Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Общая характеристика микотоксинов и ареал их распространения .11
2.2. Микотоксикозы сельскохозяйственных животных, механизм действия мико токсинов .14
2.3. Методы обезвреживания кормов от микотоксинов .17
3. Основное содержание работы 32
3.1. Материал и методы исследования .32
4. Результаты собственных исследований 38
4.1. Определение безвредности карбитокса на лабораторных животных 38
4.2. Определение переносимости карбитокса на цыплятах-бройлерах 46
4.3. Сорбционные свойства карбитокса 51
4.4. Эффективность использования карбитокса при экспериментальных микоток-сикозах цыплят-бройлеров .55
4.5. Эффективность применения карбитокса сельскохозяйственной птице и определение экономической эффективности его использования
4.5.1. Влияние карбитокса на приросты, сохранность, конверсию корма 66
4.5.2. Влияние карбитокса на показатели крови и содержание витаминов в пече -ни 70
4.5.3. Влияние карбитокса на показатели естественной резистентности организма птицы 76
4.5.4. Физико-химический показатели мяса цыплят-бройлеров .77
4.5.5. Производственные испытания карбитокса 79
5.Обсуждение результатов 82
Заключение 88
Список использованной литературы
- Микотоксикозы сельскохозяйственных животных, механизм действия мико токсинов
- Методы обезвреживания кормов от микотоксинов
- Определение переносимости карбитокса на цыплятах-бройлерах
- Влияние карбитокса на показатели крови и содержание витаминов в пече
Микотоксикозы сельскохозяйственных животных, механизм действия мико токсинов
В настоящее время установлено более 300 видов микотоксинов, которые оказывают отрицательное влияние организм человека и животных (Barret, J. A. A guide to idebtifying and classifying yeasts / J. A. Barr et, R. W. Payne, D. Yarrow. -Cambridge : Cambridge .Press., 1992. – P. 32-35).
Однако, количество известных в настоящее время микотоксинов, которые могут принести ощутимый вред состоянию здоровья животных достаточно ограничено, т.к. несмотря на то, что многие метаболиты грибов потенциально токсичны, только некоторые из них способны влиять на организм животных в производственных условиях. Тем не менее результаты опытов на лабораторных животных, а также исследования in vitro подтверждают возможность негативного влияния микотоксинов на иммунную функцию (Bondy, G.S., Pestka. 2000. Immu-no-modulation by fungal toxins. Toxicol. Environ. Health (Part B) 3:109-143), они также способны снижать продуктивность сельскохозяйственных животных (Bail-ly, D., G. Benard, .Y. jouglar, S. Durand and P. Guerre. 2001. Toxicity of Fusarium monili-formeculture material containing known levels of fumonisin Bj in ducks. Toxi-col. 163:11-22).
В литературных источниках представлена информация по токсическому влиянию микотоксинов на организм с описанием клинических проявлений болезни (Fitzpatrick, D.W., C.A. Picken, L.C. Murphy and M.M. Buhr. 1989. Measurement of the relative binding affinity of zearalenone, alpha-zearalenol and betazearalenol for uterine and oviduct oestrogen receptors in swine, rats and chickens: An indicator of oesro-genic potencies. Сотр. Biochem. Physiol. (C) 94:691-694; Папазян Т. В борьбе с микотоксикозами побеждает микосорб /Т.Папазян // Животноводство России. – 2002. – №4. – С. 17; Егоров И. Микосорб снижает токсичность корма./ И. Егоров, Н. Чеснокова Д., Давтян // Птицеводство – 2004. – №3. – С.29-30).
На первой конференции ФАО/ВОЗ по программе защиты окружающей среды ООН (UNEP) в 1977 был представлен отчет из различных источниках по распространению микотоксинов в по всему миру. При этом, только семь микотокси 11 нов были упомянуты как часто встречающиеся в продовольствии и кормах, а именно: афлатоксины, охратоксин А, патулин, зеараленон, трихотецены, цитри-нин и пеницилловая кислота (Jelinek, C.F., A.E. Pohland, and G.E. Wood. 1989. Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds - an update. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72:223-230).
