Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Происхождение домашней овцы 7
1.2. Характеристика исследуемых пород овец 8
1.2.1. Тонкорунные овцы 8
1.2.2. Грубошерстные овцы 14
1.3. ДНК - диагностика сельскохозяйственных животных 17
1.4. Использование групп крови в селекции овец 19
1.5. Генетические маркеры 28
1.6. ДНК - микросателлиты в характеристике пород овец 30
2. Материал и методика исследований 39
2.1 Объекты исследования 39
2.2. Методика исследования 42
2.2.1. Иммуногенетический метод исследования 42
2.2.2. Микросателлитный метод исследования 45
3. Результаты исследований 47
3.1. Анализ состояния овцеводческой отрасли Калмыкии 47
3.2. Продуктивность овец 51
3.3. Продуктивность экспериментального поголовья 54
3.4. Группы крови овец, разводимых в Калмыкии: их сходство и различия
3.4.1. Частота встречаемости антигенов 63
3.4.2. Генетические расстояния 74
3.4.3. Связь групп крови с продуктивностью у овец 77
3.5. ДНК - микросателлиты овец, разводимых в Калмыкии: их сходство и различия
3.6. Экономическая эффективность содержания овец 89
4. Обсуждение результатов исследований 91
Выводы 99
Предложения производству 101
Список использованной литературы
- Характеристика исследуемых пород овец
- ДНК - диагностика сельскохозяйственных животных
- Иммуногенетический метод исследования
- Группы крови овец, разводимых в Калмыкии: их сходство и различия
Введение к работе
Актуальность исследований. Калмыкия - сельскохозяйственный регион России. Основной отраслью животноводства в Калмыкии традиционно считалось овцеводство. Так, 1989 году поголовье овец в Калмыкии составляло 3,44 млн. Однако экономический кризис последнего десятилетия прошлого века привел к резкому падению численности сельскохозяйственных пород животных в стране. Данная тенденция затронула Калмыкию в большей степени, чем другие регионы. Так, за указанный период поголовье овец в России сократилось в три раза, тогда как в Калмыкии - более чем в восемь раз. К концу 2000 года численность овец в республике составляла 420 тысяч голов.
В условиях сокращения поголовья велика вероятность элиминации ценных генотипов и утери своеобразия отечественных пород (Ю.А. Столповский, 1997). Метод генетической паспортизации животных позволяет объективно оценить изменения, произошедшие в породе, и ответить на вопрос: сохранилась ли ее генетическая структура или от нее осталось только название (Н.С. Марзанов, Ю.В. Саморуков, 2002). Проблема сохранения, обогащения, рационального использования генофонда всегда актуальна и требует решения многих задач. Одной из них является разработка методов более полной реализации генетического потенциала продуктивности с привлечением методов иммуногенетического анализа и ПЦР - анализа (Г. Брем, 1995, Е.А. Гладырь, 2004, Н.А. Зиновьева, 2002, 2003, Л.К. Эрнст, 2008). В связи с тем, что в Калмыкии после значительного спада поголовья овец начинается медленный рост их численности, требуется более продуманный, основанный на современных технологиях подход к восстановлению поголовья. Традиционная, зоотехническая оценка должна быть дополнена системой генетического контроля. Достаточно информативными являются полиморфные системы, к которым относятся группы крови и ДНК - микросателлиты.
5 Цели и задачи исследований. Целью наших исследований было изучение биологических особенностей овец, разводимых в Калмыкии, выявление маркеров продуктивности, определение филогенетических связей между породами. При этом ставились задачи:
- дать характеристику основных пород овец, разводимых в Калмыкии;
- провести сравнительный анализ биологических и продуктивных
особенностей овец в межпородном аспекте;
выявить зависимость продуктивности от групп крови;
провести исследование ДНК-микросателлитам;
- провести сравнительный анализ генетических отношений между
породами с учетом групп крови и ДНК-микросателлитов.
