Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Происхождение, биологические и породные особенности коз зааненской породы 12
1.2. Морфофункциональная характеристика молочной железы постнатального периода 23
1.2.1. Морфология молочной железы млекопитающих постнатального онтогенеза в зависимости от физиологического состояния организма 23
1.2.2. Гистогенез молочной железы млекопитающих 32
1.2.3.Васкуляризация и иннервация молочной желез млекопитающих 46
1.2.4.Лимфатическое русло молочной железы млекопитающих 59
2. Собственные исследования 67
2.1. Материал и методы исследования 67
2.2. Результаты собственных исследований 74
2.2.1. Морфологические показатели молочной железы коз зааненской породы постнатального онтогенеза 74
2.2.2. Закономерности васкуляризации молочной железы коз зааненской породы на этапах постнатального онтогенеза 83
2.2.3. Гистологические закономерности организации молочной железы коз зааненской породы на этапах постнатального онтогенеза 112
2.2.4. Ультраструктура молочной железы коз зааненской породы 131
2.2.5. Особенности морфологии выводной системы молочной железы коз зааненской породы на этапах постнатального онтогенеза 153
2.2.6. Закономерности звеньев гемомикроциркуляторного русла молочной железы коз зааненской породы 160
на этапах постнатального онтогенеза 160
3. Обсуждение полученных результатов 170
4. Выводы 217
5. Практические предложения 221
6. Литература 222
- Морфология молочной железы млекопитающих постнатального онтогенеза в зависимости от физиологического состояния организма
- Гистогенез молочной железы млекопитающих
- Морфологические показатели молочной железы коз зааненской породы постнатального онтогенеза
- Особенности морфологии выводной системы молочной железы коз зааненской породы на этапах постнатального онтогенеза
Морфология молочной железы млекопитающих постнатального онтогенеза в зависимости от физиологического состояния организма
Впервые полученные данные об онтогенетических морфофункциональных закономерностях васкуляризации и становления структурных элементов молочной железы коз зааненской породы в период от новорожденности до взрослого состояния значительно расширяют и дополняют сведения по породной, возрастной и сравнительной морфологии у представителей жвачных при: - акушерско-гинекологической и хирургической практике, выявлении причин нарушения функционирования данного органа и организации мероприятий по профилактике болезней молочной железы; - изучении сравнительной, видовой, породной и возрастной морфофизиологии и патоморфологии молочной железы животных; - постановке опытов по исследованию физиологии процесса лактации; - научных изысканиях в лабораториях НИИ по изучению особенностей становления молочной железы у млекопитающих; - чтении лекций, проведении лабораторных практикумов, написании учебников, учебных пособий и справочных руководств по морфологии.
Методология и методы исследований. Для изучения особенностей строения молочной железы коз зааненской породы осуществлен комплекс мероприятий, включающий в себя различные методы исследования: макроморфометрические, микроморфометрические, гистологические, вазорентгенографические, электронномикроскопические исследования, тонкое анатомическое препарирование под контролем стереоскопического микроскопа МБС-10, изготовление коррозионных препаратов с использованием безусадочных пластических масс акрилового ряда и просветленных препаратов по методике Горчакова В.Н. (1997) в модификации Зеленевского Н.В., Щипакина М.В. (2012) с инъецированием сосудов черной сажей на скипидаре живичном с добавлением эфира. Внедрение результатов исследований. Материалы диссертации вошли в учебные и методические пособия: - «Анатомия животных», допущенное Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111801 «Ветеринария» (Санкт Петербург, 2014);
«Практикум по ветеринарной анатомии. Том 1. Соматические системы», допущенное Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111801 «Ветеринария», где соискатель является соавтором (Санкт-Петербург, 2014); - «Онтогенетические морфофункциональные закономерности васкуляризации и становления структурных элементов молочной железы козы зааненской породы», допущенное Методическим советом СПбГАВМ в качестве методических указаний для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111801 «Ветеринария», допущенное ГНУ Северо-Западным региональным научным центром Россельхозакадемии в качестве методических указаний для ветеринарных специалистов, научных работников, преподавателей и студентов с целью использования в практике ветеринарной медицины Северо-Западного региона РФ (Санкт-Петербург, 2014); - «Миология и дерматология», допущенное Методическим советом СПбГАВМ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111801 «Ветеринария» (Санкт Петербург, 2013). Учебные пособия изданы массовым тиражом и используются в образовательном процессе ряда сельскохозяйственных и ветеринарных вузов России.