Распространённость микотоксинов в природе рассматривается как глобальная проблема. Однако в отдельных регионах мира некоторые микотоксины могут встречаться чаще, чем другие. Так, в странах с прохладным климатом, таких как Канада, север США и большинство стран Европы, афлатоксины не рассматриваются как большая проблема, за исключением импортируемого сырья, выращенного в теплом южном климате. С экономической точки зрения в этих регионах наиболее важными микотоксинами являются деоксиниваленол (вомитоксин, DON), зеараленон (ZEA), охратоксин А (ОТА), диацетоксисцирпенол (DAS), Т-2 токсин и НТ-2 токсин. При этом в Канаде, ЮАР, Тайване, Великобритании и США загрязнение кукурузы и продуктов ее переработки ДОНом составляло более 1 мг/кг (Devegowda, G., et al., Mycotoxin picture worldwide: Novel solutions for their counteraction. Feed Compounder 1998a. – 18(6)Р.22-27.)
Различия климатических условий в северной, центральной и южной частях Европы способствуют развитию различных видов грибов. Соответственно, в разных регионах за последние двадцать лет наибольшее внимание привлекли разные микотоксины (Leibetseder, j. 1995. The European perspe on mycotoxins. In: Biotechnology in the Industry: Proceedings of Alltech s 11th Aral Symposium (T.R Lyons and K.A. Jacques eds). Nottingham University Press, UK, po 65-74.
Так, в южной и центральной Европе (Австрия и Венгрия) где преобладает выращивание кукурузы, наибольшее внимание уделяется фузариотоксинам (DON, ZEA, Т-2 токсин), под действием которых снижается продуктивность животных и птицы, в то время как ОТА является особенно важным для северной части Европы (Дания и Польша). Исследования, проведенные в Германии, продемонстрировали, что 8,4% из 1000 проверенных образцов корма содержат трихотецены. Пятнадцать образцов зерна из 966 содержали ZEA (Gedek, B. 1998. Pilzifte lauern in Futtergetxeide. Tier-zuchter 40:26-28. Girish, C.K. and G.)
В исследованиях 1431 образцов пшеницы, ячменя, ржи, овса и отрубей, проведенных в Дании в 40% случаев были обнаружены ОТА. Причём отруби были больше всего обсеменены ОТА, чем зерно (40 и 62% соответственно, Ноhler, D. 1999. A brief survey on important mycotoxins and possible detoxification methods. World Poult. Misset 15(11):13-15.).
Такое соотношение является типичным для большинства микотоксинов: как правило, побочные продукты переработки зерна, особенно отруби, содержат более высокие уровни микотоксинов, чем целое зерно.
Афлатоксины – наиболее распространенные микотоксины – являются типичными для жарких и влажных климатических условий, как, например, в странах Латинской Америки, Азии и Африке, южных регионах США и некоторых частях Австралии. Афлатоксины встречаются примерно в 20% образцов кукурузы, выращенной на юге США даже не в кризисные годы; а в годы с экстремальными погодными условиями это значение может быть выше.
Многочисленные исследования, проведенные в Индии, Пакистане, Египте и ЮАР показали, что афлатоксины в значительных концентрациях часто присутствуют в готовых комбикормах и сырьевых компонентах. В южных частях Индии, где почти весь год стоит жаркая и влажная погода, сырьё и готовые комбикорма часто содержат афлатоксин, ОТА и Т-2 токсин (Chandrasekaran, D. 1996. Survey on the presence of T-2 toxin and ochratoxin in feed/ingredients in Namakkal area. In: Proc. 20th World s Poultry Congress 4:268, New Delhi, India. Однако во время зимнего сезона высокая влажность может привести к появлению других микотоксинов, таких как ZEA, DON, Т-2 токсин, ОТА и т.д.
Методы обезвреживания кормов от микотоксинов
Работа выполнялась в 2011-2014 гг. на базе Белгородской государственной сельскохозяйственной академии и Белгородской межобластной ветеринарной лаборатории. Производственные опыты проводились в хозяйствах Белгородской области.