Научная новизна работы. Впервые:
- проведена комплексная оценка биологических и продуктивных
качеств разных пород овец, разводимых в Калмыкии;
- выявлены предпочтительные эритроцитарные антигены, связанные с
живой массой и настригом шерсти для каждой породы;
проведена сравнительная характеристика тонкорунных пород овец Калмыкии и Ставропольского края по группам крови;
определены ДНК - микросателлиты различных пород овец;
- выявлены филогенетические связи между породами овец Калмыкии
по группам крови и ДНК-микросателлитам.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. Материалы исследований расширяют характеристику пород овец Калмыкии генетическими параметрами (группы крови, ДНК-микросателлиты). Использование овец для скрещивания, имеющих предпочтительные генотипы, сопряженные с мясной и шерстной продуктивностью, позволяет повысить эффективность разведения овцеводства.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры общей и частной зоотехнии Калмыцкого госуниверситета
в 2005 г.; на Российской научной конференции «Буддийская культура и мировая цивилизация», Элиста, 2003 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Наука - XXI веку», Майкоп, 2003 г.; Международной научной конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов», Элиста, 2004 г.; Международной школа-конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2005 г.; Международной научной конференции «Международная научная конференция. Перспективы развития животноводства в аридной зоне Казахстана», Алматы, Бастау, 2005 г.; Межрегиональной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
особенности генетических структур (группы крови, ДНК-микросателлиты) овец, разводимых в Калмыкии;
дифференциация пород овец, разводимых в Калмыкии, с учетом генетических дистанций;
- роль генетических маркеров (групп крови) в селекции овец.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации
опубликовано 8 статей.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и рекомендации по использованию научных выводов. Содержание работы изложено на 123 листах компьютерного текста. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 203 наименований, в том числе 65 на иностранных языках.
Характеристика исследуемых пород овец
Происхождение тонкошерстных генотипов овец, которых в настоящее время называют мериносами, ни по историческим, ни по научным данным, установить нельзя. Сейчас можно утверждать, что овцы, обладавшие определенными общими признаками, характерными для тонкорунного типа, существовали на ранних стадиях цивилизации в различных странах Средиземноморья и, благодаря селекции, получили дальнейшее развитие. Тонкая шерсть могла стать объектом селекции только при определенном уровне развития культуры и ткацкого ремесла, так как в условиях лишь такого климата, при котором появляется необходимость в теплой и легкой одежде из тонкой ткани, могла родиться идея разводить овец для получения тонкой шерсти (Л.Г. Моисейкина, 2000).
Название тонкорунных овец «меринос» имеет два толкования. Одно связано с названием племени мавров «бени меринос», другое происходит от испанского прилагательного «мерино», переводящегося как «странствующий от пастбища к пастбищу».
Очень долго Испания была монополистом мериносовых овец и продавала только шерсть. С XVIII века мериносовые овцы начали распространяться по всему миру. В 1723 г впервые мериносы были завезены в Швецию, в последующие 100 лет уже вся Европе имела испанских мериносов. Начался их завоз в Америку из Англии, Германии и Франции. С начала XX века на мировом рынке шерсти было признано превосходство австралийского мериноса, который был получен от завозимых из Англии мериносов с тонкой шерстью и длинношерстных линкольнов и лейстеров.
В начале XIX века французские и немецкие переселенцы привезли на Юг России около 100 тыс. мериносовых овец, которые положили начало тонкорунному овцеводству (И.Н. Чернопятов, 1883, М.Е. Лобашев, 1954).
Поголовье мериносов в России в 1882 г достигло 15 млн. голов. Быстрый рост численности мериносов был связан с наличием свободных продуктивных пастбищ и широким проведением скрещивания с местными овцами и, прежде всего, с цигайскими. Этому способствовала работа овцеводов И.А. Мерцалова (русский инфантадо), автора камвольной черноморской породы овец (мазаевской) П.Д. Мазаева, П.Н. Кулешова (новокавказский меринос). На Ростовские земли овец начали ввозить в XIX веке. Вначале это были небольшие партии «гишпанских» (или «шленских») овец (1822г), завезенных переселенцами из Таврической губернии, а с 1870 года наблюдается интенсивное развитие овцеводства. Из Донской области мериносовые овцы распространились в районы реки Кубань, западные районы Ставропольской губернии, во второй половине XIX века - на Кавказ (В. Аликов, 1914). Однако по ряду объективных и субъективных причин і поголовье стало сокращаться. Так, в 1896 и 1902 гг оно уменьшилось до 5,3 и 4,8 млн. голов соответственно. Накануне первой мировой войны овец оставалось 2,1 млн. гол. Революция, гражданская война, разруха довершили этот процесс, и к 1923 г мериносов в России насчитывалось всего лишь 340 тыс. голов (Н.А. Новикова, 1973).