Получены уникальные данные по онтогенезу вымени козы, используются в научно-исследовательской работе и учебном процессе ряда вузов России: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины, Вятская государственная сельскохозяйственная академия, Казанская государственная академия ветеринарной медицины Н.Э. Баумана, Ивановская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.К. Беляева, Государственный аграрный университет Северного Зауралья, Дагестанский государственный аграрный университет имени М.М. Джамбулатова, Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина, Ставропольский государственный аграрный университет, Мордовский государственный универститет имени Н.П. Огарева, Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова, Национальный открытый институт России г. Санкт-Петербург.
Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации доложены на симпозиумах, семинарах и конференциях различных уровней, включая международные, где получили признание и одобрение ведущих отечественных и зарубежных морфологов.
Материалы IV международного симпозиума «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» посвященного 200-летию ветеринарного образования в России и 70-летию кафедры кормления животных СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2008);
Материалы научно-производственной конференции, посвященной 25-летию кафедры частной зоотехнии, технологии производства и переработки продукции животноводства Брянской ГСХА «Селекционно-технологические аспекты повышения продуктивности сельскохозяйственных животных в современных условиях аграрного производства» (Брянск, 2008);
Гистогенез молочной железы млекопитающих
Макроморфометрическое исследование начинали с определения массы тела, массы молочной железы, а также ее глубины и объема. Производили промеры длины и диаметра сосков и расстояние между ними. Тонкому анатомическому препарированию подвергали свежие и замороженные молочные железы коз зааненской породы, полученные от убитых животных. Применяли сагиттальный разрез от верхушки до основания вымени с последующим препарированием молочных протоков (Андреева З.П., 1965; Чумаченко П.А., 1991). Линейные параметры молочной железы определяли с помощью электронного штангенциркуля модели «Тamo professional» со шкалой деления 0,05 мм производства США.
Материалом для микроморфометрического исследования являлись небольшие (2-4 мм) образцы нелактирующей молочной железы козы и образцы молочной железы козы в состоянии активной лактации. В обоих случаях для исследования были взяты образцы из сосковой области и фрагменты более глубоких областей паренхимы молочной железы. Материал был отобран и зафиксирован непосредственно после убоя животных. Отобранные образцы молочной железы были зафиксированы в 2,5%-м растворе глутарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере в течение 1часа при комнатной температуре, после чего промыты в 3-х сменах фосфатного буфера. Далее была выполнена пост-фиксация образцов в 1%-м растворе тетроксида осмия на том же буфере, при той же температуре в течение 1часа. После фиксации объекты были обезвожены в серии растворов этанола возрастающей концентрации (30%, 50%, 70%, 96%, 100%), пропитаны ацетоном и заключены в эпоксидную смолу Эпон (по Б. Уикли, 1975).