Объектом исследования служил препарат карбитокс, который представляет собой сыпучую порошкообразную массу серого цвета и содержит в своём составе бентонитовую глину (15 %), цеолит (20 %), гидратную форму двуокиси кремния (10 %), карбонат кальция (40 %), пробиотический комплекс (15%).
Органическая часть карбитокса представлена комплексом сложных органо-полимеров и мобилизованных пробиотических бацилл четырех видов, группы молочнокислых бактерий и продуктов их жизнедеятельности.
Препарат выпускает ООО «Агроакадемия» г. Шебекино Белгородской обл. В производственных условиях фармакологическую эффективность карби-токса сравнивали с токсфином, который предназначен для адсорбции афлаток-сина B1 и других микотоксинов в кормах сельскохозяйственных животных и птицы. Токсфин сухой содержит в своём составе: связывающие вещества – бентонит-монтмориллонит (50,6-60,6 %), сепиолит (40,4-48,4 %).
В экспериментальной части работы было использовано 48 белых крыс, 16 кроликов, 20 морских свинок, 80 цыплят-бройлеров; в клинических и научно-производственных испытаниях – 46000 цыплят.
Токсикологическое исследования карбитокса проводили в соответствии с действующими ГОСТами и руководствами (Саноцкий И. В. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических веществ. – М.: Медицина, 1975. – 328 с; ГОСТ 12.1.007-76).
Острую токсичность препарата по методу Г. Кербера (1931) на белых крыс ах. Препарат применяли внутрижелудочно однократно в дозе 25,0 г/кг массы тела. Перед введением карбитокс разводили в физиологическом растворе или ди 33 стиллированной воде и в течение 14 суток наблюдали за животными Крысам контрольной группе вводили дистиллированную воду в тех же объёмах.
Токсичность препарата оценивали по количеству павших животных и результатам патологоанатомического вскрытия, наблюдали за клиническим состоянием крыс.
Местнораздражающее действие карбитокса изучали на кроликах. В конъ-юнктивальный мешок вводили разные разведения препарата: 1:10 и 1:100. В течение 6 часов вели наблюдение за состоянием конъюнктивы. Интактный глаз противоположной стороны животного служил контролем.
На морских свинках методом накожных аппликаций определяли аллергизи-рующее действие препарата. При этом определяли массу и температуру тела животных, исследовали морфологический и биохимический состав крови, ставили реакцию специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) в цитратной крови по Флексу. Положительной считали пробу, в которой агломерация (склеивание) лейкоцитов превышала контрольные данные не менее чем на 30%.
Изучение хронической токсичности карбитокса проводили на белых крысах. В течение трёх месяцев препарата скармливали животным в условно-терапевтической дозе, в два и пять раз её превышающей.
Наблюдение за животными проводили в течение всего экспериментального периода, при этом учитывали потребление воды и корма, общее состояние животных, проводили их взвешивание. В конце опыта животных убивали и проводили макроскопическое исследование внутренних органов.
Влияние карбитокса на детоксицирующую функцию печени изучали на модели гексеналового сна. Гексенал вводили внутрибрюшинно в десятикратной условно-терапевтической дозе и дозе 80 мг/кг массы тела в форме 1%-го раствора, при этом регистрировали продолжительность гексеналового сна, которую в контрольной группе принимали за 100%. Переносимость карбитокса определяли на цыплятах-бройлерах. Препарат скармливали птице в дозе 0,1, 0,2 и 0,5 г/кг массы тела (условно-терапевтическая, двух- и пятикратная доза от условно терапевтической) в течение 30 суток..
При этом учитывали приросты птицы, морфологичекий и биохимический состав крови, естественную резистентность организма. Все опыты имели по вторности и завершались производственной проверкой.