В Постановлении Наркомзема СССР от 21 января. 1932 г было положено начало восстановлению тонкорунного овцеводства в Советском Союзе. Широкомасштабную метизацию было намечено провести в самые сжатые сроки. Уже в 1933 г было запланировано поставить под метизацию 8 млн. грубошерстных маток. В 1935 г количество метисов в России достигало 5 млн. голов.
В 1980 году в СССР насчитывалось 23 тонкорунные породы общей численностью 138 млн. голов (А. Вениаминов, 1984).
Грозненская порода одна из наиболее ценных тонкорунных пород шерстного направления продуктивности.
Грозненская порода овец создавалась в период с 1928 по 1951г.г. в южной части Терско-Кумской равнины в совхозе «Червленые буруны» Дагестанской АССР. Задолго до этого в этой местности разводили ногайских курдючных овец, которые были вытеснены мериносами мазаевского и новокавказского типов и их помесями с грубошерстными овцами. Мериносы были завезены из Таврической губернии и в 1913 году составляли 30% всего поголовья овец Кизлярского округа. Это были некрупные животных с живой массой 32 - 40 кг, дававшие 4,0 - 4,8 кг довольно длинной, крепкой, очень жиропотной шерсти.
После Революции в зоне Ногайской степи сохранились мериносы с длиной шерсти 6 - 8 см. Лучшее поголовье Ачикулакской племенной овчарни к 1929 году имело настриг 5 - 6 кг у баранов-производителей, при выходе 27%.
В 1929 году в «Червленые буруны» завезли 5003 чистопородных австралийских мериносов, в том числе, 145 баранов. Овцы были завезены из лучших стад Австралии и представляли тип пеппин, выход мытой шерсти составлял 45 - 48%. На 1 кг живой массы приходилось 70 г мытой шерсти (Г. Литовченко, П. Есаулов, 1969).
ДНК - диагностика сельскохозяйственных животных
Развитие животноводства на современном этапе невозможно без внедрения новых биотехнологических методов оценки признаков продуктивности сельскохозяйственных животных, базирующихся на анализе наследственной информации.
Различия в уровне продуктивности отдельных животных, линиями, породами обусловлены, с одной стороны, средовыми (факторы внешней среды), с другой стороны, генетическими факторами. Большинство хозяйственно полезных признаков сельскохозяйственных животных относится к полигенным признакам, то есть их количественный уровень генетически определяется целом рядом генов (локусов), разбросанных по всему геному. Такие локусы получили название локусов количественных признаков QTL (Quantitative Trait Loci s).
Традиционная селекция животных базируется на фенотипическом проявлении признаков (мясная продуктивность, скорость роста, плодовитость и т.д.). Поскольку, на проявление признака оказывают влияние как генетические, так и средовые факторы, истинный генетический потенциал животных может быть занижен.
Использование в селекции методов анализа непосредственно QTL или сцепленных с нами , генов имеет ряд приимущств перед традиционными методами селекции. Так как такая селекция основана непосредственно на анализе генотипа, она не учитывает изменчивость хозяйственно полезных признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным селекцию в раннем возрасте, независимо от пола животных, и, в конечном итоге, повышает эффективность селекции. Селекция по генотипу способствует идентицикации и быстрому введению предпочтительных аллелей из ресурсных популяций в популяции реципиентов с целью повышения продуктивности и устойчивочти к заболеваниям улучшаемых пород животных. Оценка животных по связанным с QTL генетическими маркерами особенно важна для таких признаков, которые фенотипически выявляются относительно поздно или только у животных одного пола (например, плодовитость), а так же для тех признаков, на уровень проявления которых значительное влияние оказывают внешние факторы (Е.А. Гладырь 2004, Н.А. Зиновьева и др. 1998, М. Сингер 1985).