Для гистологического исследования с использованием светового микроскопа на ультрамикротоме Leica UC7 были получены полутонкие срезы изучаемых объектов толщиной 1,0-1,5 мкм. Срезы были окрашены толлуидиновым синим и исследованы в световом микроскопе Leica DM2500, снабжённом цифровой камерой Leica DFC290. Для электронно-микроскопического исследования на ультрамикротоме
Leica UC7 получены ультратонкие срезы толщиной 50-70 нм. Срезы собраны на медные сетки для электронной микроскопии. Сетки со срезами контрастировали в спиртовом растворе уранил-ацетата и водном растворе цитрата свинца. Электронно-микроскопическое исследование срезов выполнено в микроскопе JEOL JEM 1011. Электронные микрофотографии были получены с использованием камеры Morada (Digital Imaging Solutions Inc.). Важнейшим достоинством и преимуществом электронной микроскопии перед световой микроскопией является ее высокое разрешение, позволяющие наблюдать объекты размером до десятых долей нанометра, то есть объекты в несколько тысяч раз меньше, чем те, что различимы в световом микроскопе. Электронная микроскопия играет важную роль при выяснении ультраструктуры и функциональных особенностей тканей, клеток и субклеточных структур организма (Коржевский Д.Э., 2013). Источники кровоснабжения, а также пути основного и коллатерального оттока крови от органов и тканей молочной железы коз зааненской породы изучали методом заполнения сосудов затвердевающими и pентгеноконтpастными массами. Перед заполнением сосудистого русла трупный материал разогревали в водяной бане при температуре не выше 500 C. После разогревания, проводили промывку сосудистого русла гипертоническим физиологическим раствором до полного исчезновения сгустков крови из вскрытых вен. Артериальное сосудистое русло заполнялось через брюшную аорту. Одновременно заполнялась, как правило, и венозная система, благодаря наличию многочисленных межсистемных теpмино-теpминальных анастомозов между экстpа- и интpамуpальными артериями и венами.
Pентгеноконтpастную массу для инъекций готовили по пpописи Чумакова В.Ю. в модификации Зеленевского Н.В. (2012): в равных частях свинцовый сурик, вазелиновое масло, скипидаp+эфиp+этиловый спирт. Недостатком этой массы является то, что она очень быстро расслаивается, и потому ее необходимо постоянно размешивать, используя электромешалку. Необходимо отметить, что эта масса плохо проникает в экстpа- и интpамуpальное pусло, включая звенья гемомикpоциpкуляции из-за крупных частиц свинцового сурика. Технические условия съёмки на pентгеновском аппарате для массы Гауха: напряжение на трубке 80 кВ, сила тока - 15 мА, фокусное расстояние – 55 см, экспозиция 3-8 - секунд. Технические условия для массы К.И. Кульчицкого и дp. (1983): сила тока – 5-10 мА, напряжение в трубке - 25 кВ, фокусное расстояние – 45-50 см, экспозиция - до 2-3 секунды. Хорошие результаты получены нами при инъекции сосудов массой, предложенной К.И. Кульчицким и дp. (1983): сурик железный - 15 %, глицерин 40-60 %, спирт этиловый+этиловый эфир - до 100%. Поскольку частицы этой массы имеют диаметр, близкий к размерам эритроцита, то она заполняет венулы и артериолы вплоть до капилляpов. Масса не расслаивается в течение нескольких часов. Pентгеногpафия производилась аппаратом Definium 5000.
Также применяли рентгеноконтрастную массу для инъекций по прописи Щипакина М.В., Прусакова А.В., Былинской Д.С., Куга С.А. (2013): первоначально брали массу свинцовых белил - 45%, соединяли ее с 45% живичного скипидара и 10% порошка медицинского гипса. Порошок медицинского гипса вводили тонкой струей в полученный состав. Порошок медицинского гипса предварительно просеивали через сито, а полученную массу интенсивно перемешивали в течение 20-30 мин. до получения взвеси гомогенной консистенции с вязкостью, аналогичной плазме крови. Полученный состав необходимо использовать немедленно. Для использования полученного состава набирали его в шприц и вводили через канюлю в артериальное русло молочной железы.
После наливки объект исследования помещали в 10% раствор формальдегида на 5-7 суток для наилучшего проникновения взвеси в ее терминальное кровеносное русло. После фиксации формальдегидом молочные железы подвергали рентгенографии. В результате получили снимки вазорентгенограмм.
Положительный эффект заключается в том, что масса легко проникает в кровеносные сосуды, вплоть до терминального русла, а при рентгеновской съемке на полученных вазорентгенограммах тень сосудов яркая, четкая, контрастная. При исследовании молочной железы инъекционная масса не вытекает из поврежденных кровеносных сосудов и не «загрязняет» объект исследования.