Определение сорбционной способности карбитокса проводили методом in vitro. Практический коэффициент полезного действия саорбента определяли по разности между абсорбцией (всасыванием) и десорбцией. Чем выше этот коэффициент (Net Efficiency), тем эффективнее адсорбция – тем большее количество связанных микотоксинов.
Иммуноферментный анализ проводили в соответствии с методическими указаниями (Методические указания по экспресс-определению микотоксинов в зерне, кормах и компонентов для их производству, утвержденное Министерством сельского хозяйства Российской Федерации 10.10.2005 № 5-114/1001) и ГОСТом Р 52471-2005 «Иммуноферментный метод определения микотоксинов» (2005) со стандартными тест-системами. Микологические исследования проводили в соответствии с методическими указаниями (Методические указания по выделению и количественному учету микроскопических грибов в кормах, кормовых добавках в сырье для производства кормов, утвержденное Министерством сельского хозяйства Российской Федерации 14.07.03г. № 13-5-02/0827). Отбор средних проб кормов и сырья для их производства осуществляли по ГОСТу 28495-90 «Продукция микробиологическая. Правила приёмки и методы отбора проб» (1990).
Определение переносимости карбитокса на цыплятах-бройлерах
Из данных рисунка видно, что у крыс опытных продолжительность гексе-налового не имела достоверных различий с контрольной. Таким образом, карби-токс не оказывал отрицательного влияния на детоксицирующую функцию печени, так как он не ускорял и не задерживал окисление гексенала, которое, по общепризнанным представлениям, совершается в печени.
В конце экспериментального периода проводили декапитацию животных под эфирным наркозом и изучали макроскопические изменения внутренних органов.
Проведённые исследования показали, после применения карбитокса масса внутренних органов крыс, не выходила за пределы физиологической нормы и ничем не отличалась от данных контрольной группы. Так же не были выявлены изменения в топографии внутренних органов Местнораздражающее действие карбитокса изучали на кроликах. В конъюнктивальный мешок животных опытных вводили карбитокс в разведениях 1:10 и 1:100. В течение 6 часов вели наблюдение за состоянием конъюнктивы. Интактный глаз противоположной стороны животного служил контролем. Осмотр глаз проводили через 6 ч и через сутки. При этом изменений со стороны конъюнктивы и просвета зрачка обнаружено не было. Следовательно, карбитокс не обладает местнораздражающим действием.
При изучении аллергизирующего действия карбитокса было отобрано две группы морских свинок по 7 голов в каждой. При помощи накожных аппликаций на депиллированные участки кожи наносили 0,1 мл карбитокса в разведении 1:10 и 1:100. Через 21 сутки на интактный участок противоположной стороны наносили карбитокс в разрешающей дозе.
В ходе проведения эксперимента измеряли температуру тела (рис. 9), определяли живую массу, учитывали изменения кожного покрова, изучали гематологические показатели, ставили реакцию специфической агломерации лейкоцитов.
Установлено, что при нанесении на кожу всех разведений карбитокса не отмечено её покраснения и все вышеперечисленные показатели находились в пределах физиологической нормы. Из данных рисунка видно, что температура тела морских свинок оставалась в стабильных пределах. Причём показатели контрольной группы не имели статистического различия с контроем.
Из представленных в таблице данных видно, что колебания процента агломерирующих лейкоцитов на фоне применения карбитокса были в пределах 18,2-19,0. Изменения показателя агломерации в опытных группах статистически не подтвердилось с контролем. Как известно, положительной РСАЛ считаются случаи увеличения процента склеившихся лейкоцитов за 1 ч после применения разрешающей дозы на 1/3 и более по сравнению с состоянием до применения этой дозы препарата.
Проведённые исследования показали, что карбитокс не вызывает аллергических изменений.
Таким образом, что карбитокс не оказывает отрицательного действия на организм лабораторных животных, что позволяет начать эксперимены по выявлению его действия на сельскохозяйственную птицу. 4.2. Определение переносимости карбитокса на цыплятах-бройлерах
Для проведения эксперимента было отобрано 4 группы цыплят-бройлеров 15-суточного возраста по 20 голов в каждой (1 – контрольная, 2,3 и 4 – опытные). Опытным группам в корм добавляли карбитокс в условно-терапевтической дозе, а также в два и пять раз её превышающей (0,1; 0,2 и 0,5 г/кг массы тела). Препарат применяли в течение в течение 20 суток (табл. 3).