Селекция, основанная на анализе непосредственно QTL и сцепленных с ними генов, получила название маркер-зависимой селекции. Исследование в животноводстве маркер-зависимой селекции открывает возможности дальнейшего усиления эффекта селекции, в первую очередь за свет повышения точночти оценки потенциала животных. Прежде чем внедрить в животноводство маркер-зависимую селекцию, необходимо решение двух основных задач: - локализация и идентификация QTL; - исследование эффективности использования этих QTL в селекции. Для решения этих задач нашли применение два метода анализа: - использование полиморфных белковых систем; - использование генетических маркеров.
С середины 20 века ученые всего мира: Evans, Turner, Stansfield, Cauvin характеризовали породы по биохимическому полиморфизму белковых систем, были предприняты попытки связать хозяйственно-полезные признаки с полиморфными системами крови и молока. Первыми маркерами, используемыми в селекции, были маркирующие белковые системы крови.
Существуют определенные системы эритроцитарных групп, которые называются группами крови. Группы крови, применяются потому, что не изменяются в процессе онтогенеза и являются пожизненной генетической характеристикой каждой особи. Антигены имеют различную специфичность: видовую, групповую и функциональную (Т.П. Афанасьева, 2007, Т.А. Лашкина и др. 2002, 2004, Б. Льюин, 1987).
В эритроцитах антигены можно определять практически сразу после рождения (кроме антигенов R, О, Ма), которые формируются соответственно на 20, 31 и 45 день после рождения. Групповые антигены хорошо выявляются при внутрипородной или межпородной изоиммунизации овец, когда донор и реципиент принадлежат к одному виду. При этом образуются не видовые гетероантитела, а только групповые изо- или аллоантитела. Антиген может наследоваться отдельно от других антигенов, проявляя доминантный или кодоминантный тип наследования (Г.М. Абилова и др., 1993, М. De Fratos е.а., 1992).
Иммуногенетический метод исследования
Материалом для исследований групп крови овец служили образцы крови 70 овцематок в каждой породе. Исследование по изучению состава крови проводились в период 2003-2004 гг. При этом использовали моноспецифические реагенты, изготовленные в лаборатории иммуногенетики Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства;
Кровь бралась из яремной вены в хорошо закрывающиеся пробками пробирки и в течение суток доставлялась в лабораторию Калмыцкого племенного объединения;
В целях предотвращения свертывания крови; заранее вносился консервант из расчета 1:4 или 1:5 объема крови; После добавления крови содержимое пробирок тщательно перемешивали.
Каждая проба крови имела этикетку с характеристикой животного. Из крови, поступившей в лабораторию, готовили 8 - 10 мл 2,5 %-ной суспензии эритроцитов. Для этого надосадочный слой? жидкости удаляли, а осадок эритроцитов переносили в чистую центрифужную пробирку и центрифугировали три раза по 5 минут при 3000 об/мин. После этого мерной пипеткой в сухую чистую пробирку брали 0,25 мл осадка эритроцитов каждого животного и добавляли 9,75 мл физраствора. Полученная суспензия использовалась для постановки серологических реакций (М.В. Егоров и др., 2003, В;Е. Жегай, 1999, КС. Марзанов, 1983, 1991, Л.Н. Чижова и др. 1999).
Одновременно с приготовлением суспензии эритроцитов, приводили в рабочее состояние реагёнтьг - моноспецйфические сыворотки. Антигенные факторы групп крови овец, за исключением Da-антигена, определяли гемолитическим тестом; по A.Neimann-Sorensen (1957) с некоторыми модификациями (Л.Н; Чижова, 1999). В лунки пластмассовых блоков из специального оргстекла вносили одну каплю 2,5 % суспензии эритроцитов и одну каплю комплемента. При исследовании групп крови овец в качестве комплемента использовали натуральную кроличью.сыворотку с добавлением сухого комплемента морской свинки в соотношении 1:10. Смесь встряхивали и помещали в термостат при температуре 32 ± 2 С. Читка реакций проводилась трижды: через 30 мин, 2 и 4 ч с момента внесения комплемента.