В некоторых случаях мы использовали комбинированный способ инъекции - артериальное русло заполняли массой Чумакова В.Ю., а венозное - массой К.И. Кульчицкого в модификации Зеленевского Н.В. В результате на одной рентгенограмме можно легко дифференцировать сосуды артериального и венозного русла, так как молекулярная масса железного сурика ( 160) почти в 5 раз меньше такого же показателя для свинцового и, следовательно, в меньшей степени поглощает рентгеновские лучи. Технические условия рентгенографии: сила тока - 50 мА, напряжение на трубке - 35 кВ, фокусное расстояние - до 50-60 см, экспозиция - до 1,5-3,0 сек.
Морфологические показатели молочной железы коз зааненской породы постнатального онтогенеза
Ультраструктурные исследования показали, что секреторный эпителий молочных альвеол в паренхиме нелактирующей молочной железы коз зааненской породы в основном (на 75-80% клеточного состава) образован лактоцитами призматической формы, ядра которых располагаются в 2-3 неравномерных ряда. Крупные ядра лактоцитов имеют преимущественно овальную форму шириной 4-5 мкм и высотой 7-8 мкм, иногда с инвагинациями ядерной оболочки. В ядрах обнаруживается хорошо различимое округлое электронно-плотное ядрышко диаметром около 1 мкм. Ультрамикроскопически ядрышко образовано специализированными участками хромосом, называемыми ядрышковыми организаторами. В этих участках находятся гены, кодирующие синтез рибосомальных РНК. При электронной микроскопии в составе ядрышка различают три зоны – слабоокрашенную зону, которая содержит ДНК из области ядрышкового организатора хромосом; гранулярную зону, которая содержит предшественников зрелых субъединиц рибосом; плотную нитчатую зону, которая содержит множество тонких рибонуклеопротеиновых фибрилл, они представляют РНК-транскрипты.
Апикальная поверхность лактоцитов формирует небольшие микроворсинки высотой около 0,5 мкм, они свидетельствуют о реабсорбционной способности эпителия. Внутри каждой микроворсинки расположен пучок активных микрофиламентов в количестве 25. Одним полюсом филаменты закрепляются к вершине микроворсинки, другим полюсом связываются в пучок спектриноподобным белком и проникает в субапикальную часть цитоплазмы, вплетенную в кортекс. В состав микроворсинок входит сократительный белок минимиозин, который способен выполнять сократительную функцию. Лактоциты соединены друг с другом комплексом межклеточных контактов, включающим в себя плотные контакты, промежуточные контакты и десмосомы.
Базолатеральные мембраны соседних лактоцитов формируют многочисленные пальцевидные выпячивания – интердигитации. Базальная поверхность альвеолярного эпителия выстлана непрерывной электронно-плотной базальной мембраной.
Цитоплазма лактоцитов имеет достаточно высокую электронную плотность. В целом, цитоплазма выглядит «зернистой» за счёт большого количества содержащихся в ней рибосом. При ультрамикроскопическом исследовании рибосомы выглядят в виде осмиофильных черных точек, а их рабочие комплексы (полисомы), как объединенные группы осмиофильных точек.
В цитоплазме обнаруживаются также округлые или слегка удлиненные митохондрии, которые обладают уникальной способностью использовать кислород в ходе катаболизма, в них резко усиливается способность к образованию химической энергии, в результате чего возникает клеточное дыхание. Размер и функциональная активность митохондрии меняется в зависимости от внешних воздействий и физиологических процессов молочной железы. Размер митохондрий в среднем составляет 1,5-2,5 мкм.