В конце экспериментального периода в опытных группах вырос уровень белка и снизилась активность ферментов переаминирования, однако ни в одном из случаев разница с контролем так же не подтвердилась статистически.
Таким образом, проведённые исследования показали, что карбитокс в изучаемых дозах не вызывает значительных отклонений в естественном ходе метаболических процессов у птицы.
После окончания опыта из каждой группы отбирали по 6 голов птицы и проводили их убой с последующей макроскопией внутренних органов.
Осмотр перьевого и кожного покрова птицы, а также её внутренних органов не выявил каких либо патологических изменений.
Таким образом, в результате проведённых исследований установлено, что карбитокс является малотоксичным препаратом. Тридцатисуточное его применение в условно-терапевтической дозе и в дозах в 2 и 5 раз её превышающих, не оказывает отрицательного влияния на функцию жизненно важных органов и систем птицы, физиологические и биохимические показатели крови и не вызывает изменений структуры внутренних органов.
Для определения сорбционной способности карбитокса методом «in vitro» были отобраны следующие микотоксины: Т-2-микотоксин, охратоксин А, афла-токсин В1, 4-дезоксиниваленол (ДОН) и зеараленон, полученные в лабораторных условиях путём направленной контаминации в асептических условиях зернового сырья токсигенными штаммами плесневых грибов родов Aspergillus ochraceus, Penicillium viridicatum, Fusarium graminearum и F. poae с последующей их экстракцией, идентификацией, химической чисткой экстрактов от органических примесей и концентрации искомых ксенобиотиков на ротационном испарителе типа «RVO-64» по авторской методике с эффективностью очистки не менее 95 %.
При помощи дозатора в каждую опытную пробу добавляли по 50 мл испытуемого рабочего раствора микотоксина, в контрольную – 50 мл цитратного буфера. Затем пробирки помещали на орбитальный встряхиватель или в шейкер-инкубатор на 1,5 часа при температуре 41-42 оС.
Влияние карбитокса на показатели крови и содержание витаминов в пече
В настоящее время известно около десяти тысяч метаболитов грибов, однако количество токсинов, которые являются причиной заболеваний человека и животных, ограничивается несколькими сотнями (Baudrimont, I., B. Sostaric, C. Yenot, A.M. Bet-beder, S. Dano-Djedje, A. Sanni, P.S. Steyn and E.E Creppy. 2001. Aspartame prevents the karyomegaly induced by ochratoxin A in rat kidney. Arch. Tox-icol. 75:176-183).
Несмотря на то, что многие метаболиты грибов потенциально токсичны, только некоторые из них способны негативно влиять на организм животных в условиях производства. Тем не менее результаты опытов на лабораторных животных, а также исследования «in vitro» подтверждают возможность негативного влияния микотоксинов на иммунную функцию (Bondy и Pestka, 2000), а также снижения продуктивности сельскохозяйственных животных .
Существует несколько подходов к контролю или борьбе с проблемой мико-токсинов. Наиболее доступные из которых, основаны на предотвращении формирования микотоксинов в кормах при помощи различных технологических программ, направленных на оптимальное хранение кормов при низкой влажности и предотвращение обсеменения зерна при переработке (Barraud, L, T. Douki, S. Guerret, M. Chevallier, C. jamard, C. Trepo, CP. Wild, Cadet and L. Cova. 2001. The role of duckhepatitis В virus and aflatoxin Bj in the induction of oxidative stress in the liver. Cancer Det. Prev. 25:192-201).
Не менее важным способом борьбы с микотоксикозами сельскохозяйственных животных является разработка сорбентов, активно поглощающих микоток-сины при попадании их в комбикорма.
