максимальное для связывания линолиевои кислоты с GC-2 сайтом. Если же сравнить полученные данные со значениями Е (связи) из работы Дъячкова, то можно заметить, что максимальное значение Е (связи) характерно для связывания GC — 2 сайта с линолиевои кислотой (65.41). Исходя из сравнения полученных данных, с данными работы Дъячкова возможно предположить, что при уменьшении Е(конф), увеличивается Е(связи).