Помимо, митохондрий в цитоплазме обнаруживаются цистерны шероховатой эндоплазматической сети, которая на ультратонких срезах представлена мембранными канальцами и цистернами взаимосвязанными между собой; а также элементы аппарата Гольджи. При электронной микроскопии видно, что аппарат Гольджи состоит из скоплений плоских цистерн количеством в среднем около пяти-семи пакетов, которые называют диктиосомами. Таких скоплений в клетке несколько, цистерны плотно прилегают друг к другу, расстояние колеблется 18-23 нм. Каждая цистерна немного изогнута и имеет выпуклую и вогнутую поверхности. Просвет, расположенный между ними небольшой в центральной части, по периферии цистерны обнаружены расширения в виде ампул, непостоянного размера. Также в комплексе Гольджи наблюдается большое количество мелких пузырьков, расположенных, как правило, по краям органеллы. Между
Ультраструктура капилляра паренхимы нелактирующей молочной железы козы зааненской породы40000 Э – эритроцит; ЯЭД – ядро эндотелиоцита; КВ – коллагеновые волокна
Ультраструктура капилляра паренхимы нелактирующей молочной железы козы зааненской породы40000 Э – эритроцит; ЯЭД – ядро эндотелиоцита; КВ – коллагеновые волокна; ПК – плотный контакт; БМ – базальная мембрана; В – вакуоль
Ультраструктура фенестра капилляра нелактирующей молочной железы козы зааненской породы45000 КВ – коллагеновые волокна; ШЭПР – шероховатый эндоплазматический ретикулум; Ф – фенестра (окно) 137 цистернами располагается белковый матрикс. Основными функциями аппарата Гольджи является перемещение веществ в цитоплазму и внеклеточную среду, а также синтез жиров и углеводов, принимает участие в росте и обновлении плазматической мембраны и в формировании лизосом. Хорошо развиты цитоскелетные элементы, в особенности пучки промежуточных филаментов, ассоциированные с промежуточными контактами.
В апикальной области цитоплазмы выявляется электронно-плотный центр организации микротрубочек, которые представляют собой полые цилиндры, имеющие диаметр от 20-23 нм. Они являются наиболее динамичным элементом цитоскелета. Микротрубочки образованы глобулярными белками – тубулинами, которые объединяются в цепочки и образуют спираль. Микротрубочки формируют центриоли, основу которых образуют девять триплетов, организованных по окружности и формирующий полый цилиндр. Калибр цилиндра в среднем составляет 0,13±0,01 мкм, длина 0,45±0,04 мкм. Микротрубочки плотно прилегают друг к другу. В состав центриоли также входят поперечные белковые мостики, которые связывают микротрубочки.
В целом, цитоплазма лактоцитов нелактирующей молочной железы имеет хорошо развитый аппарат белкового синтеза, но находится он в состоянии относительного функционального покоя.
Помимо секретирующих клеток – лактоцитов, в эпителии альвеол нелактирующей молочной железы присутствуют также два других типа клеток – недифференцированные камбиальные клетки и миоэпителиальные клетки. Оба эти типа клеток не выходят на апикальную поверхность эпителиального слоя, располагаясь в базальной области эпителия.
Особенности морфологии выводной системы молочной железы коз зааненской породы на этапах постнатального онтогенеза
Для сопоставления полученных нами данных и имеющихся литературных сведений по строению молочной железы животных, мы сочли возможным привести данные, полученные в последнее время отечественными морфологами. Так, из исследований Сизовой О.О. (2006) следует, что у коров молочного типа железа характеризуется хорошо развитой деятельной железистой тканью (82,6+0,3%) при незначительном количестве соединительной — 17,4±0,3%. Коэффициент соотношения тканей 4,7:1,0. Паренхима расположена равномерно и заполняет наибольшую площадь в молочной железе. Соединительно-тканные компоненты развиты слабо. В железистом аппарате выявлены, в основном, функционирующие дольки, диаметром 1364,7±30,9 мкм, и не всегда заметные «отдыхающие», что связано с периодичностью их функционирования.
Наши исследования согласуются с выше приведёнными данными о наличии в функционирующей молочной железе так называемых «отдыхающих долек».
По данным Сизовой О.О. (2006) в функционирующих дольках молочной железы коровы наблюдаются крупные, средние и мелкие альвеолы, которые находятся на разных стадиях секреции: одни — переполнены секретом, другие — в спавшемся состоянии. Между ними проходят тончайшие межальвеолярные прослойки соединительной ткани (5,2+0,3 мкм). Средний объем альвеолы составляет 170,4 х 104,0 мкм3. Стенки альвеол состоят из однорядного секреторного эпителия, миоэпителиальных клеток и базальной мембраны. При незаполненной полости клетки имеют цилиндрическую форму. Когда полость альвеолы заполняется, клетки уплощаются, растягиваются, принимая кубическую форму. Количество клеток в альвеоле 30—100. Цилиндрические клетки апикальным полюсом вдаются в просвет альвеол и имеют высоту 12,85+0,27 мкм.