Однако несмотря на большое количество препаратов, используемых для борьбы с микотоксинами, их применение не даёт желаемого результата. Поэтому, Российская компания «Агроакадемия» разработала новый комплексный энте 83
росорбент карбитокс с пробиотическим действием. В состав препарата входят минеральные добавки и фитосорбенты, пробиотики и биологически активные вещества. Карбитокс применяется для предотвращения негативных изменений у сельскохозяйственных животных при скармливании кормов загрязнённых мико-токсинами.
Основная цель настоящей работы состояла в изучении возможности использования карбитокса в качестве сорбента для лечения и профилактики микотокси-козов сельскохозяйственной птицы.
В соответствии с поставленной целью мы изучили безвредность карбитокса на лабораторных животных и цыплятах-бройлерах, определили сорбционные свойств карбитокса (методом in vitro) для Т-2-микотоксина, охратоксина А, афла-токсин В1, 4-дезоксиниваленола и зеараленона, установили фармакологические свойства карбитокса при экспериментальных микотоксикозах цыплят-бройлеров и сравнили его действие с токсфином. На основании проведённых исследований обосновали эффективность использования карбитокса в качестве сорбента для профилактики и лечения микотоксикозов сельскохозяйственной птицы, провели ветеринарно-санитарную экспертизу и оценили качество птицеводческой продукции, экономически обосновали использование карбитокса в птицеводстве.
В результате проведённых исследований установлено, что карбитокс по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007-76 можно отнести к веществам 4класса – малоопасным. При изучении переносимости карбитокса на цыплятах-бройлерах установ лено, что препарат при его длительном (в течение 30 суток) применении в условно-терапевтической дозе и в дозах в 2 и 5 раз её превышающих, не оказы вает отрицательного влияния на функцию жизненно важных органов и систем птицы, физиологические и биохимические показатели крови и не вызывает изме нений структуры внутренних органов. На основании чего мы не нашли ограниче ний использования его сельскохозяйственной птице. На следующем этапе мы определяли сорбционную способность карбитокса (методом in vitro), в результате чего установлено, что сорбционные свойства кар 84 битокса более эффективными оказались для афлатоксина, а практический коэффициент полезного действия для карбитокса составил 57,6%.
Для экспериментального микотоксикоза цыплят-бройлеров использовали «рабочие» дозы токсиканта (ниже МДД или LD50, но выше ПДК). Как правило, эти дозы достаточно высокие (в нашем случае они в сумме составили 10,7 ПДК). Для этого в комбикорм цыплят контрольной и опытных групп вводили кормосме-си с микотокстинами в виде фунгальной биомассы на основе зерна кукурузы: охратоксин А – 0,17 мг/кг (3,4 ПДК), Т-2-микотоксин – 0,40 мг/кг (4,0 ПДК) и зе-араленон – 6,6 мг/кг (3,3 ПДК).
На фоне выраженного микотоксикоза цыплятам скармливали разные дозы карбитокса и токсфин.
В результате проведённых исследований установлено, что, на фоне экспериментального микотоксикоза карбитокс, введённый в обсеменённые микотоксина-ми комбикорма для бройлеров из расчёта 2-3 кг/т, является не только действенным стимулятором роста птицы, но и препаратом, оказывающим прямое антитоксическое действие на растущий организм цыплят без выраженных негативных последствий на зоотехнические показатели выращивания птицы. При этом от максимальной дозы препарата произошло увеличение массы птицы (на 9,2% по сравнению с контролем). Эффективность действия токсфина была менее выражена при одинаковых дозах ввода в рационы птицы.
На следующем этапе мы изучили действие карбитокса на организм цыплят-бройлеров и сравнили его действие с токсфином. Препарат применяли до конца выращивания птицы.
Результаты исследования показали, что сохранность поголовья в контрольной и опытных группах, получавших карбитокс и токсфин находилась на достаточно высоком уровне (92,5-97,5 %). Средняя масса птицы в конце экспериментального периода незначительно отличалась от контрольных показателей, что также свидетельствует об отсутствии отрицательного влияния карбитокса на организм птицы.