Степень гемолиза определяли по 4-бальной системе: 4 - все эритроциты гемолизированы, жидкость равномерно окрашенная, прозрачная, никаких следов эритроцитов; 3 - на дне видны следы эритроцитов, образуется легкое помутнение при взбалтывании; 2 - 1/2 часть эритроцитов на дне лунки, жидкость над осадком умеренно окрашена; 1 - около 3/4 частей эритроцитов на дне лунки, жидкость над осадком слабого красного цвета. Для выявления агглютинации использовали следующую методику: две капли соответствующей сыворотки и одну каплю 2,5 % суспензии эритроцитов вносили в лунки пластин и после встряхивания помещают в термостат при 32 ±2 С. Читка проводилась 2 раза - через 30 мин и 2 часа с момента постановки реакции. Степень агглютинации определяли следующим образом: + - наличие реакции; в лунке образуются хорошо видимые конгломераты склеенных эритроцитов; ± - наличие небольшого количества малых конгломератов склеенных эритроцитов на дне лунки; - - отсутствие реакции. При постановке обеих реакций проводили контроль. Обычно для реакции гемолиза ставили 2 контроля: на качество эритроцитов и комплемент (первый - 3 капли физиологического раствора плюс одна капля 2,5% суспензии эритроцитов, второй - две капли физиологического раствора плюс одна капля комплемента, плюс одна капля 2,5 % суспензии эритроцитов). При полностью абсорбированном комплементе или гемолизных эритроцитах наблюдается неспецифическая реакция. Контроль обязателен также и для реакции агглютинации, где вместо двух капель сыворотки брали две капли физиологического раствора.
Модифицированная техника реакции гемолиза и агглютинации: каплю 1 % суспензии эритроцитов и каплю реагента смешивали и оставляли при комнатной температуре на 30 минут, затем добавляли каплю комплемента. Инкубировали в течение 3 ч при 35 при этом исследуемые образцы трижды встряхивали. При агглютинации - каплю 2,5% суспензии эритроцитов добавляли в каплю соответствующего реагента и инкубировали в течение 1 ч, центрифугировали 30 с при 400g, затем надосадочную жидкость сливали. Ингибиционный тест применяли для определения растворимых антигенов R и О. Для определения растворимых антигенов в лунки пластин вносили по одной капле разведенной 1:1 или более плазмы, затем добавляют две капли специфической антисыворотки, смесь встряхивали и оставляли на полчаса при комнатной температуре. После этого добавляли одну каплю 2,5 % суспензии эритроцитов и одну каплю комплемента. Если в плазме присутствовал растворимый антиген, гемологическая реакция была отрицательной, в обратном случае - положительной. Результаты гемолитических реакций записывали в протокол. Присутствие того или иного антигена фиксировали по степени проявления реакции гемолиза или агглютинации цифрой от 4 до 0 (табл. 2).
Группы крови овец, разводимых в Калмыкии: их сходство и различия
Основная область использования групп крови - селекционная работа, поиск и создание уникальных генофондов, поскольку изменчивость есть реальное отражение формообразовательных процессов, протекающих в популяциях.
Особенно важным с прикладной точки зрения является использование групп крови для паспортизации животного, так как успех селекционной работы во многом зависит от правильной идентификации.
Наиболее широкое использование группы крови получили при контроле племзаписей происхождения потомков, а, следовательно, и для объективной оценки баранов-производителей. Развитие иммуногенетики сельскохозяйственных животных создало возможности для сравнения и выявления специфических особенностей генетической структуры групп животных разных пород одного вида, в пределах одной породы из различных регионов и, кроме этого, позволяет изучить изменчивость структуры при разных условиях отбора.
Следующее направление - использование связи между некоторыми группами крови и хозяйственно-полезными признаками. Исследованиями ряда ученых установлено, что в зависимости от группы крови меняется перенос калия, цистеина и других биохимических веществ, что влияет на
продуктивность и приспособительные особенности овец (В.В. Абонеев, 2004).