Эти данные подтверждают полученные нами ультраструктурные сведения о том, что на протяжении цикла секреции молока (от накопления секрета – до выделения в просвет альвеолы) лактоциты козы зааненской породы значительно изменяют свою форму от призматической до кубической. Нам видится показательным провести анализ интенсивности морфодинамики тканей молочной железы коз зааненской породы на протяжении этапов онтогенеза. Так, к пяти-семи месяцам постнатального онтогенеза количество железистой ткани увеличивается в 4,40 раза, а у взрослых животных - ещё в 1,17 раза. Таким образом, за весь период наблюдения количество железистой ткани увеличивается в 5,13 раза. За этот же период времени количество жировой ткани в молочной железе уменьшается в 1,91 раза, а собственно соединительной – в 1,12 раза. При этом общее количество соединительной ткани уменьшается в 1,57 раза.
Таким образом, на фоне интенсивного увеличения с возрастом в молочной железе коз зааненской породы железистой ткани, в ней уменьшается количество соединительной ткани – в основном за счёт жировой.
Полученные нами сведения о породных гистологических и цитологических особенностях строения молочной железы млекопитающих подтверждаются исследованиями последних лет, проведёнными Сизовой О.О. (2006). Согласно её выводам у коров молочного и мясомолочного типов морфометрические параметры молочной железы достоверно разнятся. Так, по данным этого исследователя у коров молочно-мясного типа железистой ткани на 13,1% меньше, чем у коров молочного типа. На гистологических препаратах обращает на себя внимание сильное развитие соединительной ткани (28,2±0,9%), поэтому соотношение паренхимы и стромы уменьшается почти в два раза и составляет 2,5:1,0. Жировых клеток в соединительной ткани не наблюдается. Паренхима в железе располагается неравномерно, что связано с более значительными прорастаниями соединительной ткани между основными структурными компонентами железистой ткани. Большая часть секреторного аппарата состоит из функционально активных долек, их параметры на 22,8% меньше, чем у коров молочного направления продуктивности. Так называемые «отдыхающие дольки» в паренхиме молочной железы коров молочно-мясного типа встречаются чаще, чем у сверстниц молочного типа. Они представлены мелкими альвеолами, диаметром от 50,0 до 68,8 мкм. Функционирующие дольки паренхимы заполнены альвеолами диаметром 106,3± 1,9 мкм, что на 29,5% меньше. Объем альвеол уменьшается в 2,9 раза, а междольковые соединительнотканные перегородки утолщаются на 20,7%, по сравнению с коровами молочного типа. В функционирующих дольках имеются закрытые (отдыхающие) альвеолы, которые не обнаружены в паренхиме железы коров молочного типа. Стенки альвеол в 86% случаев выстланы кубическим, а в 14% - цилиндрическим эпителием. Количество клеток в альвеоле варьирует от 18 до 60. Высота кубических клеток составляет 7,50+0,21 мкм.
Наши исследования согласуются с выводами ряда морфологов-маммологов. Так, Тарнавич Г.Н., Овчинникова Р.Е. (1985) при исследованиях морфологии дольки молочной железы у коров и свиней установили, что появление первых молочных долек у крупного рогатого скота наблюдается в девятимесячном возрасте плодного периода онтогенеза, а у свиней - в двухмесячном возрасте постанатального периода. Причем дольки заметны, только у отдельных протоков и, главным образом, в непосредственной близости от молочной цистерны. Количество долек подвержено индивидуальным колебаниям. Оно различно и у разных зачатков в одной и той же молочной железе. Молочные дольки в этот период представляют собой небольшие, овальной формы выступы стенок молочных протоков. Дольки располагаются чаще парами, почти на одном уровне. В них заметны зачатки будущих альвеолярных трубочек.