При сравнении групп крови овец Калмыкии отмечены определенные различия. Во-первых, имеются различия в частоте встречаемости антигенов (табл. 15, рис. 3).
Наименьшее по концентрации - у овец породы советский меринос (42,5 %) и эдильбаевских (59,2 %), у овец каракульской породы такой антиген встречался в 65,7 % случаев. Четкая межпородная разница в частоте антигена Ма системы М, отмечена между овцами каракульской и мериносовых пород. Так, у овец ставропольской и грозненской пород частота антигена Ма составила 6,0 % и 7,0 %, а у каракульской - 50,0%.
Самой низкой частотой встречаемости характеризуются антигены Са, АЬ и Be. При этом, овцы грозненской породы не имели АЬ и Са, овцы ставропольской породы не имели Са, а эдильбаевской - Be. Низкий показатель факторов АЬ и Са у овец эдильбаевской породы, АЬ и Be у ставропольских, каракульских и грозненских овец.
Частота встречаемости антигенов имеет различия между породами. Так, антиген Са, имеющийся у 31,1 % овец породы советский меринос, практически отсутствует у остальных овец.
Овцы эдильбаевской и советский меринос пород имеют частоту антигена Аа более, чем в два раза превосходящую каракульскую породу. Советский меринос также значительно отличается от других пород по частоте встречаемости антигенов Ab, Bb, Be, Са, R и Da, только антигены СЬ и О системы R имеют более низкую частоту встречаемости, чем у других пород.
У каракульской породы частота антигена Ма составляет - 50,0 %. Наименьшая разница по частоте этого антигена была между каракульской и эдильбаевской породами (10,9%). Это согласуется с данными других авторов, которые нашли, что Ма чаще встречается у овец грубошерстных пород.
Da антиген системы D значительно реже встречался у ставропольских и грозненских овец (17,9 % и 17,5 %), тогда как у советского мериноса его частота составила 95,0 %, а у овец каракульской породы - 62,9 %. У овцы эдильбаевской породы частота антигена Da составила 23,2%.
Если сравнивать грубошерстные и тонкорунные породы овец, то прослеживается общая тенденция только по частоте встречаемости фактора Ма, которая составляет 39,1 % у эдильбаевской и 50,0 % - у каракульской, что выше, чем у мериносовых. Обе грубошерстные породы в сравнении с мериносами, имеют более низкие показатели встречаемости антигена СЬ, исключение составляет порода советский меринос.
Овцы эдильбаевской породы имели низкую - частоту встречаемости антигена АЬ, а грозненские данный антиген не имели.
При изучении групп крови большое значение имеет соотношение гомозигот и гетерозигот и характеристика аллелофонда. Бернштеин выдвинул объяснение механизма взаимодействия трех аллелей, представляющих четыре различных фенотипа (групп крови). Он несколько усложнил графическое представление закона Кастла-Харди-Вайнберга (Е.Д. Свердлов 1999, Н.А. Плохинский 1970, В.Е. Никитченко и др. 1999, В.А. Мороз и др. 1985,1995).
В нашем примере: количество овец ставропольской породы имеющих Аа антиген - 20, АЬ - 6, не имеющих ни того, ни другого - 108. Разделив основании равностороннего треугольника на три отрезка в отношении р: г: q (20:108:6).
Через точки деления проведем две прямые, каждая из которых параллельна одной из сторон треугольника, таким образом, треугольник разделится на четыре части, их площади пропорциональна частотам групп имеющих Аа, имеющих АЬ, имеющих Aab и не имеющих ни одного из них. Точку пересечения двух прямых отмеченную на диаграмме можно рассматривать как популяционную точку для частного случая трех аллелей; длины перпендикуляров, опущенных из этой точки на три стороны треугольника, пропорциональны р: q: г. Разделив части треугольника на области, соответствующие «гомозиготным» и «гетерозиготным» долям, получим диаграмму, на которой графически представлены частоты 6 разных генотипов.
На этой диаграмме каждый равносторонний треугольник соответствует квадратичному члену (например, р ), а каждый параллелограмм - члену произведению (2pq) (рис. 4).
